用于治疗或增强肌肉组织的方法与流程

本申请要求南非临时专利申请号2014/01988的优先权，其以引用方式结合于本文。

技术领域

本发明涉及腺牧豆(Prosopis glandulosa)用于治疗和增强肌肉组织的用途。

背景技术：

依据积累的科学证据，显然的是，在草药物质(herbal substance)中存在的植物化学品(phyto-chemical)对长期人体健康具有有益效果并且可以用来有效治疗各种疾病。

许多研究已表明，抗氧化剂(如在草药制剂中发现的)，可以导致在耐力锻炼中的延长性能(通过减少氧化应激(oxidative stress)[Zheng et al.,2012；Chen et al.,201 1；Bucci,2000]，以及有助于肌肉再生过程，从而导致在肌肉损伤以后的加速肌肉恢复)。高丽参(Korean ginseng)是显示出增强锻炼和运动性能的草药制剂的一个实例[Chen et al.,201 1；Bucci,2000；Wang et al.,2010]，以及例如，葡萄籽衍生的多酚，最近被描述为提供加速骨骼肌恢复[Myburgh et al.,2012；Kruger et al.,2014]。

然而，许多草药(herbal remedy)增强锻炼和运动性能或减少炎症(作为损伤的结果)的能力是基于坊间说法并且缺乏科学证据。因此，作为结果，当服用未研究的市售草药补充剂(herbal supplement)时，许多人经历不愉快或不期望的副作用，这是由于不正确的剂量以及与其它处方药的相互作用。此外，还已知合成药物用于增强运动性能或恢复。然而，在竞技体育中，这些药物中的许多药物(如非甾体抗炎药)是不允许的。

附图说明

图1示出在实验性挫伤以后随着时间的推移，通过H&E染色的超微结构变化(ultrastructural change)。图(A)示出未受损样品，图(B-D)示出在损伤后3小时(B)、1天(C)和7天(D)取自PLA动物的的样品；图(E-G)、(H-J)和(K-M)分别示出在PG-CHR、PG-AI和NSAID组中的类似的时间点。比例尺(scale bar)是100μm；图(B)、(E)、(H)和(K)示出肌纤维破坏和血管破坏；自损伤后1天(图(C)、(F)、(I)和(L))，免疫细胞渗入(infiltration)受伤部位是可见的。实心白色箭头指示红细胞，实心黑色箭头指向新再生的肌纤维以及虚线箭头指示免疫细胞。

图2示出在挫伤以后，在具有/没有腺牧豆治疗的情况下，中性粒细胞(neutrophil)(His48染色)渗入受伤部位。数据表示为平均值±SEM。通过双向ANOVA(two-way ANOVA)来进行分析。n＝5/时间点/组；实线表示随着时间的推移的差异以及黑虚线表示在特定时间点时的组差异；显著性：所有组：***p<0.0001未受损伤的相对于1天；1小时相对于1天；3小时相对于1天；1天相对于7天。1天：***p<0.0001PLA相对于PG-CHR；PLA相对于NSAID；**p<0.05PLA相对于PG-AI。

图3示出在挫伤以后，在具有/没有腺牧豆治疗的情况下，巨噬细胞渗入受伤部位。数据表示为平均值±SEM。通过双向ANOVA进行分析。n＝5/时间点/组；实线表示随着时间的差异；显著性：所有组：**p<0.001未受损伤的相对于1天；1小时相对于1天；3小时相对于1天；7天相对于1天。

图4示出在挫伤以后在骨骼肌中的ADAM₁₂表达。(A)代表性的蛋白质印迹。顶部4带表示ADAM₁₂表达以及底部带表示β-微管蛋白表达(证实蛋白质的等量加载)；(B)针对所有不同组的合并数据；(C)在每个实验组中，在不同时间点之间观测到的统计差异。相对于未受损伤的值来表示这些值。数据表示为平均值±SEM；通过双向ANOVA进行分析；n＝5/时间点/组；实线表示随着时间的差异以及黑虚线表示在特定时间点的组差异；显著性：***p<0.0001，**p<0.001以及*p<0.05。

图5示出在挫伤以后在骨骼肌中的结蛋白(desmin)表达。数据表示为平均值±SEM；通过双向ANOVA进行分析；n＝5/时间点/组；黑色实线(PLA)表示随着时间的差异，蓝色实线(PG-CHR)、红色实线(PG-AI)和黑虚线表示在特定时间点的组差异；显著性：***p<0.0001，**p<0.001以及*p<0.05。

图6示出在对照和腺牧豆治疗的大鼠中大鼠比目鱼肌(soleus muscle)的力-频率关系特征。(A)示出在不同频率下由比目鱼肌产生的比力(specific force)以及(B)示出当相对于产生的最大力表示时在每个频率下产生的力。在增加的脉冲频率下，通过简短、反复刺激产生力-频率曲线。使用这种方案对于每个肌肉所实现的最大力被认为是F_max。数据表示为平均值±SEM。通过双向ANOVA进行分析。n＝10；**p<0.001PLA相对于PG(10Hz至100Hz)。

