本发明涉及茯苓酸A的新药物应用，具体涉及茯苓酸A用于制备利尿药物的应用。
背景技术：
茯苓为多孔菌科真菌茯苓(Poria cocos)的干燥菌核，别名松苓、松薯等。茯苓始载于《神农本草经》，茯苓性平，味甘、淡，归心、肺、脾、肾经。茯苓是一味常用的健脾和胃、利水渗湿、宁心安神的中药；临床使用分茯苓、茯神、赤茯苓等，茯苓自古以来就是一味药食两用、非常重要的中药，有十药九茯苓之说，将茯苓列为上品。茯苓的主要活性成分为茯苓多糖和四环三萜类化合物。茯苓中四环三萜类化合物具有抗癌、抗肿瘤、免疫调节、体内拮抗醛固酮等活性。
茯苓皮为茯苓菌核的外皮，茯苓加工时仅使用茯苓内部菌核即白茯苓，加工白茯苓时茯苓外皮和切割下的残块都被当成废料处理，造成了茯苓的极大浪费。研究表明茯苓皮中的四环三萜类化学成分含量远远高于茯苓菌核内部的白茯苓中的含量。茯苓皮四环三萜酸类化学成分种类众多，羊毛甾烷型四环三萜类化合物包括去氢齿孔酸、3-表去氢土莫酸、齿孔酸、3-表去氢土莫酸、去氢土莫酸、去氢齿孔酮酸、茯苓酸等。3，4-裂环羊毛甾烷型四环三萜类化合物包括茯苓新酸A、茯苓新酸B、茯苓新酸C、茯苓新酸D、茯苓新酸E、茯苓新酸F、茯苓新酸AM、茯苓新酸AE、茯苓新酸BM、茯苓新酸CE、茯苓新酸DM。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于克服药吲达帕胺、呋塞米、氯噻嗪、氯噻酮等上述利尿药物的副作用，为用茯苓酸A制备的药物提供一种新用途。
本发明提供了茯苓酸A用于制备利尿药物的应用。
发明人的结果表明茯苓酸A对生理盐水负荷的水潴溜大鼠有显著的利尿作用，茯苓酸A有保钾排钠的利尿效应，茯苓酸A可为临床提供一种新的醛固酮拮抗剂或选择性醛固酮受体阻滞剂的利尿候选药物。
附图说明
图1为不同时间茯苓酸A、螺内酯及呋塞米给药组灌胃给药对大鼠尿量的影响。
具体实施方式
本发明用茯苓酸A制备利尿药物以常规药用制剂的形式来使用；所述的常规药物用制剂含作为活性组分在制剂中与药学上可接受的载体，如适宜于肠胃内和肠胃外给药的有机或无机的固体或液体赋形剂混合，该药用制剂可以是固体形式如胶囊剂、片剂、丸剂、散剂、颗粒剂等。上述制剂中可含有稳定剂、润湿剂、辅料和其它常用的添加剂，如玉米淀粉、硬脂酸、橄榄油、柠檬酸、乳糖、乙二醇、硬脂酸镁、明胶、石膏粉、琼脂、抗坏血酸等。上述的制剂可按照各种制剂常规的制备工艺制成。
为了验证茯苓酸A利尿的效果，发明人以生理盐水负荷的水潴溜正常大鼠模型进行了利尿活性实验，实验药物、动物、仪器、方法及结果如下：
1.实验药物
螺内酯片：杭州民生药业有限公司产品，批号T15L035，生产日期151225；呋塞米片：上海朝晖药业有限公司产品，批号1602N14，生产日期20160225；茯苓酸A按照上述提取制备工艺进行制备，通过1H NMR、13C NMR、MS、UV和IR等波谱与光谱技术进行鉴定结构。
2.实验动物
体重180-220g的雄性Sprague-Dawley大鼠购买于西安交通大学医学部实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK(陕)2012-003。
3.实验仪器
安徽淮北正华生物仪器有限公的ZH-B6型大鼠代谢笼，TD型电子天平，美特列-托利多十万分子一分析天平。
4.实验方法
1)茯苓酸A的利尿实验的动物分组、实验药物剂量及尿液收集方法
雄性SD大鼠随机分为6组：正常对照组、茯苓酸A小剂量组(5mg/kg)、茯苓酸A中剂量组(10mg/kg)、茯苓酸A大剂量组(20mg/kg)、螺内酯对照组(40mg/kg)、呋塞米对照组(20mg/kg)，每组8-12只大鼠，禁食不禁水12h后各组均按5ml/100g体重灌胃给予生理盐水，并用手轻压腹部使其排尽余尿，给药各组均按1ml/100g体重灌胃，正常对照组给自来水1ml/100g。给药后立即将大鼠分别放入不锈钢的大鼠代谢笼，每笼1只大鼠。给药后在大鼠代谢笼下面放置带刻度的试管，连续收集6小时尿液，记录每只动物每小时的尿量。
