作为真菌感染疫苗的真菌葡萄糖神经酰胺的制作方法

本发明涉及抗原真菌葡萄糖神经酰胺，包括该葡萄糖神经酰胺的组合物(例如，能用于治疗或预防真菌性疾病的疫苗)，以及制备和使用该组合物的方法。
背景技术：
：真菌感染对公共健康造成严重威胁。真菌常见于环境中，因为它们能在土壤、植物和树木、固有表面和生物体(包括人的皮肤)上生长。尽管有抗真菌药物，但是，侵袭性真菌感染的发病率和死亡率依然很高，特别是在危重患者中。关于综述，参见enoch等(j.medicinalmicrobiol.55：809-818，2006)和spellberg(medicinereports3∶13，2011)。预防性或治疗性免疫然后成功清除真菌病原在很大程度上取决于宿主免疫系统在免疫应答中被适当激活的能力以及引发不明显损害健康组织的有效应答的能力。存在开发以及改进真菌疫苗的需要。技术实现要素：本发明部分地基于我们的研究，该研究表明施用从非致病性真菌纯化的葡萄糖神经酰胺可抵御致病性真菌。更具体地，我们的研究显示，腹腔施用从非致病性真菌产朊假丝酵母(candidautilis)(圆酵母)纯化的葡萄糖神经酰胺明显降低了新型隐球菌在小鼠中从肺部向脑部的扩散，从而预防致命性脑膜脑炎的发生。本发明的组合物不仅诱导主动免疫，还利用脂质抗原诱导主动免疫。相反，大多数疫苗是由蛋白质或肽组成的。因为抗原的来源可以是非致病性真菌，我们预计本申请所公开的治疗方法将可抵御许多而且可能抵御全部致病性真菌。于是，在第一方面，本发明的特征在于包括从非致病性真菌(例如，产朊假丝酵母)纯化的真菌葡萄糖神经酰胺(glccer)和佐剂(例如，2-羟丙基-β-环糊精(hp-β-cd)，完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂)的组合物。在第二方面，本发明特征在于通过对患者施用包括真菌葡萄糖神经酰胺(例如，从非致病性真菌分离的真菌葡萄糖神经酰胺)的组合物治疗具有真菌性疾病的患者的方法。我们预计可以治疗广泛的真菌性疾病，包括由犁头霉属(absidia)、链格孢属(alternaria)、曲霉属(aspergillus)、蛙粪霉菌属(basidiobolus)、双极霉属(bipolaris)、念球菌属(candida)、枝孢霉属(cladosporium)、隐球菌属(cryptococcus)、弯孢霉属(curvularia)、表皮癣菌属(epidermophyton)、克雷伯菌属(klebsiella)、小孢子菌属(microsporum)、青霉菌属(penicillium)、肺孢子虫属(pneumocystis)、红酵母属(rhodotorula)、酵母菌属(saccharomyces)、葡萄状穗霉属(stachybotrys)、毛癣菌属(trichophyton)、毛孢子菌属(trichosporon)或者万吉拉菌属(wangiella)的真菌感染导致的疾病。可以纯化glccer的非致病性真菌可以是例如产朊假丝酵母。组合物可以以治疗有效量施用，治疗有效量是将真菌性疾病的迹象或症状减轻至患者感到缓解且优选完全缓解的程度的量。组合物可以每天施用直至患者被成功治疗。组合物可以配制为用于局部施用或通过注射(例如，皮下或肌内注射)施用。在第三方面，本发明特征在于通过向受试者施用包括真菌葡萄糖神经酰胺(例如，从非致病性真菌分离的真菌葡萄糖神经酰胺)的组合物而预防受试者真菌性疾病的方法。与治疗方法一样，预防方法可以用于预防由犁头霉属、链格孢属、曲霉属、蛙粪霉菌属、双极霉属、念球菌属、枝孢霉属、隐球菌属、弯孢霉属、表皮癣菌属、克雷伯菌属、小孢子菌属、青霉菌属、肺孢子虫属、红酵母属、酵母菌属、葡萄状穗霉属、毛癣菌属、毛孢子菌属或者万吉拉菌属的真菌感染导致的疾病。纯化glccer的非致病性真菌可以是产朊假丝酵母。如本申请所述以及疫苗疗法领域所已知的，除了明确的glccer抗原，组合物可以进一步包括佐剂。施用组合物的步骤可以发生至少两次，第一次作为初次接种，第二次(以及后续次数)作为加强免疫。与治疗方法一样，被施用用于预防的组合物可以配制为用于局部施用或通过注射(例如，皮下或肌内注射)施用。