PP242在制备用于减轻肾纤维化相关病症的药物中的应用的制作方法

本发明涉及PP242的新用途，具体地涉及PP242在制备用于减轻肾纤维化相关病症的药物中的应用。

背景技术：

慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)是指持续的肾脏损害≥3个月(肾损害包括了肾脏结构或功能异常)，伴或不伴肾小球滤过率(GFR)下降。CKD是一组威胁人类健康的进行性发展的慢性疾病，已经成为一个社会性的公共问题。2000年的一项大规模流行病学调查显示全中国约有10％的人口患有CKD。不管是由何种原发病引起，CKD患者都不可避免的进入尿毒症期。如果未经适当治疗，尿毒症及其并发症的预后极差，死亡率很高。因此，研究和认识延缓或防止慢性肾脏病发展、改善慢性肾脏病预后的药物具有重要意义。

肾间质纤维化是CKD的主要病理特征，与CKD患者肾功能减退速度和预后密切相关。多项研究表明肾间质纤维化主要是肌成纤维细胞聚集及活化，产生大量细胞外基质(ECM)成分，包括纤维连接蛋白(Fibronectin)以及胶原I和胶原III。研究表明，肾脏肌成纤维细胞至少有五种不同来源，包括肾脏固有成纤维细胞的活化，骨髓来源间充质干细胞的转分化，周细胞的分化，小管上皮、内皮细胞的转分化。肾组织中固有成纤维细胞是肾间质肌成纤维细胞的主要来源(约50％)。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一种高度保守的非典型丝/苏氨酸蛋白激酶。mTOR作为核心蛋白参与组成两种复合体，包括mTORC1和mTORC2。Raptor(regulatory associated protein of TOR)mLST8(mammalian lethal with SEC13protein 8)和PRAS40(proline-rich Akt/PKB substrate 40kDa)等形成雷帕霉素敏感的复合体1(Mammalian Target of Rapamycin Complex 1，mTORC1)。mTORC1通过活化下游的核糖体激酶S6K1(Ribosome p70 S6 kinase，S6K1)和真核细胞始动因子4E结合蛋白1(eIF.4E binding protein1，4EBP1)发挥生物学效应，调控细胞的增殖、生长、蛋白质合成以及细胞的自噬、代谢和存活。另外，mTOR、Rictor(rapamycin insensitive companion of mTOR)、mLST8、mSIN1(mamalian stress-activated interacting protein 1)和Protor(protein observed with Rictor)等形成mTORC2复合物。mTORC2通过磷酸化下游底物，包括Akt、proteinkinase Cα (PKCα)、glucocorticoid-induced protein kinase 1(SGK1)来调节细胞的存活、增殖、细胞骨架的完整以及水盐代谢等。已经有研究证实mTORC1以及mTORC2信号通路在TGFβ1诱导的成纤维细胞活化与肾间质纤维化的过程中具有重要作用，阻断这条信号通路可以抑制成纤维细胞活化并减轻肾间质纤维化。

PP242是一个mTOR的ATP竞争性和选择性抑制剂，能够同时抑制mTORC1以及mTORC2的活性。

已经有研究表明PP242能够抑制多种肿瘤细胞增殖，促进细胞凋亡。目前，尚未有PP242可以减轻慢性肾脏病的报道。

发明目的：本发明的发明目的在提出PP242的新适应症，即在在制备用于减轻肾纤维化相关病症的药物中的应用。

其中，所述的肾纤维化相关病症为慢性肾脏病、肾间质纤维化、肾间质成纤维细胞活化和肾脏炎性细胞浸润中的任意一种。

具体地，所述的肾间质纤维化为单侧输尿管结扎造成的肾间质纤维化。

其中，研究表明，PP242抑制TGF-β1诱导的mTORC1以及mTORC2的活化。

PP242抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞活化。

PP242抑制TGF-β1引起的FN、α-SMA以及I型胶原蛋白的高表达。

PP242抑制单侧输尿管结扎肾组织mTORC1以及mTORC2的信号转导。

PP242抑制单侧输尿管结扎肾组织细胞外基质沉积。

附图说明

图1为PP242对NRK49F细胞中TGF-β1诱导的mTORC1以及mTORC2的活化的影响；

图2为PP242对TGF-β1诱导的NRK49F细胞活化的影响，其中，上图为Western blot分别检测FN、α-SMA以及type-I Collagen的表达下图利用免疫荧光染色检测FN以及α-SMA的表达；

