混源萜类化合物D1399在制备抗肺癌药物中的应用的制作方法

本发明属于药物化学技术领域，更具体地，涉及一种混源萜类化合物D1399在制备抗肺癌药物中的应用。

背景技术：

在各种疾病中，癌症是致人死亡的主要疾病之一，其中肺癌己成为全世界癌症死亡的首要原因；每年超过100万的人因肺癌死亡，而且死亡率40年间上升近10倍。全世界肺癌每年新增病例约180万，其中三分之二发现时已处于晩期，肺癌确诊后患者5年生存率只有约10％。自20世纪40年代第一种化疗药物氮芥发现以来，人们一直在寻找高效低毒的抗肿瘤药物，尽管目前已有的抗肿瘤药物能治愈部分肿瘤，对大多数肿瘤也有一定疗效，但仍存在治疗有效率低、选择性差、毒副反应大及瘤细胞耐药等问题，因此，从不同途径寻找高效、低毒、特异的抗肿瘤药物仍是肿瘤药物治疗的当务之急。随着细胞分子生物学的发展，可将癌症定义为细胞周期异常性疾病。癌症从细胞水平上可以看作是调控细胞周期或细胞凋亡的某一个或某几个环节发生紊乱，使癌化细胞无限制地盲目无序增殖的一种状态。细胞凋亡诱导剂能通过调控细胞凋亡的生物过程，控制和矫正癌化细胞盲目无序增殖的状态。因此，新的细胞凋亡诱导剂有可能开发成新的化疗药物用于治疗癌症，而检测细胞凋亡诱导作用的生物活性指标则可用于筛选和发现新的抗癌活性物质。

混合生源萜(混源萜)是一类由聚异戊烯途径与其它生物合成途径混杂偶联所产生的混源代谢产物。混源代谢产物的生物合成过程中往往会有众多杂原子的引入，使得分子结构中形成不同的极性中心，具有较强的反应活性，因而容易与生物大分子相结合。因此，混源萜类化合物已是药物先导化合物的重要来源。

技术实现要素：

本发明的目的在于根据现有技术中的不足，提供了一种混源萜类化合物D1399在制备抗肺癌药物中的应用。

本发明报道了D1399在体外对人肺癌细胞生长的抑制作用和初步作用机制，为进一步开发的抗肿瘤新型候选药物奠定基础。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了混源萜类化合物D1399在制备抗肺癌药物中的应用，所述混源萜类化合物D1399的结构式如式(Ⅰ)所示：

本发明的混源萜类化合物D1399分子量为503。其结构运用核磁共振(H-NMR,13C-NMR,HSQC,HMBC)、高分辨质谱(ESI-MS)等现代波谱技术进行测定。D1399的合成方法可以参考现有技术，例如US20040127540A。

本发明通过体外实验证明来D1399具有很强的抗肿瘤活性，可作为治疗肺癌等其他实体肿瘤的先导化合物，可用于制备抗肿瘤药物。

进一步地，本发明在体外抗肺癌细胞试验中发现，所述D1399对人肺癌细胞A549和人肺腺癌细胞Calu3的生长抑制作用的IC50分别为4.69μM和2.44μM，体外抑制肺癌细胞生长活性显著。

因此，本发明提供一种对罹患癌症的任何哺乳动物(特别是人类)进行化合物联合治疗的方法，该方法包括给予患者治疗有效量的本发明化合物或其药用组合物。

进一步地，所述药物还包括药学上可接受的载体或稀释剂。

“药学上可接受的载体”指药物中的非活性成分，例如但不限于：碳酸钙、磷酸钙、各种糖(例如乳糖、甘露醇等)、淀粉、环糊精、硬脂酸镁、纤维素、碳酸镁、丙烯酸聚合物或甲基丙烯酸聚合物、凝胶(gelatin)、水、聚乙二醇、丙二醇、乙二醇、蓖麻油或氢化蓖麻油或多乙氧基氢化蓖麻油、芝麻油、玉米油、花生油等。

“药学上可接受的稀释剂”如淀粉(如玉米淀粉、小麦淀粉、马铃薯淀粉等)、乳糖、糊精、蔗糖、预胶化淀粉、微晶纤维素、无机盐类(如磷酸氢钙、硫酸钙、残酸钙等)和甘露醇等。

药物可以是药学上可接受的任意一种剂型。包括具有适当组成的任何固体(片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂)等或液体(溶液剂、混悬剂或乳剂)或者口服、局部给药或肠胃外给药，它们可以包含所述纯化合物或者与任何载体或其它药理学活性化合物相结合。当进行肠胃外给药时，需要对这些组合物进行灭菌处理。