图7示出在对照和腺牧豆治疗的大鼠中比目鱼肌的疲劳特性。(A)示出由比目鱼肌产生的比力以及(B)示出力，其表示为产生的初始力的％。在间歇收缩的2分钟时间段内，通过在40Hz的频率下(预定为F_max)，刺激肌肉2秒并停止2秒，来确定肌肉疲劳。在疲劳方案期间，以20秒间隔，来测量力。数据表示为平均值±SEM。通过双向ANOVA进行分析。n＝10；**p<0.001t＝0分钟；PG相对于PLA；***p<0.0001t＝0分钟相对于t＝120分钟PLA；PG。

图8示出在疲劳以前以及在疲劳以后5和20分钟的强直性力产生(tetanic force production)。通过在其超最大电压(supra-maximal voltge)下在40Hz的频率下，刺激肌肉来产生强直性收缩(tetanic contraction)。数据表示为平均值±SEM；通过双向ANOVA进行分析；n＝10；*p<0.05PLA相对于PG(疲劳前)；**p<0.001PLA相对于PLA(5分钟相对于20分钟)；PG相对于PG(5分钟相对于20分钟)；***p<0.0001PLA相对于PLA(疲劳前相对于5分钟)；PG相对于PG(疲劳前相对于5分钟)。

技术实现要素：

根据本发明的第一实施方式，提供了用于治疗或增强受试者的肌肉组织的组合物，所述组合物包含来自腺牧豆或其提取物的植物材料。

植物材料可以是来自腺牧豆植物的任何部分，如叶、花、根、茎、树皮、种子等。优选地，植物材料是来自腺牧豆的种子荚(seed pod)，以及甚至更优选地，植物材料是来自已被干燥和研磨的种子荚。

所述组合物可以进一步包含药用赋形剂、粘合剂、佐剂或填料。

所述组合物可以为口服制剂的形式，如以下形式：片剂、舌下片剂、糯米纸囊剂(wafer)、香囊、胶囊、悬液、糖浆、粉末、液体饮料或可食用条(edible bar)。可替换地，所述组合物可以为局部制剂的形式，如悬液、凝胶、乳膏(cream)或软膏(ointment)，其可以施加于肌肉组织的区域中的皮肤。所述组合物还可以为注射制剂的形式。所述组合物还可以为营养或膳食补充剂(supplement)的形式。

待治疗或增强的肌肉组织优选是骨骼肌。

在一种实施方式中，所述组合物是用于预防、最小化或治疗肌肉损伤，如直接冲击伤(direct impact injury)。所述直接冲击伤可以是挫伤(contusion injury)。

在另外的或可替代的实施方式中，所述组合物可以用于增强肌肉力量(muscle strength)。

所述受试者可以是人。

可以旨在以约50至约200mg/kg/天的腺牧豆，如约100mg/kg/天，的每日剂量，将所述组合物给予受试者。

根据本发明的第二实施方式，提供了腺牧豆或其部分或提取物在制造用于治疗或增强受试者的肌肉组织的药物的方法中的用途。

所述药物可以是基本上如上所述的组合物。

根据本发明的第三实施方式，提供了用于治疗或增强受试者的肌肉组织的方法，所述方法包括将来自腺牧豆或其提取物的植物材料给予受试者的步骤。

根据本发明的第四实施方式，提供了用于预防、治疗或最小化受试者的肌肉损伤的方法，所述方法包括将来自腺牧豆或其提取物的植物材料给予受试者的步骤。

根据本发明的第五实施方式，提供了用于增加受试者的肌肉力量的方法，所述方法包括将来自腺牧豆或其提取物的植物材料给予受试者的步骤。

具体实施方式

本文描述了来自腺牧豆(Prosopis glandulosa(Torr.)[Fabaceae])树(俗称牧豆树(Honey mesquite))的植物材料的用途。所述植物材料通常是来自该树的干燥和研磨荚，但还可以来自该树的其它部分，如叶、树皮或根。

由于它们的高蛋白质含量，北美沙漠的西南地区的居民已传统上将腺牧豆的荚用作食品或一般食品补充剂(general food supplement)[Simpson,1977；Zimmermann,1991]。这种植物品种常见于南非的北部和西北部开普(Cape)的干燥、干旱地区[Jurriaanse,1973；Harding,1987]，但由于其侵入性的潜力，按照1983年的农业资源保护法(Conservation of Agricultural Resources Act of 1983)(1983年第43号法案(Act No.43of 1983))，现在分类为第2类入侵者(invader)[Zimmermann,1991]。

对于腺牧豆植物已经进行了很少的研究并且可以寻到的关于其潜在临床益处的仅有的文献是来自申请人自己的关于糖尿病和心血管健康的研究[26,27,George et al.,2011；Huisamen et al.,2012]。申请人不知道关于腺牧豆对在损伤以后的力生成(force generation)、疲劳耐受性或肌肉恢复的影响的任何文献。

申请人现在已经发现，腺牧豆的给予导致肌肉力量的增加并且还有效用于肌肉损伤和炎症的损伤前和/或损伤后治疗。因此，来自腺牧豆的材料可以用于辅助运动能力(aiding sporting ability)，用于膳食或营养补充剂中以增强肌肉功能或性能，作为预防性慢性补充剂来用于预防或最小化肌肉损伤，或作为急性治疗应用，用于在损伤后的治疗或加快恢复。