在第四方面，本发明特征在于配制真菌性疫苗的方法，通过：(a)提供从非致病性真菌分离的真菌葡萄糖神经酰胺；以及(b)在生理上可接受的辅料中将真菌葡萄糖神经酰胺与佐剂混合。对于“大约”，我们指的是加减所提及值的10％以内。例如，大约10mg指的是9～11mg。对于“抗原”或“免疫原”，我们指的是对受试者(例如，人类)施用后诱导抗体产生的物质。对于“非致病性真菌”，我们指的是不会在受试者中导致疾病的真菌。对于“致病性真菌”，我们指的是在受试者(例如，人类)中导致疾病的真菌，无论该疾病是通常所称的疾病本身还是作为障碍、病症等等而涉及的。致病性真菌可以是在健康受试者中导致疾病的真菌，或者它可以是在免疫功能低下的受试者中导致感染的机会致病菌。对于“预防”，我们指的是防止指示真菌感染的临床迹象或症状(例如，在受试者中由致病性真菌感染导致的疾病)。这种防止包括在真菌感染风险下维持受试者的正常生理指标(例如，正常体温、体重和心理状况的维持)，以及防止真菌感染损伤或其他病理表现。对于“纯化的”，且相对于葡萄糖神经酰胺，我们指的是至少或大约50％的纯度(例如，指定制剂的至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或99％以上(例如，大约99.5％)是葡萄糖神经酰胺)。对于“受试者”，我们指的是个体生物，包括诸如驯养动物或人类的哺乳动物。除非上下文另有说明，我们可以互换地使用术语“受试者”、“个体”以及“患者”。我们可能倾向于用术语“患者”来指被诊断为有真菌感染的个体生物。对于“治疗”，我们指的是已被诊断有真菌感染的患者感受到的临床体征或症状的改善。类似地，“治疗”这种患者的方法是改善患者感受到的临床迹象或症状的方法。当它抑制了真菌性疾病的一种或多种迹象或症状的进展，和/或患者感受到疾病严重性、疾病的慢性并发症或机会性真菌感染降低时，治疗或治疗的方法是成功的。在有些患者中，根据本发明方法的治疗可以抑制或预防真菌在组织或器官内或者从一个组织或器官向另一组织或器官的扩散。例如，在有些患者中，根据本发明方法的治疗可以抑制或预防新型隐球菌从肺部向脑部的扩散，从而预防致命性脑膜脑炎的发展。本申请所述的任意治疗方法还可以以“用途”来表述。例如，本发明特征在于本申请所述组合物在药物制备或在用于真菌性疾病预防或治疗的药物制备中的用途。对于“疫苗”，我们指的是为了诱导或加强将抵御一种或数种由致病性真菌导致的疾病提供免疫的免疫反应的目的而向受试者(例如，人类)施用的组合物。该术语包括以适于向受试者施用形式的组合物以及其他形式的组合物(例如，浓缩的储液和粉末或施用之前需要进一步操作的冻干形式)。受试者可以是当前没有真菌感染但处于发生这种感染的风险中的个体生物。我们知道只有少数几种抵御致病性真菌有效的疫苗。也一直在努力寻求诱导被动免疫的策略。例如，抗葡萄糖神经酰胺单克隆抗体的施用在感染了新型隐球菌的小鼠中产生有限的保护作用，新型隐球菌是可以诱导隐球菌病的酵母样病原体，隐球菌病影响中枢神经系统且可以是致命的，尤其是在免疫功能低下的患者中(rodriguesetal.，clin.vaccineimmunol.，14(10)：1372-1376，2007)。虽然在此小鼠模型中观察到了保护作用，但是被动免疫仅可部分抵御真菌。在下述研究中，我们观察到施用从非致病性真菌产朊假丝酵母提纯的glccer之后的抵御致病性真菌新型隐球菌的部分保护作用。该保护作用似乎是由抗真菌glccer的抗体介导的，我们因此相信真菌glccer可以用作抗原。利用弗氏佐剂施用glccer提高了抵御作用且似乎在减少真菌细胞从肺部向脑部的扩散方面特别有用。就机制而言，保护作用似乎不是由抗igm抗体的调理作用介导的。附图说明图1和图2示出从产朊假丝酵母提取的纯化glccer的结构，其中，图1示出具有4，8-鞘氨二烯醇(d18∶2)鞘氨醇碱的glccer，图2示出具有9-甲基-4，9-鞘氨二烯醇(d19∶2)鞘氨醇碱的glccer，r＝c9-c27。图3示出如实施例3中所述用于对小鼠每日施用葡萄糖神经酰胺的程序。图4是记录如图3中所示以及进一步在实施例3中所说明的治疗过的小鼠存活率的图。