图3为Western blot检测了UUO术一周后(UUO1W)，两组小鼠肾组织mTORC1靶分子p-s6的表达以及UUO术两周后(UUO2W)，两组小鼠肾组织mTORC2靶分子p-Akt(ser473)的表达；

图4为UUO两周后UUO侧肾组织以及其对侧肾组织中行PAS，Masson以及天狼星红(SirusRed)染色结果；

图5为利用Western blot检测10％DMSO或PP242组UUO一周后的肾组织以及其对侧肾中Fibronectin的表达以及10％DMSO或PP242组UUO两周后的肾组织以及其对侧肾中Fibronectin以及α-SMA的表达的结果图；

图6为利用免疫荧光染色检测10％DMSO或PP242组UUO两周后的肾组织以及其对侧肾中Fibronectin以及α-SMA的表达的结果图。

具体实施方式

下面通过具体的实施例详细说明本发明。

实施例1 PP242在NRK49F细胞中能够抑制TGF-β1诱导的mTORC1以及mTORC2的活化。

应用大鼠成纤维细胞系(NRK49F)，单独TGF-β1处理组中，利用TGF-β1(2ng/ml)处理12小时；PP242处理组中，预先30min将PP242以不同浓度(3.6，16，80，400nM)加入细胞，随后利用TGF-β1(2ng/ml)处理12小时。Western blot分别检测mTORC1靶分子p-s6以及mTORC2靶分子p-Akt(ser473)的表达，结果如图1所示。

结果分析：TGF-β1在NRK49F细胞中可以诱导mTORC1靶分子p-s6以及mTORC2靶分子p-Akt(ser473)高表达，而PP242可以明显抑制TGF-β1引起的mTORC1以及mTORC2信号通路激活，并且随着PP242剂量的增高，抑制效果更明显，呈一个剂量依赖性。

实施例2 PP242能够抑制TGF-β1诱导的NRK49F细胞活化。

应用大鼠成纤维细胞系(NRK49F)，单独TGF-β1处理组中，利用TGF-β1(2ng/ml)处理48小时；PP242处理组中，预先30min将PP242以不同浓度(3.6、16、80、400nM)加入细胞，随后利用TGF-β1(2ng/ml)处理48小时。Western blot分别检测FN、α-SMA以及type-I Collagen的表达，利用免疫荧光染色检测FN以及α-SMA的表达，结果如图2所示。

结果分析：TGF-β1在NRK49F细胞中可以诱导FN，α-SMA以及type-ICollagen表达水平增高，而PP242可以明显抑制TGF-β1引起的FN，α-SMA以及type-ICollagen的高表达，并且呈一个剂量依赖性。

实施例3 PP242抑制单侧输尿管结扎(UUO)小鼠肾组织mTORC1以及mTORC2的信号转导

取体重20～22g的雄性CD1小鼠，分为等体积10％DMSO组以及PP242治疗组。每组小鼠每日单次腹腔注射10％DMSO或PP242(20mg/kg)，注射两天以后，行单侧输尿管结扎术(UUO)作为肾间质纤维化模型，手术后继续每日单次腹腔注射10％DMSO或PP242。于7天以及14天后将两组小鼠处死，并留取对侧以及UUO侧肾组织。Western blot检测了UUO术一周后，两组小鼠肾组织mTORC1靶分子p-s6的表达以及UUO术两周后，两组小鼠肾组织mTORC2靶分子p-Akt(ser473)的表达，结果如图3所示。

结果分析：UUO术后一周的肾组织中，PP242可以明显抑制mTORC1信号转导，其差异有统计学意义(p＜0.05)；而UUO术后两周的肾组织中，mTORC2信号通路明显活化，PP242可以明显抑制mTORC2信号转导(p＜0.05)。

