一种中药组合物及其在制备治疗肺纤维化疾病药物中的应用的制作方法

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种中药组合物，及其在制备治疗肺纤维化疾病药物中的应用。

背景技术：

肺纤维化(pulmonaryfibrosis，pf)是一组病因不明的肺间质疾病，以进行性加重的呼吸困难为最突出的临床表现，主要病理特征是肺泡上皮细胞损伤、成纤维细胞活化、成纤维细胞灶的形成以及细胞外基质的过度沉积，最终导致肺组织结构的异常重塑。目前的治疗药物以皮质激素、免疫抑制剂、抗炎药、细胞毒药物为主，但大多数患者对药物不敏感、病情发展快、死亡率高，治疗仍是国际性难题。在抗肺纤维化药物的研究中，多靶点作用机制是人们关注的热点。肺纤维化的发病由多因素复杂调控，单一作用靶点的药物很难达到有效的治疗，因此人们开始将更多的眼光投向多组分、多靶点的中药。中药不但可以控制纤维化，同时可以很好调节体质，提高机体免疫力，减少肺部感染。多数医家根据肺纤维化的临床症状将其归入“肺痿”、“肺痹”、“咳嗽”、“喘证”、“短气”、“肺胀”等范畴，以活血化瘀、益气养阴、清热润燥止咳，化痰通络、补肾益肺、软坚散结为治则。

本发明经长期深入研究，发现一种具有良好的抗肺纤维化作用的中药组合物，研究发现该组合物能够调控短链非编码rna(mirnas)和长链非编码rna(lncrna)的表达。mirna和lncrna作为功能性的rna分子与mrna构成复杂的基因调控网络，参与肺纤维化疾病的进程。因此该组合物有望在制备治疗肺纤维化疾病药物中得到良好应用。

技术实现要素：

本发明提供一种新的中药组合物，该组合物具有明显的抗肺纤维化作用。

根据本发明提供的中药组合物，其组成由以下药材按重量比组成：黄芪5～35份，党参15～25份，麦冬10～15份，五味子5～15份，三七3～10份，贝母5～15份，知母5～15份，炙甘草1～10份。

根据本发明提供的中药组合物，其组成优选为由以下药材按重量比组成：黄芪20～30份，党参15～20份，麦冬10～15份，五味子5～10份，三七5～10份，贝母5～10份，知母5～10份，炙甘草1～5份。

根据本发明提供的中药组合物，所用黄芪为采挖后直接晒干的黄芪，也可为炮制加工后的炙黄芪。

根据本发明提供的中药组合物，所用党参为桔梗科植物党参、素花党参、或川党参等中的一种。

根据本发明提供的中药组合物，所用麦冬为采挖后直接晒干的麦冬，也可为经去心净制、或盐炒、或用朱砂、姜汁等炮制后的麦冬。

根据本发明提供的中药组合物，所用五味子为木兰科植物五味子schisandrachinensis(turcz.)baill.的干燥成熟果实，也可为华中五味子schisandrasphenantherarehd.etwils.的干燥成熟果实。

根据本发明提供的中药组合物，所用贝母为浙贝母或川贝母中的一种。

根据本发明提供的中药组合物，所用知母为毛知母，或经盐制、炒制、麸制或酒制手段处理后的知母。

根据本发明提供的中药组合物，所用甘草为采挖后晒干的豆科植物甘草、胀果甘草、光果甘草的干燥根或根茎，也可为经蜜炙炮制的甘草。

本发明提供了上述中药组合物的制备方法。

根据本发明提供的中药组合物的制备方法为：按配方称取：黄芪、党参、麦冬、五味子、三七、贝母、知母、炙甘草，破碎后加入到适当溶剂中提取，其中提取为混合提取或分别提取后再混合，浸泡或煎煮，过滤，合并滤液，滤液减压浓缩至稠的液体备用，进行制剂生产。