图5～7是记录如图3所示以及实施例3中所说明的未治疗或用glccer治疗的隐球菌感染小鼠中的真菌组织负荷的柱状图，其中，图5记录了接种媒介物的感染小鼠中的真菌组织负荷(第5组；“溶剂”)，绘出了存活22、24、27和29天的小鼠(分别是小鼠#1(″cn1”)、小鼠#3(“cn3”)、小鼠#4(“cn4”)和小鼠#6(“cn6”))中的log10cfu/器官(从左到右：脑、肺、肝、脾和肾)，隐球菌细胞存在于全部被检器官中；图6记录了接种glccer(第3组)并存活90天的四只感染小鼠(命名为#7、#8、#9和#10)的真菌组织负荷，在从全部四只小鼠获取的肺组织、两只小鼠获取的肝组织、以及两只小鼠获取的肾组织中发现了真菌细胞；图7记录了存活了90天的接种glccer+弗氏佐剂(第4组)的四只感染小鼠中的真菌组织负荷，仅在作为感染的主要部位的肺组织中发现了真菌细胞。图8和图9是用苏木精和曙红(h&e；左侧照片)以及粘蛋白卡红(右侧照片)染色的脑部(图8)和肺部(图9)的显微照片组，治疗组如标记所示。图10是示出抗-glccerigm抗体在如所示治疗过的小鼠血清中存在情况的柱状图；“glccer”指葡萄糖神经酰胺，“fa”指弗氏佐剂，“cn”指新型隐球菌，“sol”指“溶剂”。图11是实验治疗方案的示意图，在该方案中每周施用葡萄糖神经酰胺，如实施例4中进一步说明的。图12是绘出未以任何方式治疗的小鼠(第3组)、用盐水治疗并用新型隐球菌攻击的小鼠(第2组)以及在用新型隐球菌攻击之前用glccer和弗氏佐剂治疗的小鼠(第1组)(如进一步在实施例4中说明的)的存活率的图。图13是示出抗体应答的一对柱状图(在各治疗组中产生的igm抗体的量在左侧图中示出，igg抗体的量在右侧图中示出)。本研究中的小鼠如图11所示治疗过并在实施例4中作了进一步说明。结果显示在观察期间强大的igm应答但没有可检出的igg应答。可能是igg应答将在更晚的时间点产生，但这些数据表明保护作用不是由于igg(因为我们在igg应答被刺激之前观察到保护作用)。图14是示出如实施例5中进一步说明的，用于在佐剂存在或不存在下用不同施用途径对不同品系小鼠施用葡萄糖神经酰胺的程序的示意图。图15是示出从如图14所示以及实施例5中进一步说明治疗过的小鼠采集的血液中抗glccer抗体水平的四柱状图组。图16是说明我们的巨噬细胞在抗glccerigm或抗gxmigg抗体存在下吞噬隐球菌的研究结果的一对柱状图。图17是示出糖鞘脂类基本结构的示意图。长链鞘氨醇碱主链(不同于具有甘油主链的甘油脂类)利用2-氨基通过酰胺键连接到脂肪酸并通过酯键在c1位连接到极性端基，形成神经酰胺。神经酰胺通过糖的半缩醛基与神经酰胺的c1羟基之间的β-糖苷键连接到糖(葡萄糖、半乳糖或肌醇)。具体实施方式真菌葡萄糖神经酰胺是在人类(barretal.，biochemistry23：5589-5596，1984；barrandlester，biochemistry23：5581-5588，1984；jimenez-luchoetal.，infect.immun.58：2085-2090，1990；rodrigues，infect.immun.68：7049-7060，2000)或小鼠(toledoetal.，glycobiology11：105-112，2001，rodriguesetal.，clin.vaccineimmunol.14：1372-1376，2007)中诱导产生宿主抗体的抗原分子。在这些研究中，抗glccer抗体由通过感染期间的真菌而产生的glccer刺激时(即，当施用完整真菌时)的抗体产生比由从植物纯化并外源性引入的glccer刺激时更好。抗体产生通过将患者血清加到已经吸附纯化glccer的elisa板而证实。此外，植物葡萄糖神经酰胺(纯化自大豆)在小鼠中诱导局部先天免疫的激活并保护它们不发生结肠癌(symolonetal.，j.nutr.134：1157-1161，2004)。而且，用植物葡萄糖神经酰胺对小鼠的治疗诱导抵御后续真菌感染的保护作用(umemuraetal.plantcellphysiol.43：778-784，2002；umemura，plantcellphysiol.41：676-683，2000；koga，etal.