本发明化合物或组合物的给药可以通过任何适当的方法进行，如静脉输注、口服制剂、腹膜内和静脉内给药。我们优选输注时间最多为48小时。包含本发明化合物的药用组合物可以通过以缓释配方中的脂质体或毫微球包囊方式或通过其它标准传递方式进行给药。

所述化合物的正确剂量将根据具体剂型、应用模式和具体部位、患者及所要治疗的肿瘤而变化、还需考虑其它因素如年龄、体重、性别、饮食、给药时间、排泄速率、患者症状、药物结合、反应敏感性和疾病严重程度，可以在最大允许剂量范围内连续给药或者定期给药。

本发明的化合物和组合物可以与其它药物一起使用以提供联合治疗。所述其它药物可以形成该同一组合物的一部分，或者作为单独组合物在相同时间或不同时间进行给药，对其它药物的特性没有特别限制。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明在体外抗肺癌细胞生长模型中，通过四甲基二氮唑蓝(MTT)比色法检测到D1399对人肺癌细胞A549和人肺腺癌细胞Calu3的生长抑制作用的IC50分别为4.69μM和2.44μM，体外抑制肺癌细胞生长活性显著。利用实时无标记细胞实时分析技术(RTCA)检测到不同浓度的D1399对人肺癌细胞系A549生长具有浓度依赖性和时间依赖性，表现出作为抗肺癌药物的优良特性。

通过对D1399抗肺癌的分子机制的研究，表明D1399通过影响肺癌细胞的Caspase3、Caspase8、Caspase9、PARP蛋白的表达量，诱导细胞凋亡来实现抗肺癌的活性，更增加了其成为候选抗肺癌药物的可能，为进一步临床试验奠定了理论基础。

附图说明

图1是本发明实施例1中人肺癌细胞A549经不同浓度的D1399作用不同时间后的形态学变化的结果图。

图2是本发明实施例2中RTCA检测D1399对人肺癌细胞A549体外时间依赖性和浓度依赖性抑制细胞增殖的生物学活性的一个优选实施例的结果图。

图3是本发明实施例3中TUNEL免疫荧光染色法检测D1399诱导肺癌细胞A549凋亡的生物学活性图。

图4是本发明实施例3中TUNEL免疫荧光染色法检测D1399诱导肺癌细胞A549凋亡的对照组和给药组的阳性细胞的计数结果图。

图5是本发明实施例3中利用Western Blotting技术检测D1399处理人肺癌细胞A549后凋亡相关蛋白的表达水平的图。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

实施例1 D1399对人肺癌A549细胞生长和形态的影响

A549细胞消化后计数，按每孔2.0×10⁶个细胞分别接种至P60培养皿中，置于37℃、5％CO2孵箱中孵育培养。24h后更换为含浓度依次为0、2、4、8μM的D1399的培养基，分别继续培养4、8、12h后，倒置显微镜下观察细胞形态及生长的变化。

如图1所示，D1399对人肺癌A549细胞的生长具有显著抑制作用。2μM D1399处理8h后，A549细胞密度较对照组明显降低，随着药物浓度的增加，细胞密度进一步显著降低，具有浓度依赖性。8μM D1399处理4h后，A549细胞密度较对照组明显降低，随着药物浓度的增加，细胞密度进一步显著降低，8h后细胞出现大量死亡。在光学显微镜下放大200×可观察细胞出现典型的细胞凋亡形态学变化，贴壁细胞开始出现体积变小，变形，皱缩，变圆，脱落。在光学显微镜下放大400×可观察脱落细胞的胞膜出现泡化现象。

实施例2 D1399抑制人肺癌细胞生长的剂量-效应、时间-效应关系

1、采用四甲基二氮唑蓝(MTT)比色法检测D1399对人肺癌细胞生长的影响人肺腺癌癌细胞系A549、Calu3

MTT比色法具体实验步骤：将人肺癌细胞A549、人肺腺癌细胞Calu3消化后计数，按每孔1.0×10⁴个细胞分别接种至96孔细胞培养板中，置于37℃、5％CO2孵箱中孵育培养。24h后更换为含浓度依次为0、0.08、0.4、2、10、50μM的D1399的培养基，每个浓度均设3个平行复孔，继续培养48h后，显微镜下观察细胞形态及生长的变化。随后每孔加入5mg/mL MTT溶液20μL，37℃作用4h，离心后弃上清液，加入DMSO 200μL，振荡器振荡10min充分溶解结晶，置酶标仪上测定波长为490nm下的吸光度A值，按以下公式计算抑制率。细胞生长抑制率(％)＝(对照组平均A值-实验组平均A值)/对照组平均A值×100％。对照组即D1399浓度为0的培养孔，应用SPSS软件进行数据统计分析，并计算半数抑制浓度(IC50)。