加入的溶剂为水或一定浓度的乙醇。加入的溶剂重量与黄芪、党参、麦冬、五味子、三七、贝母、知母、炙甘草的重量比为10～50∶1，煎煮次数优选2～3次。

浓缩液可根据需要稀释后加入调味剂、防腐剂，并灌装、灭菌，制成口服液；或进一步浓缩成清膏后加入辅料，制粒，包装，制成速溶性颗粒；也可制成膏剂、片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、滴丸等剂型。制剂过程所用辅料的种类及用量均应符合国家及行业有关规定。

本发明还提供了该中药组合物在制备治疗肺纤维化药物中的应用。

附图说明

图1是肺纤维化大鼠给药30天后，肺组织病理改变结果图：

a为正常对照组，b为博莱霉素模型组，c为中药组合物治疗组。

图2是肺纤维化大鼠给药30天后，mirna和lncrna表达变化图。

图3是中药组合物抑制肺泡上皮细胞凋亡图。

图4是中药组合物抑制肺泡上皮细胞转分化图。

图5是中药组合物干扰肌成纤维细胞细胞周期图。

图6是中药组合物抑制肌成纤维细胞迁移能力图。

具体实施例

下面的实验例用以解释本发明，但是并非对本发明实质内容的限制。

实施例1.中药组合物口服液的制备

取黄芪300g，党参200g，麦冬100g，北五味子100g，三七50g，浙贝100g，知母100g，炙甘草50g，以上八味，加水20升，煎煮二次，每次2小时，合并煎煮液，浓缩至10升，静置过夜，过滤，滤液加入5％白砂糖和0.01％的山梨酸钾，灌装、灭菌，即得。每瓶相当于10g原药材。

实施例2.中药组合物膏剂的制备

取炙黄芪300g，党参180g，麦冬120g，南五味子90g，三七60g，浙贝60g，知母60g，炙甘草30g，以上八味，加水20升，煎煮二次，每次2小时，合并煎煮液，浓缩至10升，静置过夜，过滤，滤液进一步浓缩至清膏(密度1.1～1.5)，加入5％白砂糖和0.01％的山梨酸钾，灌装、灭菌，即得。每ml浸膏相当于1g原药材。

实施例3.中药组合物颗粒剂的制备

取黄芪250g，党参200g，麦冬150g，南五味子100g，三七100g，川贝100g，知母100g，炙甘草50g，以上八味，加水20升，煎煮二次，每次2小时，合并煎煮液，浓缩至清膏后，按1∶1加入糖粉作辅料，混合均匀，制粒，烘干后包装，即得。每袋相当于10g原药材。

实施例4.中药组合物片剂的制备

取黄芪200g，党参150g，麦冬150g，北五味子100g，三七100g，浙贝80g，知母80g，炙甘草30g，以上八味，加水20升，煎煮二次，每次2小时，合并煎煮液，浓缩至清膏后，按1∶1加入糖粉作辅料，混合均匀，制粒后，加1％硬脂酸镁，压片，即得。每片相当于1g原药材。

实施例5.中药组合物胶囊剂的制备

取炙黄芪300g，党参200g，麦冬150g，北五味子80g，三七80g，川贝80g，知母100g，炙甘草30g，以上八味，加水20升，煎煮二次，每次2小时，合并煎煮液，浓缩至清膏后，按1∶1加入糖粉作辅料，混合均匀，制粒、烘干后灌装胶囊，即得。每粒相当于1g原药材。

实施例6.中药组合物滴丸剂的制备

取黄芪300g，党参150g，麦冬120g，五味子120g，三七100g，浙贝80g，知母80g，炙甘草30g，以上八味，加水20升，煎煮二次，每次2小时，合并煎煮液，浓缩至干，加入聚乙二醇或s－40为辅料，滴制、烘干，即得。每丸相当于0.1g原药材。

实施例7.中药组合物对博莱霉素所致大鼠肺纤维化保护作用的实验研究

1、材料

sd大鼠，雄性，体重200±20克，清洁级，由山东绿叶制药股份有限公司实验动物中心提供，合格证号：syxk(鲁)20030020，在清洁级动物观察室，适应性喂养3天，给药期间自由饮水进食；博莱霉素(日本化药株式会社产品，批号:850300)；α-sma、snail抗体(美国santacruz公司)；mirna和lncrna引物(广州市锐博生物科技有限公司)。