软组织损伤是很常见的，占所有运动损伤的35％至55％[1]。软组织损伤可以导致显著的疼痛、肿胀和青肿(bruising)，并最终导致受影响肌肉的延迟和受损的功能[2]。肌肉损伤的病理生理学是一个复杂的过程，经历一系列的重叠阶段，其包括纤维性瘢痕组织(fibrotic scar tissue)的退化(degeneration)、发炎、再生和形成[3,4,5,6]。对骨骼肌的损伤不仅伤害肌细胞，而且可能导致毛细血管破裂、浸润性出血(infiltrative bleeding)、发炎、氧化应激和纤维化，其取决于损伤的程度。发炎是这些过程的中心，其中炎性细胞因子主要负责调节细胞环境，从而在很大程度上控制其它修复过程的进展。

最近几年，研究人员已集中于炎症的操作以加速肌肉再生，例如，通过靶向在发炎阶段激活的免疫细胞[7,8]。响应于趋化信号，中性粒细胞和巨噬细胞进入损伤的部位，并吞噬局部碎片[5,9,10]。中性粒细胞，连同巨噬细胞和卫星细胞一起，释放氧自由基，从而导致氧化应激和对未受原发性损伤(primary injury)影响的周围组织的直接损害，其导致继发性肌肉损伤(secondary muscle damage)。然而，即使巨噬细胞的早期表型部分有助于炎症应答的可持续性以及因而有助于继发性损害，但这些细胞还分泌各种生长因子，其直接促进组织修复和再生[5,11]。另外，中性粒细胞和巨噬细胞均刺激T细胞释放细胞因子(IL-1、IL-6、IL-8)和其它趋化因子，其不可避免地导致卫星细胞的招募(recruitment)，因此具有用于肌肉再生的更大能力(capacity)[5,12,13]。因此明显的是，炎症应答，即使是对继发性损害的贡献者，对于在损伤以后骨骼肌的修复是至关重要的。因此，在该总过程被长期严重减弱(blunt)的情况下，如通过非甾体抗炎药(NSAID)治疗，则潜在临床结果可能不是最佳的，从而导致延迟和/或不完全的组织愈合、以及过度瘢痕形成，其会增加损伤复发的风险。有证据表明，借助于前列腺素抑制剂(NSAID)，对环氧化酶-2途径的长期抑制(连续7天以上)会损害肌肉修复[4,14,15]。除使用NSAID之外，还存在各种其它肌肉损伤治疗选项，如RICE方法(休息、冰、加压(compression)和提升(elevation))[4,16,17,18]、治疗性超声波[19,20]、高压氧疗(hyperbaric oxygen therapy)[21]和生长因子的使用[22]。然而，这些疗法仍然不是最佳的，因为在许多情况下它并不转化为增加肌管形成，因此并不增强肌肉愈合[19,20]或可能与严重的风险和副作用相关[23]。

身体疲劳，还被称为外周性疲劳，表示为在长时间活动期间的肌肉性能劣化[Roots et al.,2008；Fitts,1994]。这种力的减小是可逆的，因为在充足休息和适当营养以后可以恢复肌肉性能。

由两个主要因素来确定肌肉力量生成的大小，即，(i)招募以产生力的肌肉的大小和(ii)肌纤维类型[Maughan et al.,1983；Lee et al.,2013]。在收缩期间的力生成与在肌动蛋白和肌球蛋白链之间进行的交联的数目相关[Fitts et al.,1991]。因此，形成的交联越多，则收缩力越强。因此，最大收缩力取决于肌肉含有的纤维的数目。纤维类型也起着重要作用，因为不同类型的肌纤维具有不同的收缩性能[Schaiffino and Reggiani,2011]。已知，由高比例的慢缩(slow-twitch)(I型)纤维组成的肌肉将比具有高比例的快缩(fast-twitch)(II型)纤维的相似尺寸的肌肉相对更弱。响应于体力活动、环境和病理状况的变化来调节纤维组成[Schiaffino et al.,2007]，例如，耐力运动训练诱导快至慢纤维类型转换，从而将肌纤维转化到增加的氧化代谢[Demirel et al.,1999；Pette and Staron,2001；Yuan et al.,2011]。导致纤维类型转变的另外的因素包括机械负载和卸载、激素和衰老[Pette and Staron,2001]。

这项研究的数据表示，腺牧豆治疗可能证明是有益的，作为补充剂，帮助身体能力，以及导致在挫伤以后比没有治疗或用NSAID进行治疗更加有效的肌肉修复。

在南非，腺牧豆被分类为入侵树，以及可能在其他国家也是如此的事实说明这些发现的民族药理学意义。经济的、自然的和易得的物质用作治疗可能不仅在体育竞技场和卫生部门而且在植物和野生动物保护方面均产生深远的影响。

现在将通过以下非限制性实施例更详细地描述本发明。

实施例1：腺牧豆用于软组织损伤的预防和治疗应用

研究了腺牧豆作为在挫伤以后的可能的损伤前和/或损伤后治疗选项。研究了对中性粒细胞和巨噬细胞渗入受伤部位的影响，以及在肌肉再生的情况下的相关后果。在肌肉损伤和炎症的治疗中常用的公认的NSAID(双氯芬酸(diclofenac))用作比较对照。

