本发明涉及含有甲基盐霉素的组合物和使用甲基盐霉素来治疗保育猪的猪流行性腹泻病毒感染的方法。
本发明处于治疗与猪流行性腹泻病毒(pedv)感染相关症状的领域中。pedv是冠状病毒，其引起感染仔猪的最高达100%的死亡率，但在较大的猪中则具有有限的死亡率。在美国每天超过10,000只仔猪可能死于pedv。因此，pedv对于猪肉产品的价格和可得性具有显著经济影响。
目前在美国有两种pedv疫苗正在销售。两种疫苗均已批准用于怀孕母猪，其可通过母猪乳汁中的抗体为保育的仔猪(nursingpiglets)提供被动免疫。然而，这些疫苗的效力尚有待证明，疫苗必须通过注射个别地施用于母猪，且在仔猪的肠道终止大分子吸收后，母源性抗体的水平开始下降。
甲基盐霉素是通过链霉菌属(streptomycesspp)产生的聚醚离子载体，且可以从利迪链霉菌(s.lydicus)和s.granuloruber的培养物纯化。甲基盐霉素已经被许多国家的管理机构批准用于增加生长肥育猪中的增重。已显示，当将甲基盐霉素添加至感染导致登革热的黄病毒的培养的人类细胞时，甲基盐霉素会阻断所述病毒的复制(low,等人,antiviraltherapy16:1203-18,2011)。然而，已报导，当与饲料一起施用时，当甲基盐霉素以约83mg/kg饲料的浓度提供时，至少在泰妙菌素(tiamulin)存在的情况下，甲基盐霉素对保育猪是毒性的。
需要针对pedv的新治疗，尤其是为断奶后的猪(诸如保育猪)提供保护的疗法。可立刻向许多动物经口施用的疗法也是有利的。因为已显示pedv通过气溶胶化病毒传播，所以减少病毒从感染猪脱落(shedding)的疗法可促进遏止由该病毒引起的疾病。
因此，本发明提供治疗保育猪的pedv感染的方法，其包括将甲基盐霉素与经口可接受的载体一起施用于所述猪。经口可接受的载体选自动物饲料、除动物饲料之外的液体组合物和除动物饲料之外的固体组合物。此方法中所用的甲基盐霉素的浓度选自约30mg/kg、约40mg/kg、约50mg/kg或约60mg/kg的经口可接受的载体。本发明还提供治疗保育猪的pedv感染的方法，其包括将甲基盐霉素与经口可接受的载体一起施用于所述猪，其中经口可接受的载体选自动物饲料、除动物饲料之外的液体组合物和除动物饲料之外的固体组合物，且其中甲基盐霉素的浓度选自约30mg/kg、约40mg/kg、约50mg/kg和约60mg/kg经口可接受的载体。
本发明还提供治疗保育猪的pedv感染的方法，其包括将甲基盐霉素与动物饲料一起施用于所述猪，其中甲基盐霉素的浓度可为约30mg/kg、约40mg/kg、约50mg/kg或约60mg/kg经口可接受的载体。本发明还提供治疗保育猪的pedv感染的方法，其包括将甲基盐霉素与动物饲料一起施用于所述猪，其中甲基盐霉素的浓度为约60mg/kg经口可接受的载体。
此外，本发明提供用于治疗保育猪中的pedv感染的甲基盐霉素。可将甲基盐霉素与经口可接受的载体一起作为组合物提供给保育猪，所述经口可接受的载体诸如例如、但不限于动物饲料、除动物饲料之外的液体组合物或除动物饲料之外的固体组合物。此组合物中的甲基盐霉素的浓度可为约30mg/kg、约40mg/kg、约50mg/kg或约60mg/kg经口可接受的载体。本发明还提供用于治疗保育猪中的pedv感染的甲基盐霉素，其中甲基盐霉素与动物饲料一起施用，且甲基盐霉素的浓度为约30mg/kg至约60mg/kg动物饲料。本发明还提供用于治疗保育猪中的pedv感染的甲基盐霉素，其中甲基盐霉素与动物饲料一起施用且甲基盐霉素的浓度为约60mg/kg动物饲料。