，j.biol.chem.273：31985-31991，1998)。这些现象说明葡萄糖神经酰胺是宿主先天免疫和体液免疫因而抵御真菌感染的潜在诱导剂。葡萄糖神经酰胺：葡萄糖神经酰胺类(glccer，也称为葡萄糖神经鞘苷)包括神经酰胺、脂肪酸和葡萄糖残基，神经酰胺相应地由鞘氨醇(sphingosine)(也称为鞘氨醇碱(sphingoidbase))组成。它们在自然界很丰富并发现于植物、动物和真菌中。明确的glccer化学结构可以根据与其天然相关的真菌类型而变化。例如，连接到鞘氨醇主链的脂肪酸可以变化(长链鞘氨醇碱主链利用2-氨基通过酰胺键连接到脂肪酸)。脂肪酸可以包括4～28个碳原子，其中短链脂肪酸具有少于六个碳原子，中链脂肪酸具有6～12个碳原子，长链脂肪酸具有13～21个碳原子，极长链脂肪酸具有多于22个碳原子。鞘氨醇碱或脂肪酸中的碳原子还可以是饱和或不饱和的以及羟基化或非羟基化的。具有这些特征中任意一种或这些特征任意组合的葡萄糖神经酰胺在本发明的范围之内且可以被包括在本申请所述的组合物和方法中。本发明进一步包括已经甲基化或乙酰化的天然发生的glccer的变体，且这些变体可以被包括在本申请的组合物中并按本申请说明施用。葡萄糖神经酰胺在真菌细胞分裂、耐碱性、菌丝形成以及孢子萌发中发挥作用。因此，它们被认为在调节真菌毒力方面很重要。由于glccer是疏水性脂质，它主要定位在膜上。本发明组合物(例如，药物组合物和疫苗)中的葡萄糖神经酰胺可以从基本上任意的真菌分离，包括许多致病性真菌，诸如产朊假丝酵母、毕赤酵母以及其他。真菌glccer的化学结构与通过各种植物和哺乳动物表达的glccer的化学结构不同(delpoeta，plospathogen2014)，从各种来源分离或纯化的glccer自然会在例如上文所说明的方面(碳链长度、饱和度以及羟基化程度)有所不同。真菌glccer具有在第8位通过δ8-去饱和酶(sld8)而去饱和并在第9位通过δ9-甲基转移酶(smt1)而甲基化的鞘氨醇主链。这两个酶仅存在于真菌中；它们不存在于植物或哺乳动物细胞中。因此，真菌glccer的生物化学结构是独特的(delpoeta，plospathogens2014)，我们相信真菌glccer(例如，从非致病性真菌纯化的)会比从植物纯化的glccer更强烈地刺激宿主免疫应答。在真菌glccer中，神经酰胺主链可以连接到2-羟基十八酸，有时利用第3位的反式键。图17示出了鞘糖脂的基本结构。本发明组合物(例如，适用于治疗的疫苗和药物组合物)中的葡萄糖神经酰胺可以是合成的或从任意非致病性真菌纯化的。为了纯化适用的葡萄糖神经酰胺，可以例如：(a)提供酵母残渣；(b)用乙醇提取残渣；(c)过滤残渣；(d)皂化过滤后的溶液(例如，通过甘油三酯和磷脂的碱水解)；以及(e)中和皂化的溶液(例如，利用酸)。中和形成的盐可以通过过滤去除，可以用丙酮沉淀进一步分级分离glccer。可以随后并重复(例如，两次)进行硅胶色谱来从简单脂类中纯化glccer，且可以在最终步骤中用制备型tlc来制备纯化的glccer样品。与来源于大豆的glccer标准品相比，glccer样品的hplc纯度可以是98％以上。本方法以及例如干重等分析方法在wo2012/150683进一步作了说明。为了纯化用于本申请所述制剂和用途的glccer，可以参考wo2012/150683以及还有以下实施例的教导。适合于预防和治疗真菌性疾病的方法的受试者和患者：虽然全部受试者都适合于本申请所述预防真菌性疾病的方法，某些受试者由于感染的易感性而尤其适合。尤其适合的受试者包括由于例如感染有免疫缺陷病毒(例如，hiv)、免疫抑制治疗、高龄或早产而免疫功能低下的个体。其他尤其适合的受试者包括：经受器官移植(例如，实质脏器移植)、输血或骨髓移植的受试者；经受手术，尤其是大手术的受试者；具有氮质血症、糖尿病、支气管扩张症、肺气肿、结核病、淋巴瘤、白血病，或其他类型癌症的受试者；被烧伤或经历过其他重大创伤的受试者；具有真菌感染敏感性历史的受试者；幼小受试者(例如，约两岁以下的人类)；老年受试者(例如，大约65岁以上的人类)；以及在导致真菌感染的环境中驻留或工作的受试者。