2)药效计算
计算每组动物每小时的尿量的平均值和标准误，计算6h每组动物总尿量的平均值和标准误，测定尿液pH值，测定尿液中电解质钠(Na+)、钾(K+)及氯(Cl-)的含量，进行统计学分析。结果均以平均值±SE表示，采用t检验，计算t，P值，将治疗组与空白组进行组间差异性比较，t检验，P<0.05为有显著性差异；P<0.01为有非常显著性差异，判断茯苓酸A对生理盐水负荷的水潴溜正常大鼠模型的利尿效果。
3)实验结果
(1)茯苓酸A的制备及结构鉴定
茯苓酸A的提取制备工艺：经过干燥的茯苓皮药材粉碎后，用5倍体积的乙酸乙酯浸泡2天，开始渗漉，浓缩提取物，回收乙酸乙酯，得棕色乙酸乙酯提取物。乙酸乙酯提取物用MCI填料拌样，上MCI色谱柱，采用40:60-70:30甲醇-水梯度洗脱；洗脱液浓缩进一步上200-300目的硅胶柱，石油醚-乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，合并浓缩，最后得茯苓酸A。
黄色粉末，C31H46O5,MW:498,EI-MS m/z:497[M-H]－,479[M-H2O]－,423[M-CH2CH2CO2H]－；1H NMR(pyridine-d5,800MHz)δ:0.963,0.971(2×3H,s,H3-26,27),1.007(3H,s,H3-19),1.111(3H,s,H3-18),1.476(3H,s,H3-30),1.725(3H,s,H3-29),1.802(1H,m,H-1),2.856(1H,dd,J＝11.11,5.73Hz,H-17),2.929(1H,dt,J＝8.12,2.68Hz,H-20),4.499(1H,dd,J＝7.18,6.83Hz,H-16),4.809,4.823(2×1H,brs,H-28),4.837(1H,s,H-31),5.267(1H,brs,H-7),5.25(1H,brs,H-11)。13C NMR(pyridine-d5,200MHz)给出30个碳信号，根据DEPT谱推断分别为7个甲基，8个亚甲基，7个次甲基(包括3个双键碳δ121.21,116.65,124.92)，7个季碳(含3个双键碳δ142.81,146.53,131.64和一个羧基碳δ178.72)。13C NMR(pyridine-d5,200MHz)给出31个碳信号，根据DEPT谱推断分别为6个甲基δ:18.31(C-18),22.23(C-19),22.19(C-26),21.83(C-27),21.985(C-28),24.82(C-29)，7个亚甲基(含2个双键碳δ112.14,C-28,107.07,C-31)，9个次甲基(包括2个双键碳δ117.94,120.26和一个羟基碳δ76.38)，9个季碳(含4个双键碳δ150.21,141.82,137.46,156.01和2个羧基碳δ176.58,178.59)。13C NMR(pyridine-d5,200MHz)δ:36.34(C-1),30.17(C-2),176.58(C-3),150.21(C-4),50.71(C-5),28.54(C-6),117.94(C-7),141.82(C-8),137.46(C-9),38.80(C-10),120.26(C-11),36.95(C-12),45.59(C-13),49.28(C-14),43.78(C-15),76.38(C-16),57.58(C-17),18.32(C-18),22.23(C-19),48.41(C-20),178.59(C-21),31.33(C-22),33.18(C-23),156.01(C-24),34.05(C-25),22.19(C-26),21.83(C-27),112.14(C-28),21.98(C-29),24.82(C-30),107.01(C-31)。根据以上数据与文献对照，鉴定该化合物为：16α-羟基-3,4-裂环羊毛甾-4(28),7,9(11),24(31)-三烯-3,21-双酸(16α-hyroxy-3,4-secolanosta-4(28),7,9(11),24(31)-tetraen-3,21-dioic acid)或者茯苓酸A(poricoic acid A)。