此外，本发明提供与经口可接受的载体一起用于治疗保育猪中的pedv感染的甲基盐霉素，其中所述经口可接受的载体包括动物饲料、除动物饲料之外的液体组合物或除动物饲料之外的固体组合物，且其中甲基盐霉素的浓度可为约30mg/kg、约40mg/kg、约50mg/kg或约60mg/kg经口可接受的载体。此外，本发明还提供与动物饲料一起用于治疗保育猪中的pedv感染的甲基盐霉素，其中甲基盐霉素的浓度为约30mg/kg至约60mg/kg动物饲料。此外，本发明还提供与动物饲料一起用于治疗保育猪中的pedv感染的甲基盐霉素，其中甲基盐霉素的浓度为约60mg/kg动物饲料。
此外，本发明提供甲基盐霉素在制备用于治疗保育猪中的pedv感染的药物中的用途。所述药物可为包含甲基盐霉素与经口可接受的载体的组合物，所述经口可接受的载体诸如例如、但不限于动物饲料、除动物饲料之外的液体组合物或除动物饲料之外的固体组合物。此组合物中存在的甲基盐霉素的浓度可为约30mg/kg、约40mg/kg、约50mg/kg或约60mg/kg经口可接受的载体。此外，本发明提供甲基盐霉素在制备用于治疗保育猪中的pedv感染的药物中的用途，其中所述药物为甲基盐霉素与动物饲料且甲基盐霉素的浓度为约30mg/kg至约60mg/kg动物饲料。此外，本发明提供甲基盐霉素在制备用于治疗保育猪中的pedv感染的药物中的用途，其中所述药物为甲基盐霉素与动物饲料且甲基盐霉素的浓度为约60mg/kg动物饲料。
此外，本发明提供为保育猪提供抗病毒作用的组合物，其中所述组合物包含一定浓度的甲基盐霉素和经口可接受的载体。所述经口可接受的载体可包括动物饲料、除动物饲料之外的液体组合物或除动物饲料之外的固体组合物。上述组合物中的甲基盐霉素的浓度可为约30mg/kg、约40mg/kg、约50mg/kg或约60mg/kg组合物。此外，本发明提供为保育猪提供抗病毒作用的组合物，其中所述组合物包含一定浓度的甲基盐霉素与动物饲料，其中甲基盐霉素的浓度为约30mg/kg至约60mg/kg动物饲料。此外，本发明提供为保育猪提供抗病毒作用的组合物，其中所述组合物包含一定浓度的甲基盐霉素与动物饲料，其中甲基盐霉素的浓度为约60mg/kg动物饲料。
此外，本发明提供包含一定浓度的甲基盐霉素和经口可接受的载体的组合物，所述组合物为保育猪提供抗病毒作用，其中所述经口可接受的载体选自动物饲料、除动物饲料之外的液体组合物和除动物饲料之外的固体组合物，且其中甲基盐霉素的浓度可为约30mg/kg、约40mg/kg、约50mg/kg和约60mg/kg经口可接受的载体。
甲基盐霉素以及制备甲基盐霉素和使用甲基盐霉素作为针对革兰氏阳性细菌、厌氧细菌和真菌的有用治疗剂、作为抗球虫剂和作为增加反刍动物中的饲料利用的药剂的方法记载于美国专利号4,038,384(1977年7月26日公开)、美国专利号4,309,504(1982年1月5日公开)和美国专利号4,342,829(1982年8月3日公开)中。还参见berg等人,j.antibiot.31:1-6(1978)和“narasin,anewpolyetherantibiotic:discoveryandfermentationstudies，第38章，第471-485页，第18卷，developmentsinindustrialmicrobiology[微生物学会的出版物(1977)]。
如本文所用，术语“治疗(treating)”、“治疗(totreat)”或“治疗(treatment)”包括遏制、减缓、终止、减少、改善或逆转现有症状、病症、病况或疾病的进展或严重度。治疗可以预防或治疗地应用。
如本文所用，“保育猪”是已断奶、但尚不是生长肥育猪的猪。猪的断奶通常发生在约三周龄(约21日龄)时，但可早在一周龄(约七日龄)和晚至六周龄(约42日龄)时发生。断奶猪不再仅依赖于母猪的乳汁为食，而是食用固体饲料组合物。
如本文所用，“生长肥育猪”为至少约50磅体重或约十周龄的猪。术语“生长肥育(growing-finishing)”、“生长肥育(grow-finish)”和“生长肥育(grower-finisher)”是同义的。术语“猪”包括猪属(sus)的任何成员。