材料和方法

动物

将年龄匹配和体重匹配的成年雄性Wistar大鼠分为四个主要组，即：(1)对照安慰剂(PLA)；(2)PG-CHR，在损伤前以及在损伤后用腺牧豆治疗8周直到处死的时候的动物；(3)PG-AI，在损伤以后用腺牧豆治疗(首次治疗，在损伤以后2小时)，直到处死的时候的动物以及(4)NSAID，在损伤以后直接用Voltaren(双氯芬酸)治疗，直到处死的时候的动物。所有四个组细分为处死以及t＝0小时(损伤前)、损伤后1小时、3小时、1天和7天的数据收集时间点。每个主要组具有n＝25，即，5只大鼠/时间点/组(共计100只大鼠)。

在方案开始时，在不同实验组中的大鼠的体重进行匹配(PLA：456.47±9.74g；PG-CHR：445.98±11.21g；PG-AI：439.12±14.84g；NSAID：442.25±12.58g)。

腺牧豆和双氯芬酸治疗

仅由干研磨的腺牧豆荚组成的腺牧豆粉用于此实验[26]。为了准备治疗，为在治疗组中的每只动物每天称重来自P.Schoeman的腺牧豆粉并设置成1mL体积的可商购的明胶/果冻立方体的混合物。单独地用这些果冻立方体(cube)来喂养每只动物8周，以确保绝对顺从性(compliance)和剂量控制(dose control)。基于为成人规定的每日剂量(可商购的食品补充剂)来计算100mg/kg/天腺牧豆的剂量。本申请人先前已表明，此剂量会在大鼠中引发有益的代谢变化[26,27]。在8周实验期期间，对照动物接受安慰剂果冻立方体。

双氯芬酸，已知的NSAID，作为用于治疗的抗炎作用的阳性对照。在损伤后的不同的时间段以后，将形式为来自Novartis的Voltaren的双氯芬酸钠局部应用于在大鼠的后肢上的受伤部位。Voltaren的剂量计算为57.14mg/kg/天，其等于0.57mg/kg双氯芬酸。基于为成人规定的每日剂量来计算该剂量。

实验肌肉挫伤的引起和样品收集

利用由Stratton et al.(1984)[28]首先描述的并由Myburgh和同事(2012)[7]为我们的实验室优化的质量下降模型损伤(mass-drop model injury)来对大鼠后肢产生挫伤。简要地说，该技术需要从50cm的高度将200g重物落到戊巴比妥钠(40mg/kg，腹腔内)麻醉大鼠的右腓肠肌的内侧面上。这种挫伤是中度严重，并不导致骨损伤或影响受伤动物的步态。

为了样品收集，通过戊巴比妥钠过量(200mg/kg，腹腔内)来安乐死大鼠并收获损伤的腓肠肌的中央部分。将收获的肌肉分为两部分，一部分经处理用于免疫组织化学分析，而另一部分则快速冻结(snap-freeze)用于蛋白质印迹分析。

肌肉组织学和免疫组织化学

对于横断面组织学和免疫组织化学，将肌肉固定在10％甲醛生理盐水(formal saline)中，处理并包埋在石蜡中。制备5微米厚横截面(Leica RM 2125RT microtome,Nussloch,德国)并用苏木精和曙红(H&E)加以染色，用于定性组织学分析。

用完全自动化Leica Bond-Max Autostainer系统(Leica Microsystems,德国)并利用板载检测试剂盒(onboard detection kit)(其包括Bond Epitope Retrieval Solution、过氧化物嵌段(peroxide block)、一抗、后主要试剂(post primary reagent)、Bond Wash溶液和Bond Polymer[29,30])，借助于小鼠抗大鼠His48(中性粒细胞；1:200；Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA)、山羊抗小鼠F4/80(巨噬细胞；1:200；Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA)和兔抗人结蛋白(1:200；Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA)抗体来进行免疫染色。DAB(3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐)用作色素原(chromogen)(Leica Microsystems,德国)。在整个研究中使用适当的阳性对照。

图像分析

对于每种抗体，在每个时间点，通过分析来自每个肌肉样品的两个切片来获得所有成像数据。利用装备有彩色数码相机(Nikon 5.0Mega Pixels Color Digital Camera head DS-Fi2)的显微镜(Nikon ECLIPSE E400，使用了400x物镜)，在受伤部位中，成像5个视场(field of view)/切片。在本文中呈现的图像仅是在200×放大率下获取的那些图像的部分图像。照片用来计数阳性标记的中性粒细胞、巨噬细胞和结蛋白染色。手动计数免疫细胞并利用NIS-Elements BR成像软件包，表示为在受伤部位中阳性标记的免疫细胞/视场(350μm2)的平均数。为了细胞被分类为真正的中性粒细胞和巨噬细胞，它必须分别具有多叶核或单核，并具有周围细胞质。

蛋白质印迹

通过标准蛋白质印迹技术来确定蛋白质水平[26]。简要地说，从腓肠肌组织提取蛋白质，在SDS聚丙烯酰胺凝胶上加载和分离相等浓度的总蛋白，并电转移到ImmobilonTM-P PVDF膜。丽春红(Ponceau red)可逆染色用来确定蛋白质的转移效率。在ADAM₁₂一抗(1:5000；Abeam,英格兰,英国)中温育膜过夜。为了检测，使用辣根过氧化物酶偶联二抗(1:4000；Amersham Life Sciences,Sandton,JHB，南非)。利用ECL检测试剂(Amersham Life Sciences,Sandton,JHB，南非)来可视化抗原-抗体复合物并暴露于放射自显影胶片(Hyperfilm ECL,RPN 2103)，然后检测光发射。通过密度法(UN-SCAN-IT；Silk Scientific Inc.,Utah,UT,美国)来分析所有胶片并以任意单位(AU)来表示归一化数据。在所有情况下，通过在0.2M NaOH中温育来剥离膜，并用抗β-微管蛋白的抗体(1:1000；Cell Signalling Technology,Beverley,MA,美国)再印迹以证实横过测试样品的蛋白质负荷的均匀性。