(16α-hyroxy-3,4-secolanosta-4(28),7,9(11),24(31)-tetraen-3,21-dioic acid)的化学结构式如下：
(2)不同剂量的茯苓酸A对大鼠尿量的影响
图1显示茯苓酸A利尿在6h内尿量的累加结果，与正常对照组相比，小、中、大3个剂量组随着时间增加尿量增加；小剂量组的1h和2h内尿量没有统计学上的显著性差异，其它时间段内尿量存在统计学上的显著性差异；中和大剂量组在6h内随着时间增加尿量增加且均存在统计学上的非常显著性差异。
表1显示6h内每小时的尿量，与正常对照组相比，小、中、大3个剂量组均存在不同时间的不同程度的利尿效果。茯苓酸A小剂量组3h和6h有显著的利尿效果；茯苓酸A中剂量组1h、2h和4h有非常显著的利尿效果；茯苓酸A大剂量组1h、2h、3h、4h和6h有非常显著的利尿效果；发明人的研究显示茯苓酸A的利尿效果主要集中在前3h。以正常对照组为参照，则茯苓酸A三组6h内尿量分别增加了18.2％、29.3％、45.5％。三组的平均增加率31％，茯苓酸A三个剂量组利尿效果均最显著，特别值得注意的是茯苓酸A三个剂量组在第1小时的尿量均大于螺内酯的尿量。尽管螺内酯是40mg/kg的剂量，而茯苓酸A为20mg/kg的剂量，大剂量与药螺内酯的6h的总尿量接近，提示茯苓酸A有较好的利尿效果。茯苓酸A三个不同的剂量组大鼠6h尿量低于呋塞米组，结果表明茯苓酸A的利尿程度弱于呋塞米，茯苓酸A出现了与螺内酯相似的利尿效果，推测茯苓酸A可能与螺内酯有相似的拮抗醛固酮的利尿作用机制。
表1不同剂量的茯苓酸A灌胃给药对大鼠尿量的影响(平均值±SE)
注：茯苓酸A、螺内酯及呋塞米给药组与水对照组组间进行t检验，与对照组比*P<0.05，**P<0.01。
(3)不同剂量的茯苓酸A对大鼠尿液pH值的影响
与正常对照组尿液相比，茯苓酸A三个剂量组对尿液pH值没有影响。螺内酯增加尿液的pH值并存在统计学上的显著性差异。呋塞米对尿液的pH值没有影响。
(4)不同剂量的茯苓酸A对大鼠尿液电解质钠、钾及氯离子浓度的影响
表2显示茯苓酸A对大鼠尿液电解质浓度的影响。与正常对照组大鼠相比，茯苓酸A三个剂量组均能减少尿液K+的浓度且存在统计学上的非常显著性差异，说明茯苓酸A有保钾的利尿活性；与正常对照组大鼠相比，茯苓酸A虽然增加尿液电解质Na+的浓度的趋势，但三个剂量组均没有达到统计学上的显著性差异；与正常对照组大鼠相比，茯苓酸A小、中、大三个剂量组对尿液Cl-的浓度有一定影响，且茯苓酸A中和大剂量组存在统计学上的非常显著性差异。茯苓酸A小、中、大三个剂量组均增加Na+/K+的比值，且存在统计学上的非常显著性差异。螺内酯和呋塞米能增加尿液Na+和Cl-浓度，同时增加尿液Na+/K+的比值，但对尿液K+浓度没有显著的影响。
发明人的研究结果证明了茯苓酸A在促进钠排泄的同时具有保钾的作用。茯苓酸A促进利水的作用机制可能是抑制肾小管对电解质Na+和水的重吸收，茯苓酸A的化学结构与螺内酯(醛固酮拮抗剂)和依普利酮(选择性醛固酮受体阻滞剂)结构相似，推断茯苓酸A的利水作用是拮抗醛固酮而改变钠和钾离子的平衡。
表2不同剂量茯苓酸A对大鼠尿液pH值及电解质钠、钾及氯离子浓度的影响(平均值±SE)
注：茯苓酸A、螺内酯及呋塞米给药组与水对照组组间进行t检验，与对照组比*P<0.05，**P<0.01。