如本文所用，“动物饲料”包括为了材料的营养价值而由家畜食用的可食用材料。动物饲料包括饲料日粮(feedrations)(例如，满足动物的营养需求的组合物)且还包括未满足动物的营养需求的组合物。
在一个实施方案中，所述组合物包含甲基盐霉素的经口可接受的载体。“经口可接受的载体”包括适于经口施用的任何生理上可接受的载体。经口可接受的载体包括、但不限于适合用于动物饲料产品中使用和/或用于经口施用于动物的动物饲料组合物、水性组合物和液体和固体组合物。合适载体是本领域已知的，且包括描述于美国专利6,780,628中的那些。
以下实验实施例说明使用甲基盐霉素减少保育猪中的病毒脱落或改善病毒感染的症状。本发明并不限于此特定说明性实施例或任何优选实施方案，且本发明可应用于其他病毒的治疗，所述病毒诸如猪繁殖与呼吸综合征(prrs)病毒、猪圆环病毒(pcv)或猪冠状病毒。
实施例1
实验设计
81只断奶阶段(21.8+/-0.6天)无pedv感染的商业杂交仔猪(wilson’sprairieviewfarms,burlington,wi)到达现场，且6只用作预攻击期(第-7天至第0天)期间的潜在替代动物。在第0天，在临pedv攻击之前去除6只仔猪，导致15个围栏各含有5只仔猪/围栏(n=75)动物。每个治疗有5个围栏。为了平衡区组(block)内的哨兵仔猪(sentinelpiglets)，使用总共39只一种性别的仔猪和36只另一性别的仔猪。估计每个治疗组使用5个围栏(25只仔猪)以检测治疗组之间在生长性能和病毒脱落的发生率方面的显著差异(p<0.10)。
将75只仔猪随机指派至三个治疗组之一：对照(无离子载体)、甲基盐霉素(30mg/kg)和甲基盐霉素(60mg/kg)。在第0天用pedv暴露之前，使其适应其环境并每天饲喂，持续七天。攻击后治疗持续14天。来自三个治疗组的猪经口施用4x104tcid50/ml的pedv分离株pedv/usa/nc/2013/49469(collegeofveterinarymedicine,iowastateuniversity)。每天监测仔猪临床参数，腹泻、抑郁和消瘦的临床评分，食物食用速率和体重变化速率中的变化，并每天取病毒拭子以测定病毒脱落。
统计学方法
病毒脱落值通过sas(sas,cary,nc)的rmanova和procmixed程序来评估。用于分析的其他变量包括生长性能数据(平均每日增重或adg；平均每日摄食量或adfi；和饲料效率(每单位食用的饲料的体重增加的单位)或g:f)、腹泻、抑郁和消瘦评分的发生率和严重度和肠组织学评分和免疫组织化学。生长性能结果的分析使用广义线性混合模型和sas的procmixed程序来进行。
评分数据(腹泻、抑郁和消瘦)的发生率和严重度通过每天的频率和平均评分来概述。
膳食制剂
膳食制剂在provimi(lewisburg,oh)制造并以餐料形式饲喂。通过minnesotavalleytestinglaboratories(newulm,mn)分析膳食的组成，且发现营养分析值类似于配制的水平。甲基盐霉素水平通过covancelaboratories(greenfield,in)分析并发现其为0mg/kg、29.8mg/kg和64.1mg/kg，其分别类似于0mg/kg、30mg/kg和60mg/kg的配制的水平。
在实验膳食中未检测到莱克多巴胺(ractopamine)(最后一次饲喂药物)。
生长性能
甲基盐霉素包含水平对平均体重(bw)、平均每日增重(adg)、平均每日摄食量(adfi)、饲料效率(g:f)和饲料转化率(f:g)的作用显示于表1中。
表1.甲基盐霉素包含水平对用pedv攻击的保育猪的生长性能的作用的最小二乘均数
*平均值与对照处理显著不同(p<0.10)。
1第-7天：动物到达测试设施；分配至研究。包括额外6只猪。
2第0天：用pedv攻击猪。
3第5天：从围栏去除哨兵动物(1只猪/围栏)，将其安乐死并尸检。
4第14天：研究结束。