通过MTT比色法检测到D1399对人肺癌细胞A549和人肺腺癌细胞Calu3的生长抑制作用的IC50分别为4.69μM和2.44μM，体外抑制肺癌细胞生长活性显著。

2、采用实时无标记动态细胞分析技术(RTCA，Real Time Cellular Analysis)D1399抑制人肺癌细胞生长的剂量-效应、时间-效应关系

RTCA具体实验步骤：将人肺癌细胞A549消化后计数，配置成5.0×10⁴个/mL的细胞悬液，在E-Plate 16的孔中加入50μl培养基，检测基线正常后再孔中加入100μl混合均匀的A549细胞悬液，每孔中细胞数目为5.0×10³个，将E-Plate 16置于超净台中室温放置30min，将E-Plate 16放到培养箱中的RTCA Station上，在系统自动扫描后，开始实时动态检测细胞增殖。24h后，每孔按加入梯度稀释为0、1、2、4、8、16μM的D1399，继续实时动态检测细胞增殖。

通过RTCA检测到D1399对人肺癌A549细胞的生长抑制作用呈现明显的浓度依赖性和时间依赖性。16μM的D1399作用后，细胞立即开始死亡，6h后全部死亡，8μM的D1399作用后细胞立即停止生长10h后开始死亡，24h后细胞全部死亡，4μM的D1399作用后，细胞生长速度减慢，24h后细胞生长减慢50％。2μM的D1399和1μM的D1399作用24h后，细胞生长速度减慢，见图2。

实施例3 D1399抗肺癌机制的研究

1.利用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测D1399体外诱导肺癌细胞的凋亡

将A549细胞消化后计数，按每孔1.0×10⁵个细胞分别接种至已铺有盖玻片的24孔细胞培养板中，24h后用3μM、4.5μM、6μM的D1399处理细胞。7h后弃去培养基，用4％甲醛固定细胞30min，用PBS洗涤三次，每次5min。随后用1％TritonX-100处理25min，PBS洗涤三次，每次5min。用100μl平衡缓冲液覆盖细胞，在室温平衡5～10min后，吸弃平衡缓冲液，将50μl TdT反应缓冲液加至细胞上后，用塑料盖玻片盖在细胞上以防止反应液挥发，将培养板置于湿盒中于37℃避光反应60min。吸弃反应液，加入2×SSC室温作用15min，用PBS洗涤三次，每次5min。最后将盖玻片上的细胞避光干燥过夜，次日加含DAPI的Anti-Fade封片。在荧光显微镜下进行观察并拍照保存图片，TUNEL染色阳性荧光信号呈绿色，DAPI荧光信号呈蓝色，并取十个视野进行TUNEL染色阳性细胞计数后计算百分比，应用SPSS 10.0统计软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析，检验过程以p<0.05表示具有统计学意义。

如图3和4所示，通过TUNEL检测到人肺癌细胞A549分别经3μM、4.5μM和6μM的D1399作用7小时后，实验组出现不同程度的TUNEL染色阳性的细胞，分别为28.18％、47.67％和70.47％；而对照组未经D1399作用的细胞基本未见TUNEL染色阳性出现。

2.免疫印迹法(Western Blotting)检测凋亡相关蛋白的表达

将A549细胞消化后计数，按每孔2.0×10⁶个细胞分别接种至P60培养皿中，置于37℃、5％CO2孵箱中孵育培养。24h后更换为含浓度依次为0、3、4.5、6μM的D1399的培养基，18h后收集细胞及上清，PBS洗涤3遍，加入含6％SDS的细胞裂解液处理。利用BCA试剂盒测定蛋白含量。然后进行蛋白电泳，浓缩胶60V，分离胶80V。电泳至溴酚蓝到达分离胶底部时，将蛋白转至PDVF膜，70V稳压电转移3小时。5％脱脂奶粉室温封闭1小时后，1∶500加入抗人Caspase9、Caspase8和PARP抗体4℃孵育过夜。用TBST洗涤3次，每次15分钟。辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1小时。再用TBST洗涤3次，每次15分钟。暗室中按0.05mL/cm将膜与底物发光液在室温下孵育1分钟，压片夹压片30min，洗片机曝光、洗片。

通过Western Blotting技术进一步对D1399处理人肺癌细胞A549后凋亡相关蛋白Caspase9、Caspase8、Caspase3和PARP的前体和切割带进行检测，发现随着药物浓度的增加，上述蛋白的前体逐渐减少，切割带逐渐增加，表明凋亡信号同路激活，详见图5。GAPDH作为上样的对照。结果说明D1399作用后的A549细胞同时通过Caspase依赖的内源性和外源性途径发生细胞凋亡。