由预防方法提供的保护作用可以避免由一种或多种致病性真菌引起的感染，可以针对由一种或多种致病性真菌引起的感染对适合于本申请所述治疗方法的受试者进行治疗。致病性真菌包括犁头霉属物种，链格孢属物种，曲霉属物种(例如，a.flavatus、黄曲霉、烟曲霉、灰绿曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、萨氏曲霉和土曲霉)，双极霉属物种，念珠菌属物种(例如，白色念珠菌、c.enolase和光滑念珠菌、吉利蒙念珠菌、克柔念珠菌、c.kusei、葡萄牙念珠菌、c.parakwsei、近平滑念珠菌、假热带念珠菌、星形念珠菌和热带念珠菌)，枝孢霉属物种，隐球菌属物种(例如，白色隐球菌、加特隐球菌、罗伦特隐球菌和新型隐球菌)，组织胞浆菌属物种(例如，荚膜组织胞浆菌)，弯孢霉属物种，克雷伯菌属物种(例如，肺炎克雷伯菌)，肺孢子虫物种(例如，卡氏肺孢子虫和耶氏肺孢子虫)，酿酒酵母属物种(例如，布拉酵母、啤酒酵母和粟酒酵母(s.pombe))，毛孢子菌属物种(例如，白吉利毛孢子菌)，红酵母属物种，接合菌，透明霉菌(例如，镰刀菌和赛多孢子菌属物种(例如，尖端赛多孢子菌和多育赛多孢子菌))，葡萄穗霉物种(例如，纸葡萄穗霉)，青霉菌属物种(例如，马尔尼菲青霉菌)，以及多种暗色真菌。包括在本发明组合物和制剂中的真菌glccer还可以从皮肤癣菌中获得，包括小孢子菌属、表皮癣菌属或毛癣菌属的任何物种(例如，絮状表皮癣菌，奥杜安氏小孢子菌，犬小孢子菌，扭曲小孢子菌，马小孢子菌，石膏样小孢子菌，猪小孢子菌，同心性毛癣菌，马毛癣菌、鸡毛癣菌，石膏样毛癣菌，麦格毛癣菌，须癣毛癣菌，t.quinckeanum，红色毛癣菌，许兰毛癣菌，断发毛癣菌，疣状毛癣菌，疣状毛癣菌白色变种(t.verrucosumvar.album)、盘状变种(var.discoides)、赭色变种(var.ochraceum)，紫色毛癣菌，和/或蜜块状毛癣菌(t.faviforme))。其他的包括蛙粪霉菌属的物种，皮炎芽生菌(blastomycesdermatidis)，头状芽裂殖菌(blastoschizomycescapitatus)，枝孢霉属的物种(例如，卡氏枝孢霉)，粗球孢子菌，耳霉属的物种，小克银汉霉属的物种，弯孢霉属的物种，着色霉属的物种，棒地霉，长蠕孢属的物种，马拉色菌属的物种，链核盘菌属的物种，被孢霉属的物种，毛霉属的物种，拟青霉属的物种，副球孢子菌，pitliomyces的物种，卵形糠秕孢子菌，pythiumninsidiosum，丝核菌属的物种，根霉菌属的物种，瓶霉属的物种，孢子丝菌属的物种(例如，申克孢子丝菌)，弓形虫，以及万吉拉菌属的物种。制剂和剂量：真菌glccer可以配制成用于预防的疫苗制剂或用于确定的真菌感染治疗的药物。疫苗制剂可以包括佐剂，佐剂可以是2-羟丙基-β-环糊精(hp-β-cd)、完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂。可以采用各种施用途径和施用程序。我们最新的研究表明每日施用glccer比每周施用稍微更有效。组合物可以制备为用于注射(例如，以液态溶液或悬液)。然而，本发明还包括可以口服施用或在注射之前溶解或悬浮于液态媒介物的固态形式。施用通常是不经肠的(例如，通过经皮下、腹腔、静脉或肌肉的注射)。组合物还可以施用到损伤处或透过皮肤或粘膜被吸收。因此，本发明特征在于喷雾剂、栓剂以及经皮或透皮贴剂，喷雾剂包括可以通过吹到鼻腔、肺部以及它们之间的组织而施用的制剂。优选地，本发明的组合物是无菌的，它们可以包括将ph稳定在ph7.0左右(即，在大约6.0与8.0之间的ph)的缓冲液。组合物包括氢氧化铝盐(aluminiumhydroxidesalt)时，缓冲液优选是组氨酸缓冲液。组合物可以进一步包括一种或多种低浓度(例如，<0.01％)去污剂(例如吐温，诸如吐温80)、糖醇(例如，甘露醇)和防腐剂。个体抗原的最佳剂量可以根据经验评估。根据治疗数目和抗原量的待施用量可以取决于待治受试者、受试者免疫系统合成抗体的能力以及所需要的保护程度。然而，一般而言，基于动物研究，我们预计1～2mg/kg/天应该会提供所需要的保护作用。