肿瘤曲妥珠单抗靶向anti‑miR‑21纳米粒子及其制备方法与流程

技术特征：

1.肿瘤曲妥珠单抗靶向anti-miR-21纳米粒子，其特征在于：所述肿瘤曲妥珠单抗靶向anti-miR-21纳米粒子为抗肿瘤曲妥珠单抗靶向载药高分子负载anti-miR-21的纳米粒子，所述抗肿瘤曲妥珠单抗靶向载药高分子的结构式如式(I)所示：

2.肿瘤曲妥珠单抗靶向anti-miR-21纳米粒子的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)二甲酰亚胺化聚乙二醇的制备：

(1.1)磺酰化聚乙二醇(sTO-PEG-OTs)的制备：在三乙胺存在下，以PEG2000和对甲苯磺酰氯(Tscl)为原料制得磺酰化聚乙二醇(sTO-PEG-OTs)；

(1.2)二甲酰亚胺化聚乙二醇(PI-PEG-PI)的制备：磺酰化聚乙二醇(sTO-PEG-OTs)和邻苯二甲酰亚胺钾反应，制得二甲酰亚胺化聚乙二醇(PI-PEG-PI)；

反应式如下：

(2)一端氨基被Boc保护的两端氨基化的聚乙二醇(Boc-PEG-NH2)的制备：

(2.1)两端氨基化聚乙二醇(NH2-PEG-NH2)的制备：二甲酰亚胺化聚乙二醇(PI-PEG-PI)和水合肼反应，制得两端氨基化聚乙二醇(NH2-PEG-NH2)；

(2.2)一端被Boc保护的两端氨基化聚乙二醇的制备：在碳酸氢钠(NaHCO3)存在下，两端氨基化聚乙二醇(NH2-PEG-NH2)和二碳酸二叔丁酯(Boc2O)、1,4-二氧六环(1,4-dioxane)反应，制得一端被Boc保护的两端氨基化聚乙二醇(Boc-PEG-NH2)；

反应式如下：

(3)PEG端氨基化的PEG-PCL共聚物(Boc-PEG-PCL)的制备：

(3.1)末端氨基保护的聚乙二醇-聚己内酯(Boc-PEG-PCL)的制备：在氮气保护下，以辛酸亚锡(stannous octoate)为催化剂，一端被Boc保护的两端氨基化聚乙二醇(Boc-PEG-NH2)和己内酯(ε-CL)开环聚合反应，制得末端氨基保护的聚乙二醇-聚己内酯(Boc-PEG-PCL)；

(3.2)聚乙二醇-聚己内酯(NH2-PEG-PCL)的制备：末端氨基保护的聚乙二醇-聚己内酯(Boc-PEG-PCL)和三氟乙酸(Trifluoroacetic acid,TFA)反应，制得聚乙二醇-聚己内酯(NH2-PEG-PCL)；

反应式如下：

(4)曲妥珠单抗-聚乙二醇-聚己内酯(HER-PEG-PCL)的制备；

在碳二亚胺(EDAC)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Suflo-NHS)存在下，聚乙二醇-聚己内酯(NH2-PEG-PCL)末端的氨基和曲妥珠单抗末端的羧基发生酰胺化反应，制得曲妥珠单抗-聚乙二醇-聚己内酯(HER-PEG-PCL)；

反应式如下：

(5)曲妥珠单抗靶向载药高分子纳米粒子的制备：

将曲妥珠单抗-聚乙二醇-聚己内酯(HER-PEG-PCL)冷冻干燥，即得曲妥珠单抗靶向载药高分子纳米粒子；

(6)负载anti-miR-21的曲妥珠单抗靶向高分子纳米粒子(HER-PEG-PCL-anti-miR-21)的制备：

采用双乳液溶剂挥发法制备负载anti-miR-21的曲妥珠单抗靶向高分子纳米粒子(HER-PEG-PCL-anti-miR-21)：将曲妥珠单抗-聚乙二醇-聚己内酯(HER-PEG-PCL)溶于有机溶剂中，再加入anti-miR-21混匀，再滴入浓聚乙烯醇水溶液，超声反应；产物倒入稀聚乙烯醇水溶液中，超声分散；室温搅拌使有机溶剂挥发，离心、洗涤、冷冻干燥，即得负载anti-miR-21的曲妥珠单抗靶向高分子纳米粒子。