实施例4 PP242抑制单侧输尿管结扎(UUO)小鼠肾组织肾间质纤维化

取体重20～22g的雄性CD1小鼠，分为等体积10％DMSO组以及PP242治疗组。每组小鼠每日单次腹腔注射10％DMSO或PP242(20mg/kg)，注射两天以后，行单侧输尿管结扎术(UUO)作为肾间质纤维化模型，手术后继续每日单次腹腔注射10％DMSO或PP242。于14天后将两组小鼠处死，并留取对侧以及UUO侧肾组织。分别在10％DMSO或PP242组UUO两周后UUO侧肾组织以及其对侧肾组织中行PAS，Masson以及天狼星红染色，结果如图4所示。

结果分析：染色的结果显示UUO两周后，肾组织出现明显的间质纤维化，而PP242组小鼠肾间质纤维化较10％DMSO组明显减轻。

实施例5 PP242抑制单侧输尿管结扎(UUO)小鼠细胞外基质沉积

取体重20～22g的雄性CD1小鼠，分为等体积10％DMSO组以及PP242治疗组。每组小鼠每日单次腹腔注射10％DMSO或PP242(20mg/kg)，注射两天以后，行单侧输尿管结扎术(UUO)作为肾间质纤维化模型，手术后继续每日单次腹腔注射10％DMSO或PP242。于7天以及14天后将两组小鼠处死，并留取对侧以及UUO侧肾组织。利用Western blot检测10％DMSO或PP242组UUO一周后的肾组织以及其对侧肾中Fibronectin的表达；利用Western blot以及免疫荧光染色检测10％DMSO或PP242组UUO两周后的肾组织以及其对侧肾中Fibronectin以及α-SMA的表达，结果如图5和图6所示。

结果分析：UUO术后一周的肾组织中，Fibronectin的表达较对侧肾明显升高，表明有更多细胞外基质沉积；而PP242可以显著抑制UUO引起的Fibronectin的高表达，其差异有统计学意义(p＜0.05)。UUO术后两周的肾组织中，I型胶原、Fibronectin以及α-SMA的表达较对侧肾都明显升高；而PP242可以显著抑制UUO引起的Fibronectin以及α-SMA的高表达，其差异有统计学意义(p＜0.05)。

本发明实施例中使用的方法简单介绍如下：

(1)单侧输尿管梗阻性(unilateral ureteral obstruction，UUO)肾病模型：

选用CD1雄性小鼠，以45mg/kg的戊巴比妥腹腔注射麻醉后，于无菌条件下开放腹腔，钝性分离左侧输尿管，于输尿管上1/3处和下1/3处分别结扎输尿管，然后逐层关闭腹腔。于术后7、14天处死小鼠，并留取手术侧和对侧肾组织标本。

(2)肾组织PAS(Periodic Acid-Schiff)染色

1)常规乙醇脱水；

2)常规石蜡包埋，3um切片；

3)二甲苯脱蜡水化：二甲苯(I)5min---二甲苯(II)5min---100％乙醇2min---95％乙醇1min---80％乙醇1min---75％乙醇1min---蒸馏水洗2min；

4)组织切片用1％过碘酸处理10-15min，水洗；然后用Schiff氏液处理10-30min，水洗；

5)苏木素染细胞核1-2min，水洗；

6)用1％盐酸乙醇分化数秒，水洗；

7)氨水返蓝数秒；自来水冲洗，镜下观察细胞核染成蓝色，基底膜染成粉红色；

8)梯度酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片；

9)正置显微镜下观察肾脏病理结构改变，摄片。

(3)天狼星红染色

3μm厚肾组织石蜡切片55℃烘干1h，依次浸于二甲苯、100％、95％、80％、60％乙醇中各2min脱蜡，水化。天狼星红溶液(1％星红10ml加饱和苦味酸90ml)常温浸泡过夜，然后0.01N盐酸浸泡2min，80％、95％、100％乙醇、二甲苯中依次浸泡2min、干燥、固定、封片、纤维镜观察并摄片。