治疗或预防真菌性疾病的方法可以根据单剂量程序或多剂量程序(例如，在一次或多次后续“加强”之前施用初次剂量制剂)来进行。施用多剂量时，各剂量可以通过相同或不同施用途径(例如，静脉注射初免和粘膜加强)来给予。我们预计多于一次剂量的施用在无免疫力的患者中尤其有用。多剂量可以间隔至少或大约1周(例如，间隔大约2、3、4、6、8、10、12或16周)而施用。每年加强免疫可以用于持续的保护。在慢性感染的情况下，施用应该持续到至少临床症状或实验室检测表明病毒感染已经清除或大幅减少以及此后的一段时间。在有些实施方式中，glccer抗原可以在根据本领域熟知的脂质体形成方法形成的脂质体中被施用。实施例实施例1：葡萄糖神经酰胺的纯化。乙醇提取和碱水解：用1.6升的95％etoh在60℃搅拌下对800克干酵母拌提取10小时。接下来通过纸过滤将提取物从酵母细胞分离，加热所得的过滤溶液至40℃，加入10n的含水koh至终浓度为0.4n来开始碱水解。在40℃搅拌下进行2小时的碱水解皂化。用1n的hc1中和提取物至ph7并通过纸过滤除去中和时形成的kc1晶体。通过真空蒸发器干燥滤液，部分干燥物用于分析干重以及利用hplc分析glccer含量。丙酮沉淀：用100ml氯仿：甲醇(2∶1)溶解上述制备的干燥物。加入3升丙酮并混合，在-20℃、5，000rpm离心10分钟之前将所得溶液在-20℃放置4小时。弃去上清，收集含有glccer的沉淀。部分沉淀用于分析干重和glccer含量。硅胶色谱：硅胶(iatrobeads)购自于三菱化学公司(mitsubishichemicalmedience)，使用之前在120℃再生2小时。将60g再生的硅胶悬浮于氯仿中然后装柱。硅胶湿体积测定为100ml。加载样品之前用200ml氯仿对柱进行平衡。将含有glccer的丙酮沉淀用5ml氯仿溶解并加载到柱上，然后用300ml氯仿清洗柱(弃去洗脱液)。接着用400ml氯仿：丙酮(2∶8)清洗柱(再次弃去洗脱物)。将400ml氯仿：丙酮(1∶9)泵入柱中，通过tlc监测组分。收集含有glccer的组分。将400ml丙酮泵入柱中，收集含有glccer的组分。将上述步骤的glccer组分混在一起并通过真空蒸发器干燥。部分干燥物用于分析干重和glccer含量。再重复一次上述硅胶色谱以进一步纯化glccer。制备型tlc：制备型tlc(硅胶60，玻板plc，20cm×20cm，2mm厚)购自于日本默克密理博(merckmilliporejapan)。用1ml氯仿∶甲醇(7∶3)溶解前一步骤的干燥物，将样品点在plc上并通过氯仿∶甲醇∶水(65∶16∶2)展开。收集含有glccer的硅胶并悬浮于50ml氯仿∶甲醇(2∶1)中，接着通过棉质物随后0.5μmpvdf滤膜过滤。用真空蒸发器对含有glccer的滤液干燥过夜。测量总干重并通过hplc分析glccer样品的纯度。汇总：纯化步骤glccer干重纯度产率酵母残渣812mg800g0.10％100％乙醇提取和碱水解533mg35.5g1.50％66％丙酮沉淀319mg2.2g15％39％硅胶色谱(第一次)192mg383mg50％24％硅胶色谱(第二次)125mg150mg83％15％制备型tlc99.5mg100mg99.50％12％实施例2：检测glccer种类。我们使用tsqquantumultra(tm)三重四极质谱仪(thermoscientific，美国)通过esi-ms/ms(电喷雾电离质谱/质谱)分析上述获得的提取物中的glccer。样品悬浮于含有1mm甲酸铵+0.2％甲酸(在甲醇中)的缓冲液中。样品通过使用直接循环注射以10μl/min的速率输送到ms。在[m+h]+处于正离子模式时对样品进行分析。我们使用4.5kv的电源电压和20v的碰撞能。所有glccer谱(表1)是从m/z200到1000检测的。用20和45v两个不同的碰撞能生成ms-ms图谱。我们分别针对262.2和276.2的片段用母离子扫描检测具有4，8-鞘氨二烯醇(d18∶2)和9-甲基-4，9-鞘氨二烯醇(d19∶2)鞘氨醇碱的glccer种类。这些片段是从酰胺键的断裂以及后续脱水得来的。表1：实施例3：glccer的施用以及后续的隐球菌攻击我们从杰克逊实验室(jacksonlaboratory)购买了四周龄雌性cba/j小鼠并将它们分成四组，每组10只小鼠(n＝10)。