统计分析

所有数据表示为平均值±平均值的标准误差(SEM)。通过双向ANOVA，接着Bonferroni事后检验，来分析统计显著性。p<0.05被认为是统计显著的。利用GraphPad Prism版本5来进行数据的统计分析。

结果

慢性腺牧豆治疗加速肌肉超微结构的修复

挫伤后纤维结构的定性微观分析表明，不论是否治疗，对肌腹的钝力(blunt force)会显著损坏和破坏骨骼肌纤维，从而导致在损伤以后的1小时和3小时在间质空间(interstitial space)中的红细胞累积(图1B、E、H、K)。没有包括在损伤以后的1小时的代表性图片，因为不能在视觉上容易地识别在损伤后1和3小时之间的差异。在治疗组和未治疗组中均存在水肿，其由在早期时间点的纤维之间的间质空间的加宽得到证实。在安慰剂(PLA)和治疗组之间的组织学比较说明了在所有四个组中在损伤后1天免疫细胞的显著流入。然而，当与所有其它组相比时，在用腺牧豆(PG-CHR)慢性治疗的组中，这种流入是相对有限的。在PLA、损伤后治疗组(PG-AI)和非甾体抗炎治疗(NSAID)组的受伤部位中免疫细胞仍然是可见的最长达损伤后第7天(图1D、J、M)，但是在相同时间点在PG-CHR组中则是不可检测的(图1G)。到第7天，仅慢性治疗的腺牧豆组(图1G)呈现接近正常的肌肉结构，其指示成功进行肌肉再生。

腺牧豆治疗钝化了对挫伤的中性粒细胞应答

关于中性粒细胞渗入，在各种实验组之间，明确的差异是明显的。在损伤以前，在任何实验组中，不存在中性粒细胞，而挫伤导致在损伤以后第1天中性粒细胞的显著的(在30和40倍之间)瞬时升高，到损伤后第7天，其正常化(p<0.0001)(图2)。与未治疗组(PLA)相比，在损伤后第1天，PG-CHR(p<0.0001)、PG-AI(p<0.001)以及NSAID治疗组(p<0.0001)显示显著较低数量的中性粒细胞。此外，在这三个治疗组中，如在损伤后第1天所评估的，中性粒细胞(neutrophil)应答的大小是相似的。

腺牧豆治疗并不影响对挫伤的巨噬细胞应答

如同中性粒细胞数据，在未受损伤的对照样品中，巨噬细胞的存在是不可检测的(图3)。在评估的时间点中，在所有四个实验组中，在受伤部位中存在的巨噬细胞峰值数(peak number)(p<0.001)是在损伤以后的1天。到损伤以后的第7天，这些增加的值再次正常化(p<0.001)。在评估的时间点，似乎没有治疗具有对巨噬细胞渗入的任何作用。

响应于慢性腺牧豆治疗，增强了ADAM₁₂表达

按照蛋白质印迹分析，自损伤后3小时起，卫星细胞增殖标记，ADAM₁₂，的表达显著升高(p<0.0001)并且这种显著升高保持至少24小时(p<0.0001)，其中，在所有实验组中，在损伤以后的第7天，表达再次正常化到未受损伤的水平(p<0.0001)(图4A、B)。在评估的所有三种治疗中，当与PLA组比较时，用腺牧豆(PG-CHR)进行8周慢性治疗在损伤后的第1天显示最显著的效果，具有ADAM₁₂的显著增加的(p<0.05)表达。当与PLA比较时，虽然损伤后治疗(PG-AI)似乎在第3小时时抑制ADAM₁₂表达，但它伴随ADAM₁₂表达的显著增加(3至1天)。在3小时时，NSAID治疗与类似抑制的ADAM₁₂表达关联，但借助于这种治疗，在损伤以后1天保持相对抑制。确实，与慢性治疗的腺牧豆组相比，在损伤后的3小时和1天，NSAID组均表达较低水平的ADAM₁₂，对于后者显著如此(p<0.001)。为了清楚起见，在每个实验组中在不同时间点之间观测到的统计差异示于图4C。

响应于慢性腺牧豆治疗增加了结蛋白表达

发现在损伤以后结蛋白表达稳步增加，其中在所有四个不同实验组中，最高值是在7天损伤后时间点。在7天损伤后时间点时，与所有其它组相比，慢性治疗的腺牧豆组(PG-CHR)显示显著升高的结蛋白表达(图5)。虽然损伤后腺牧豆治疗对结蛋白的表达没有影响，但当与所有其它组相比时，NSAID治疗组显示显著降低的结蛋白表达，指示延迟的再生。

讨论

发现慢性腺牧豆治疗显著减少中性粒细胞渗入受伤部位，暗示减少的促炎信号和可能更少中性粒细胞相关的继发性损害。为支持这种解释，观测到ADAM₁₂(损伤后第1天)和结蛋白(损伤后第7天)的表达的相关的显著增加，这提示增强的再生过程。