(4)免疫印迹(Western blot)法：

1)组织和细胞样品处理：

使用RIPA裂解液在冰上使用玻璃匀浆器研磨组织(约100mg)或使用细胞刮收集细胞，之后将匀浆液吸入至相应的EP管中，以16000转/分×30min离心后取上清，取蛋白匀浆上清以1∶50比例稀释，BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度，标准品蛋白浓度为1mg/ml。然后用4×SDS样品缓冲液(125mM Tris-Hcl，4％SDS，20％甘油，100mM二硫苏糖醇，0.2％溴酚蓝)和去离子水调整至相同浓度，按目的蛋白不同，组织上样量为50-100ug/孔，细胞标本为10-20ug/孔。RAPA裂解液配方：1XPBS，1％NP-40，0.1％sodiμm deoxycholate，1μm sodiμm orthovanadate，100nM PMSF，Protease Inhibitor Cocktail(1∶100稀释)，Phosphatase Inhibitor Cocktail2(1∶100稀释)，Phosphatase Inhibitor Cocktail3(1∶100稀释)。

2)免疫印迹操作过程：

电泳：取样本加入SDS-聚丙烯酰胺凝胶上样孔中，使用80V电压分离出不同大小的蛋白分子；

转膜：在4℃的转移缓冲液(含48mM Tris-Hcl，39mM甘氨酸，0.037％SDS，20％甲醇)中使用100V恒压将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，根据目的蛋白分子量的不同，转膜时间为60-75min；

封闭：在室温下用含有2％BSA的TBST孵育1h，以封闭膜上的非特异性区域；

一抗孵育：用含2％BSA的TBST稀释一抗，然后4℃孵育过夜；

洗膜：室温下用TBST洗膜3次，每次15min；

二抗孵育：用含有5％脱脂牛奶TBST稀释二抗，室温孵育1h；

洗膜：室温下用TBST洗膜3次，每次15min；

显色及扫描分析：用ECL液显色检测蛋白信号，在暗盒中用X片光将目的显出，扫描仪扫描图像，最后用Image J软件分析蛋白信号的相对含量。

(5)小鼠肾脏组织免疫组化染色：

1)组织切片常规脱蜡水化：二甲苯20min×2---100％乙醇---95％乙醇---85％乙醇---70％乙醇---蒸馏水，各3分钟。

2)切片滴加新鲜配制3％过氧化氢，室温10min以消除内源性过氧化酶活性，蒸馏水洗3min×3次

3)热修复抗原：切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液(PH 6.0)，微波炉热修复，中高火加热3分钟左右至沸腾后停止加热，5分钟后重复加热。热修复抗原共加热3次。冷却后0.01M PBS漂洗3次，每次3分钟；

4)用含2％BSA的TBST孵育1h，以封闭膜上非特异性区域；

5)甩去多余液体，滴加一抗，室温孵育2h，0.01M PBS漂洗3次，每次3分钟；

6)滴加生物素标记的二抗，室温孵育1h，0.01M PBS漂洗3次，每次3分钟；

7)滴加辣跟酶标记链霉卵白素工作液(S-A/HRP)，室温孵育45min，0.01M PBS漂洗3次，每次3分钟。

8)DAB显色：取1ml蒸馏水，加试剂盒中的A、B、C试剂各一滴，然后滴加至盖玻片上，室温显色，显微镜下控制反应时间。

9)自来水冲洗，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂片。

10)摄像：用尼康Eclipse E600型荧光显微镜观察并摄取荧光图像。

(6)间接免疫荧光染色(组织冰冻切片)：

1)固定：甲醇-丙酮溶液(1∶1)于-20℃固定10min；

2)洗涤：室温下用含有0.1BSA的PBS液洗涤2次，每次15min；

3)破膜：用0.5％TritonX-100处理10min，再用含0.1％BSA的PBS液洗涤2次，每次15min；

4)小鼠组织冰冻切片，并且一抗为鼠源性单克隆抗体时用MOM mouse Ig Blocking Reagent室温孵育1h；

5)封闭：用含有0.1％Triton X-100和2％BSA的PBS溶液室温封闭45min；

6)一抗孵育：用含2％BSA的PBS溶液稀释特异性一抗，并在4℃孵育过夜；

7)洗涤：PBS液室温洗涤3次，每次15min；

8)二抗孵育：含2％BSA的PBS溶液稀释的二抗(1∶50-1∶100)，室温孵育1h，避光；

9)洗涤：用含0.1％BSA的PBS液室温洗涤3次，每次20min；

10)胞核复染及固定封片：使用VECTASHELD HardSet Mounting Mediμm with DAPI染核并封片；

11)摄像：用尼康Eclipse E600型荧光显微镜观察并摄取荧光图像。