用上述说明的方法对第1组和第3组中的小鼠按100μl最终体积中20μg/小鼠/天腹腔(ip)注射纯化的葡萄糖神经酰胺(glccer)。由于小鼠体重约25g，注射剂量为1.6mg/kg/天。将脂质(glccer)悬浮在由1.3％甲醇(在磷酸盐缓冲盐(pbs)中)制成的溶液中。因此，每天将100μl含有20μgglccer的1.3％甲醇(在pbs中)溶液腹腔注射入每只小鼠。该溶液在注射之间存储在-20℃。第2组和第4组的小鼠接受20μg/小鼠的glccer+不完全弗氏佐剂(fa)，第5组的小鼠接受仅为媒介物的对照(1.3％甲醇(在pbs中))。2周之后，用5x105个隐球菌细胞(新型隐球菌)经鼻内攻击第3、4和5组的动物，而第1和2组的动物接受pbs。小鼠以随意进食方式喂养并监测不适或疾病的迹象，记录它们的存活情况。在0、2、4和12周，从小鼠抽血通过elisa检查glccer抗体的存在。如图4所示，注射glccer(第1组)或glccer+fa(第2组)的未感染小鼠分别表现出100％和90％的存活率。在感染组中，glccer的施用提供了60％的保护(第3组)，glccer+fa(第4组)提供了70％的保护。相反，仅接受递送媒介物的感染组(第5组)经历100％病死率，具有25天的平均存活率。我们评估了隐球菌感染小鼠中的真菌组织负荷，结果在图5～7中示出。在接种仅媒介物的感染小鼠(第5组)中，我们在所有被检器官中发现了隐球菌细胞(脑、肺、肝、脾和肾；见图5)。我们还检测了四只存活90天的接种glccer的感染小鼠(第3组)。我们在从四只小鼠的每一只中获取的肺组织、两只小鼠的肝组织、两只小鼠的肾组织发现了真菌细胞。在这些动物的脑或脾中没有发现隐球菌细胞(见图6)。我们还检测了四只存活90天的接种glccer+弗氏佐剂的感染小鼠(第4组)。仅在肺(感染的主要部位，因为真菌细胞是经鼻内感染的)发现了真菌细胞。没有在脑、肝、肾或脾中发现隐球菌细胞。这些结果说明glccer+弗氏佐剂制剂在预防真菌细胞从肺向其它组织或器官扩散方面是最有效的。我们还注意到，第3组或第4组的小鼠感染90天之后从肺部找出的隐球菌细胞的数目为约～5x105个细胞，这与第0天注射的细胞数目相似。这表明接种glccer或glccer+弗氏佐剂抑制了肺中的真菌细胞增殖。我们检查了从第3、4和5组的小鼠获取的脑和肺组织，来自该研究的数据在图8和图9中示出。来自感染新型隐球菌但未治疗的小鼠(第5组)的脑组织于感染第25天在脑部显示大量的隐球菌浸润(见图8中的箭头)。相反，来自单独接种glccer(第3组)或接种glccer+弗氏佐剂(第4组)的小鼠的脑组织感染90天后显示没有隐球菌细胞。在肺组织中，我们观察到感染但未治疗的小鼠中隐球菌细胞的大量扩散(图9中的箭头，感染后25天)。相反，来自感染并用glccer(第3组)或glccer+弗氏佐剂(第4组)治疗的小鼠的肺，显示在被分析部分没有隐球菌细胞。将组织在10％福尔马林中固定和石蜡包埋，用于切片机切片和染色。通过蔡司显微镜拍摄照片。我们进行了另外的研究来检测小鼠血清中的抗葡萄糖神经酰胺抗体。我们在治疗方案的第0、14、28和84天从如图3所示治疗的小鼠采血。使血液凝集，通过离心收集血清。用纯化的glccer作为抗原来源通过夹心酶联免疫吸附试验(elisa)检测葡萄糖神经酰胺抗体(igm)。终止反应并用flitermax多板读数器(flitermaxmultiplatereader)记录450nm处的吸光度。我们检测了来自接受glccer的小鼠的血清中的抗glccerigm抗体，在感染新型隐球菌后84天时用glccer和fa免疫的小鼠中观察到最高水平(图10)。在相同的时间点(感染后84天)，我们分析了血细胞计数并进行了肝肾功能检测。如表2所示，尽管感染小鼠显示了更高的白血球计数(尤其是中性粒细胞)，白细胞总数并没有大的变化。表2：wbc：白细胞；ne：中性粒细胞；ly：淋巴细胞；mo：单核细胞；eo：嗜酸性粒细胞；ba：嗜碱性粒细胞。如表3所示，总的红细胞或血小板计数没有大的变化。