与对照(0mg/kg)相比，饲喂30mg/kg和60mg/kg甲基盐霉素在数值上增加总体adg(分别为7.7%和7.7%)和g:f(分别为7.9%和5.9%)。
与对照相比，在第0天至第5天时段中饲喂30mg/kg和60mg/kg甲基盐霉素增加(p<0.10)adg(分别为58.3%和100%)(表1)，尽管在第-7天至第0天时段中饲喂60mg/kg甲基盐霉素导致减小(p<0.10)的adg(18.8%)。另外，与0mg/kg甲基盐霉素相比，在第0天至第5天时段中饲喂60mg/kg、而非30mg/kg甲基盐霉素，增加(p<0.10)g:f(78.7%)。在第5天至第14天时段中，对于adg、adfi、g:f或f:g，没有统计学差异。甲基盐霉素水平对总体(第0天至第14天)生长性能没有作用(p>0.10)。
临床得分
表2指示用于测量腹泻、抑郁和消瘦的评分系统。表3比较其膳食包括0mg/kg、30mg/kg或60mg/kg甲基盐霉素的保育猪中腹泻、抑郁和消瘦的平均评分。
表2.肠临床观察评分系统
经14天时段测量的腹泻评分的平均值随着甲基盐霉素水平增加而在数值上减小(对于0mg/kg、30mg/kg和60mg/kg，分别为1.49、1.45和1.37)。腹泻严重度随着甲基盐霉素水平增加而减小(对于0mg/kg、30mg/kg和60mg/kg，分别为3.16、2.72和2.48；表3)。
经14天时段测量的抑郁评分的平均值未受甲基盐霉素水平影响，然而，注意到动物中观察到的抑郁的低发生率(对于0mg/kg、30mg/kg和60mg/kg甲基盐霉素，分别为5、4和3只动物)。抑郁的严重度随着甲基盐霉素水平增加而下降，尽管这基于相对少展现该病况的动物(表3)。
甲基盐霉素水平对于经14天时段测量的消瘦评分的平均值或严重度的作用很小(表3)。
表3.甲基盐霉素包含水平对用pedv攻击的保育猪的腹泻评分的作用的平均值
1严重度：经14天时段针对每只猪观察到的最差评分的平均值。
病毒脱落
比较甲基盐霉素水平(0mg/kg、30mg/kg、60mg/kg)对保育猪的一天内病毒脱落的作用(表4)和脱落pedv的保育猪的百分比的作用(表5)。从研究的第0天至第14天每天从所有测试的猪收集粪便拭子。每一样品标记有猪标识、围栏号和样品日期。所有样品在收集之时冷冻并储存，直至需要用于分析。仅将从第0天、第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天和第14天收集的粪便拭子样品送去用于分析。将粪便拭子样品送至爱荷华州兽医诊断实验室(iowastateveterinarydiagnosticlaboratory,isvdl)并使用实时rt-pcr分析以测定pedv的病毒脱落。
表4.一天内甲基盐霉素包含水平对用pedv攻击的保育猪的病毒脱落的作用的最小二乘均数
*在一天内，平均值与对照处理显著不同(p<0.10)。
1值为统计学分析前转换的ln(计数+1)。
2呈现的值仅来自对于脱落测试阳性的猪。数据集中不包括测试阴性(即，0)的猪的值。
当与对照相比时，饲喂30mg/kg甲基盐霉素的猪在研究的第2天和第3天具有较低(p<0.10)的病毒脱落，并直至研究的第7天一致地具有数值上较低的病毒脱落。饲喂60mg/kg甲基盐霉素的猪在研究的第2天、第3天、第4天、第5天和第6天具有较低(p<0.10)的病毒脱落，并在研究的第7天和第8天具有数值上较低的病毒脱落(表4)。
甲基盐霉素水平对脱落pedv的猪的百分比没有作用(p>0.10)，但随着甲基盐霉素水平增加，脱落的持续时间通常减小。
组织学
分析甲基盐霉素包含水平对肠组织学评分和免疫组织化学的作用。随着甲基盐霉素水平从0mg/kg、30mg/kg、60mg/kg增加，组织学评分从2减少至0，而免疫组织化学评分仅在60mg/kg水平下减少(从3至2)，尽管差异并不显著(p>0.05)。