在腺牧豆治疗和NSAID治疗之间的较大差异是明显的。

先前在体内模型中没有测量在损伤以后在不同时间点时在腓肠肌中的ADAM₁₂表达的水平。以下事实(即相对于PLA，在早期时间点时，慢性腺牧豆治疗增加ADAM₁₂表达)表明通过增强早期增殖，所述治疗可以促进更有效的恢复。与之形成鲜明对比，NSAID治疗导致显著抑制的ADAM₁₂表达(尤其是在3小时时)，其指向对修复的抑制作用。依据结蛋白应答，这种不希望的效果也是明显的。

结蛋白水平在肌生成期间通常显著增加并在新成熟的肌纤维中保持上升[49]，这解释了在我们的方案的时间过程中的相对较晚的应答。在第7天，以及依据提示更有效的肌纤维修复的其它数据，在慢性腺牧豆治疗以后，结蛋白表达是显著较高的。相比之下，在NSAID治疗以后，结蛋白表达显著低于PLA，再次指向NSAID对修复的抑制作用，如在文献[3]中所建议的。

实施例2：腺牧豆对肌肉力量的影响

通过电刺激来自大鼠的分离的比目鱼肌，研究了腺牧豆对疲劳的影响以及确定了在疲劳期以后的恢复程度以及在具有和没有腺牧豆治疗的情况下力量发展的大小。

材料和方法

化学品

使用的所有化学品均购买自Merck(Pty)Ltd，南非。腺牧豆制剂是如在实施例1中所描述的。

腺牧豆治疗方案

用腺牧豆粉，以100mg/kg/天的剂量来治疗大鼠，总共10周。每天为在治疗组中的每只动物称重腺牧豆并设置在1ml体积的可商购的明胶/果冻立方体的混合物中。单独地用这些果冻立方体喂养每只动物，以确保绝对顺从性和剂量控制。基于为成人规定的每日剂量来计算100mg/kg/天腺牧豆的剂量，其先前已由本申请人说明以引起代谢变化[George et al.,2011；Huisamen et al.,2012]。为使动物习惯于研究者和果冻立方体的味道，在开始实际治疗程序以前，给所有动物喂养安慰剂果冻立方体(没有腺牧豆的果冻立方体)1周。在8周实验期期间，对照动物接受安慰剂果冻立方体。

分组

将年龄和体重匹配的雄性Wistar大鼠分为2组：对照安慰剂组(PLA)，其接收正常大鼠食物颗粒和没有腺牧豆的果冻立方体，以及腺牧豆组(PG)，其接收正常大鼠食物和混入果冻立方体中的腺牧豆(在每个组中n＝10)。采用总共20个分离的肌肉，即，10只动物/实验组(治疗相对于无治疗)。

处死和样品收集

在腺牧豆治疗10周以后，称量动物(以确定体重)，然后接收过量的戊巴比妥钠(200mg/kg，腹腔内)。持续监测动物直到失去知觉，其由在捏脚(foot pinch)以后完全缺乏反应所指示。

肌肉疲劳刺激方案

通过先前由Gordon et al.(2010)的El-Khoury et al.(2012)描述的方法来确定骨骼肌疲劳。在用过量的戊巴比妥钠(200mg/kg，腹腔内)来安乐死动物以后，除去具有完整的腱插入物(tendinous insertion intact)的比目鱼肌中的一个，并放入冰冷的Krebs-Henseleit缓冲液(KHB)中。KHB溶液含有(以mM为单位)：NaCl 119、KCl 4.74、CaCl₂.2H₂O 1.25、MgSO₄.7H₂O 0.6、KH₂PO₄ 1.2、NaHCO₃ 24.9、Na₂SO₄ 0.6和葡萄糖10。然后从冷KHB缓冲液移开完整的比目鱼肌并垂直悬在一对铂电极之间(在含有KHB溶液的25ml水夹套的器官浴(organ bath)中)。连续充气(95％O₂/5％CO₂)KHB以保持pH在7.4下并将KHB的温度保持在25℃下。体外大鼠骨骼肌的生理稳定性是温度依赖性的，以及，与37℃的体内温度相比，直径为1-2mm的肌条的稳定性在25℃下是更好的[Segal et al.,1986]。将肌肉的基底(base)固定于不动钩并将另一端系连于等长力传感器(isometric force transducer)。可以通过微定位器来调节力传感器的位置，因而改变预载。在开始电刺激以前，让肌肉稳定30分钟。