3.根据权利要求1所述的肿瘤曲妥珠单抗靶向anti-miR-21纳米粒子的制备方法，其特征在于：步骤(1.1)中，反应温度为室温，反应时间为18-30h；PEG2000和对甲苯磺酰氯(Tscl)的用量比为1:(2-3)，三乙胺在反应溶剂中的质量百分比浓度为0.3-1.0％。

4.根据权利要求1所述的肿瘤曲妥珠单抗靶向anti-miR-21纳米粒子的制备方法，其特征在于：步骤(1.2)中，反应温度为110-130℃，反应时间为8-16h；磺酰化聚乙二醇(sTO-PEG-OTs)和邻苯二甲酰亚胺钾的用量比为1:(2-3)。

5.根据权利要求1所述的肿瘤曲妥珠单抗靶向anti-miR-21纳米粒子的制备方法，其特征在于：步骤(2.1)中，反应温度为70-90℃，反应时间为8-16h；二甲酰亚胺化聚乙二醇(PI-PEG-PI)和水合肼的用量比为1:(2-3)。

6.根据权利要求1所述的肿瘤曲妥珠单抗靶向anti-miR-21纳米粒子的制备方法，其特征在于：步骤(2.2)中，反应温度为-5℃-5℃，反应时间为18-30h；两端氨基化聚乙二醇(NH2-PEG-NH2)和二碳酸二叔丁酯(Boc2O)的用量比为1：(1-2)；1,4-二氧六环(1,4-dioxane)在反应溶剂中的质量百分比浓度为1.5-2.0％；碳酸氢钠(NaHCO3)在反应溶剂中的质量百分比浓度为1.5-2.0％，反应体系pH为7.0-7.5。

7.根据权利要求1所述的肿瘤曲妥珠单抗靶向anti-miR-21纳米粒子的制备方法，其特征在于：步骤(3.1)中，反应温度为120-140℃，反应时间为4-8h；一端被Boc保护的两端氨基化聚乙二醇(Boc-PEG-NH2)和己内酯(ε-CL)的用量比为1：(1.0-1.5)。

8.根据权利要求1所述的肿瘤曲妥珠单抗靶向anti-miR-21纳米粒子的制备方法，其特征在于：步骤(3.2)中，反应温度为室温，反应时间为0.5-2h；末端氨基保护的聚乙二醇-聚己内酯(Boc-PEG-PCL)和三氟乙酸(Trifluoroacetic acid,TFA)的用量比为1:(4-6)。

9.根据权利要求1所述的肿瘤曲妥珠单抗靶向anti-miR-21纳米粒子的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，反应体系pH8.0-9.0，反应温度为室温，反应时间为8-12h；聚乙二醇-聚己内酯(NH2-PEG-PCL)和曲妥珠单抗的用量比为1：(1-2)；步骤(5)中，冷冻干燥工艺具体为：将曲妥珠单抗-聚乙二醇-聚己内酯(HER-PEG-PCL)溶于体积比(1-3)：2的乙醇和丙酮混合溶液中，得到的溶液滴入20-30倍等体积的冷存水中，减压抽除有机溶剂，即得。

10.根据权利要求1所述的肿瘤曲妥珠单抗靶向载药高分子纳米粒子的制备方法，其特征在于：步骤(6)中，所述有机溶剂为二氯甲烷；所述曲妥珠单抗-聚乙二醇-聚己内酯(HER-PEG-PCL)、anti-miR-21、有机溶剂、浓聚乙烯醇水溶液、稀聚乙烯醇水溶液的用量比为(2-5)mg:(12-30)μg:0.1mL:(0.5-0.7)mL:(0.2-0.3)mL；所述浓聚乙烯醇水溶液的质量百分比浓度为3-8％；超声反应功率为10-30W，超声反应时间为20-40s；所述稀聚乙烯醇水溶液的质量百分比浓度为0.1-0.5％；超声分散功率为10-30W，超声分散时间为20-40s。