表3：rbc，红细胞；hb：血红蛋白；mcv：平均红细胞体积；mch：平均红细胞血红蛋白；mchc，平均红细胞血红蛋白浓度；plt：血小板。如表4所示，肝肾功能没有大的变化。表4：alp：酸性磷酸酶；alt：丙氨酸转氨酶；ast：天冬氨酸转氨酶；tbili：总胆红素。实施例4：glccer的每周施用我们从杰克逊实验室购买了四周龄的雌性cba/j小鼠。在第1天，我们在完全弗氏佐剂的存在下对第1组的动物(n＝10)腹腔注射了50μgglccer。我们接着在不完全弗氏佐剂存在下每周注射50μgglccer，持续三周。在本实验中，第2组的小鼠(n＝10)仅接受pbs，第3组的小鼠(n＝10)未以任何方式治疗。首次注射glccer之后的两周，用5x105个隐球菌细胞攻击第1组和第2组的小鼠。小鼠以随意进食方式喂养并监测存活情况。在0、2、4、6以及12周，我们从小鼠抽血检查抗glccer抗体的存在。见图11。关于存活情况，未治疗小鼠(第3组)如预期地存活了。注射glccer和弗氏佐剂的小鼠如图11所示在用新型隐球菌攻击时表现出60％的保护，而仅用pbs治疗的小鼠在攻击后具有80％的死亡率。见图12。我们进行了检测每周注射glccer的小鼠血清中抗glccer抗体的研究(如此处所说明以及图11中所示的)。我们在第0天(注射前)，以及治疗程序开始之后14、28、42和84天采血。使血液凝集并通过离心收集血清。以纯化的glccer作为抗原来源用夹心elisa检测小鼠血清中的葡萄糖神经酰胺抗体。通过使用igm或igg特异性二抗确定igm和igg同种型。终止反应并用flitermax多板读数器(flitermaxmultiplatereader)记录450nm处的吸光度。结果表明glccer的施用刺激了抗体应答(igm)，尤其是在第84天。见图13。实施例5：用不同施用途径对不同品系小鼠施用glccer。我们从杰克逊实验室购买了六周龄的雌性cba/j小鼠和六周龄的雌性balb/c小鼠。我们将小鼠分成六组，cba/j小鼠构成第1、2和5组，balb/c小鼠构成第3、4和6组。在第0天，我们在完全弗氏佐剂存在下用50μgglccer注射第1～4组的小鼠；第1组和第3组中的小鼠经腹腔注射，第2组和第4组的小鼠经皮下注射。我们仅用用于治疗组的媒介物注射第5组和第6组的小鼠。首次治疗后一周，我们在不完全弗氏佐剂存在下用50μg的glccer注射第1～4组中的小鼠，我们在首次治疗之后每周重复施用，共持续三周。各组汇总在表5中。表5：我们在第0天和第0天后的2、4、6和8周采血检测特异性结合glccer的抗体的存在。本研究中的小鼠均未感染隐球菌。使所采血液凝集并通过离心收集血清。用纯化的glccer作为抗原来源通过夹心elisa在血清中检测抗葡萄糖神经酰胺抗体。用igm或igg特异性二抗检测igm和igg同种型。终止反应并用flitermax多板读数器(flitermaxmultiplatereader)记录450nm处的吸光度。结果显示经腹腔或皮下施用glccer，尤其是第一次剂量之后56天时抗glccerigm抗体的产生。两种施用途径之间的抗体产生没有明显差异。见图15。为了研究抗glccer抗体影响隐球菌细胞的机制，我们将隐球菌细胞与鼠巨噬细胞系j774进行共培养。我们将巨噬细胞在96孔细胞培养板上在含有10％fcs的dmem中于37℃、5％co2存在下生长14小时。我们用温dmem洗去未粘附的细胞。具有与j774细胞的目标细胞比为1∶1的隐球菌细胞(105个细胞/200μl)经不同浓度的glccer抗体调理(如图16所示)，并在脂多糖(lps)和干扰素(ifnγ)存在下添加到j774细胞中。我们用抗gxmigg抗体进行了类似的实验作为阳性对照。将细胞在含有10％fcs的dmem中于37℃、5％co2存在下孵育2小时，以便允许吞噬作用。2小时之后，用温dmem洗去未被吞噬的cn细胞。通过添加无菌水将巨噬细胞破裂并将一等份涂布到ypd琼脂平板上以确定菌落形成单位。我们观察到当用10μg或20μg抗glccerigm抗体调理cn细胞时吞噬作用略有增加，但该增加不明显。这些结果说明抗glccer抗体通过不依赖于刺激吞噬作用和胞内杀伤的机制提供抵御隐球菌的保护作用。当前第1页12