在30分钟的平衡期以后，确定最佳长度(即，产生最大等长抽搐力(maximal isometric twitch force)的肌肉长度)和超最大电压(supramaximal voltage)。通过分别在增加的肌肉长度和电压下来生成单一抽搐收缩(twitch contraction)，直至观测不到单一抽搐力(single-twitch force)生产的增加，来确定针对每个肌肉的这些参数。然后在整个刺激方案中使用产生最高单抽搐幅度的肌肉长度和电压。对于所有抽搐(twitch)和强直性(tetanic)收缩，脉冲持续时间设置为1毫秒。所述刺激方案构成如下：生成单一抽搐、用于确定F_max强直收缩(tetanus)的力频率曲线、用于确定耐疲劳性的2分钟刺激期以及在疲劳以后的5和20分钟时借助于两组强直收缩刺激来结束(end off)。利用在增加的脉冲频率下的简短的反复刺激(1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90和100Hz 3秒，允许在每个刺激之间的2分钟恢复间隔)来确定F_max。使用此方案为每只动物达到的最大力被认为是F_max。在F_max确定以后的10分钟休息期以后，经2分钟期间的间歇收缩，在40Hz(预定为F_max)的频率下，刺激肌肉2秒并停止2秒，来确定肌肉疲劳率。在疲劳期间，在20秒间隔下测量力。在疲劳方案以前(BF)和以后(AF)，确定抽搐幅度(twitch amplitude)(力)、收缩时间(到峰值张力的时间)和半松弛时间(峰值力衰减50％的时间)。收缩时间(至峰值张力的时间)被定义为从单一抽搐的基底到峰值所流逝的时间。半松弛时间被定义为从单一抽搐的峰值到一半返回到基线的抽搐幅度的点所流逝的时间。通过AD Instruments Bridge Amp和Powerlab 4/30来收集所有肌肉功能数据，并用Chart5PowerLab软件(ADInstruments,Inc.,Colorado Springs,CO)加以分析。

以N/cm²的肌肉横截面积为单位来计算比力。通过肌肉的干重除以最佳长度和肌肉密度(假定是1.056g/cm³)的乘积来近似后者。利用已知重量来校准力传感器。将收缩时间和半松弛时间测量为等长抽搐动力学(isometric twitch kinetics)的指数。对于疲劳方案，通过将在每个20秒时间点产生的力表示为在疲劳试验开始时的初始力的百分比来归一化数值。

统计分析

除非另有说明，所有数据表示为平均值±平均值的标准误差(SEM)。通过学生t检验来评估两组之间的统计显著性，以及两组或更多组之间，使用双向ANOVA，接着Bonferroni事后检验。p<0.05被认为是统计显著的。利用GraphPad Prism 5来进行数据的统计分析。

结果

腺牧豆治疗对体重和肌肉生物测定的影响

在10周腺牧豆治疗的开始时，大鼠进行体重匹配，以及发现治疗对体重增加没有影响。骨骼肌生物测定(biometrics)(质量、最佳长度和宽度)，其是力输出的关键决定因素，没有显示在治疗组和未治疗组之间的显著差异(表1)。在本质上，PLA和PG的比目鱼肌在生物测量学上是相似的。

表1：在腺牧豆治疗以后实验动物的生物测量特征

数据表示为平均值±SEM；通过学生t检验进行分析；n＝10

比目鱼肌的收缩性能

当比较PLA(BF)与PLA(AF)以及PG(BF)与PG(AF)时，肌肉疲劳的引起导致由比目鱼肌产生的抽搐力和峰强直性力的显著降低。因此，作为结果，与疲劳前相比，在疲劳以后，抽搐/强直收缩比显著减小。尽管随之而来的疲劳，但收缩时间不受腺牧豆治疗的影响，并一直保持恒定。十周的腺牧豆治疗充分增加了由比目鱼肌所产生的力，如由在基线(PG(AF)相对于PLA(AF))处的显著升高的抽搐力和峰强直性力生产所说明的。与未治疗的对照相比，腺牧豆治疗还导致疲劳后显著增加的半松弛时间(表2)。

表2：在疲劳以前和在疲劳以后来自对照与腺牧豆治疗的大鼠的比目鱼肌的收缩性能

数据表示为平均值±SEM；通过双向ANOVA进行分析；n＝10

力-频率关系

力-频率关系(其是在肌肉激活频率和随之而来的等长力输出之间的S形(sigmoid)关系)，对于在治疗组和未治疗组中的肌肉，显示类似的趋势。这种趋势示于图6(B)，表示在每个频率下产生的力，其表示为产生的最大力的％。相比之下，在不同频率下产生的力的绝对值表明与未经治疗大鼠相比，在所有不同频率下，在电刺激期间，经治疗大鼠的比目鱼肌产生显著更大的力(P<.001)。如图6(A)所示，由未经治疗大鼠的比目鱼肌产生的力逐步从在5Hz的频率下的15.34±2.92N/cm²增加到在40Hz的频率下的47.77±5.73N/cm²的最大力，其后产生的力缓慢下降到在100Hz的频率下等于38.55±6.27N/cm²的力。经治疗大鼠跟随类似的趋势，但在显著更高水平。在慢慢下降到在100Hz的频率下的53.48±6.41N/cm²的力以前，由腺牧豆治疗的大鼠的比目鱼肌产生的力逐步从在5Hz的频率下的24.37±3.18N/cm²增加到在40Hz的频率下的61.65±5.05N/cm²的最大力。在40Hz的频率下，在两组中，产生的力的水平达到最大值。

疲劳特性

2分钟间歇性刺激(疲劳方案)足以显著降低由治疗组和未治疗组产生的力至少50％。换句话说，在2分钟疲劳方案以后测得的力是50％低于在疲劳的引起以前所测得的力(18.03±3.36相对于42.62±5.00N/cm²；P<.0001)[图7B]。腺牧豆治疗不能降低疲劳耐受性，因为在治疗组相对于未治疗组之间，在2分钟疲劳方案期间的任何点，疲劳发展不是显著不同的。然而，当与未治疗组相比时，在治疗组中产生的初始力是显著较高的(56.39±4.21相对于42.62±5.00N/cm²；P<.001)。

在疲劳以前和在疲劳以后的收缩性能

当比较PLA(BF)与PLA(AF)以及PG(BF)与PG(AF)时，肌肉疲劳的引起导致由比目鱼肌产生的抽搐力和峰强直性力的显著降低。因此，作为结果，与疲劳前相比，在疲劳以后抽搐/强直收缩比显著减小。尽管随之而来的疲劳，但收缩时间不受腺牧豆治疗的影响，一直保持恒定。十周的腺牧豆治疗充分增加了由比目鱼肌产生的力，如由在基线(PG(AF)相对于PLA(AF))处显著升高的抽搐力和峰强直性力生产所说明的。与未治疗的对照相比，腺牧豆治疗还导致疲劳后显著增加的半松弛时间[表2]。

讨论

在这项研究中，本申请人检查了在健康大鼠的电场刺激期间腺牧豆对比目鱼肌的可能的强度增加影响。疲劳前以及在疲劳以后5分钟和20分钟产生强直性力(图8)。从此数据可以清楚地看出，在疲劳方案以后5分钟产生的力显著低于疲劳前产生的力。这是一个良好的迹象，在疲劳方案后，肌肉确实被耗尽(exhaust)。然而，在20分钟休息期以后，比目鱼肌可以恢复其力量，如图8所示。在疲劳以后20分钟，产生的力如同初始力(疲劳前)。

在运动诱发疲劳期间还变化的另一个方面是肌肉松弛的放缓[Allen et al.,2008]。在本研究中，在对照组或治疗组中，在疲劳以前和在疲劳以后，在半松弛时间的初始阶段中不存在显著差异(表2)。然而，当用腺牧豆治疗大鼠16周并电刺激至疲劳(PG(AF))时，在疲劳以后5分钟(PLA(AF))，它们的比目鱼肌以比未经治疗大鼠的比目鱼肌显著更慢的速率进行松弛(表2)。

重要的是，在疲劳的引起以前，当刺激肌肉以产生单一抽搐或强直收缩时，经治疗大鼠(PG)的比目鱼肌产生显著较高的力(表2)。在力-频率关系确定期间观测到同样的现象。如图6(A)所示，由未经治疗大鼠的比目鱼肌产生的力逐步增加以达到其在40Hz下的最大力，此后，产生的力再次缓慢下降。虽然在治疗组中观测到类似的趋势，但在所有不同频率下，由经治疗大鼠的比目鱼肌产生的比力是显著较高的(图6(A))。图6(B)(其示出在每个频率下所产生的最大力的％)，示出类似的趋势，其中在相应的频率下被刺激以后治疗和未治疗的比目鱼肌均产生力。当与疲劳以后(5分钟)直接产生的力比较时，在对照(PLA)和治疗(PG)组中，20分钟休息期允许肌肉恢复大部分的其初始力。已知，运动诱发疲劳是可逆的，以及在适度的休息期以后，肌肉能够生成和疲劳前所生成的力相同的力[Allen et al.,2008]。因此，可以假设，如果让肌肉完全恢复，则在这项研究中看到的对力的增强的影响将持续。

主要通过肌肉的大小和肌纤维类型来确定肌肉力量生成的大小[Maughan et al.,1983；Lee et al.,2013]。在这项研究中，在不同实验组中没有发现生物测定的显著差异，即，肌肉的重量、长度和宽度，因此肌肉似乎是表型上相似的(表1)。肌肉力量增加的可能的解释可能是，腺牧豆治疗导致肌纤维类型的转变，即从慢缩表型到快缩表型。已知，不是所有肌纤维都是一样的，以及它们的差异在于许多因素如代谢、收缩持续时间以及发展最大张力所需的时间。骨骼肌纤维主要分为三类，氧化慢缩纤维(oxidative slow-twitch fiber)、氧化快缩纤维(oxidative fast-twitch fiber)和糖酵解快缩纤维(glycolytic fast-twitch fiber)。按照获自本研究的结果，看样子似乎是，转变是从氧化慢缩表型到氧化快缩表型。关于疲劳发展，氧化慢缩纤维和氧化快缩纤维类似地反应，即，均发现它们是"耐疲劳的"[Sllverthorn,2004]。在这项研究的数据中还可以看到关于疲劳发展的这种相似性，因为在治疗组和未治疗组之间没有观测到显著差异。这些肌肉以相同的速率疲劳。此外,氧化快缩纤维发展最大张力所需的时间是比氧化慢缩纤维发展最大张力所需的时间更快的[Sllverthorn,2004]。在这些结果中这种现象也是明显的，因为在未治疗组中肌肉的收缩时间是比治疗组的肌肉的收缩时间相对更慢的(表2)，即，经治疗动物的肌肉以更快的速率收缩，因此更快地达到其最大张力。含有快缩纤维的运动单元(motor unit)通常大于含有慢缩纤维的运动单元。这种差异不可避免地意味着，相比于当刺激慢缩纤维运动单元时，当刺激单一快缩纤维运动单元时，更多的肌纤维收缩。因此，因为在快缩纤维运动单元中更多纤维被刺激以收缩，所以快缩纤维会产生更大的力。因此，由高比例的慢缩纤维组成的肌肉将相对弱于相似尺寸的具有高比例的快缩纤维的肌肉。

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