中药组合物：取炙黄芪300g，党参180g，麦冬120g，五味子90g，三七60g，浙贝60g，知母60g，炙甘草30g，以上八味，按实施例2中的方法制备成膏剂，备用。每ml浸膏相当于1g原药材。

2、仪器

5415r型高速低温离心机(德国effendorf公司)；clinx化学发光成像系统(上海勤翔)；实时定量pcr仪(rotor-gene3000)；透射电子显微镜(日本株式会社)。

3.方法

3.1动物建模与分组：

45只sd大鼠随机分为3组：假手术组、模型组、治疗组。每组大鼠15只。模型组、治疗组大鼠用4％水合氯醛(0.01ml·g^-1)腹腔注射麻醉，常规消毒铺巾，按无菌操作原则切开颈部皮肤，由气管一次性注入博莱霉素溶液(5mg/kg)，完毕后缝合皮肤，将大鼠直立、旋转，尽量使药液在肺内均匀分布；正常组由气管内一次性注入等体积无菌生理盐水0.2ml。术后动物置于干燥、温暖条件下喂养，定期消毒喂养场所。术后14天开始治疗，中药组合物按10mg/kg给大鼠灌胃，正常组和模型组给予等量的双蒸水，连续给药30d，每天1次。

3.2病理学观察：

各组实验大鼠分别于给药30d后处死，腹主动脉采血分离血清，取相同部位肺组织，4％甲醛溶液固定，常规病理学方法脱水、包埋、切片、染色(h&e、masson)，染色结果用image-proplus处理并用spss软件统计分析。并严格按相应试剂盒说明书操作，检测各组大鼠肺组织中羟脯氨酸含量；

3.3实时定量pcr法检测mirna、lncrna的表达变化

使用rna抽提试剂trizol和rneasy试剂盒提取各组肺组织总rna，使用nanodrop-nd100，将样品测定rna在分光光度计260、280、230nm的吸收值，以计算浓度并评估纯度。使用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测rna纯度及完整性。

rt合成cdna，反应液配制在冰上进行，得到的cdna可直接用于pcr扩增。pcr反应体系(反应混合液配制在冰上进行)

混匀上述混合液，95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火20s，72℃延伸10sec，40个循环，72℃终末延伸7min，4℃保存。gapdh作为内参。

4.结果

4.1中药组合物对博来霉素诱发的肺纤维化大鼠肺组织结构的影响

如图1所示，h&e染色发现正常对照组大鼠肺组织结构清晰正常；纤维化模型组肺泡壁显著增厚，肺泡间隔明显增宽，间质内有明显增多的成纤维细胞和胶原基质，有巨噬细胞、淋巴细胞等的浸润，肺实质结构紊乱，部分肺泡结构消失，萎缩闭塞；中药组合物组与模型组比较情况好转，肺泡隔纤维增生减少，病变范围减小，肺实质结构破坏较少；masson染色发现正常对照组大鼠肺组织结构正常；纤维化模型组大鼠在肺泡间隔、肺泡壁，以及终末细支气管、呼吸性细支气管和小支气管管壁周围均可见到大量增生的蓝色胶原纤维，尤其在小血管周围纤维化实变区胶原含量明显增多；中药组合物组与模型组相比纤维化程度减轻，总胶原含量减少，表明中药组合物有减轻胶原纤维增生，改善肺间质纤维化的作用。

4.2中药组合物对肺纤维化大鼠肺组织中羟脯氨酸含量的影响

与正常组大鼠相比，模型组大鼠肺组织hyp含量升高(p＜0.01)；中药组合物组大鼠肺组织hyp含量较模型组降低(p＜0.01)；(见表1)

表1.中药组合物对肺纤维化大鼠肺组织hyp含量的影响(n＝5)

4.3中药组合物对mirna及lncrna表达的影响

如图2所示，与正常组相比，模型组肺组织中mirna-21、lncrna-mrak053938、bc158825的表达量明显增加，而mir-30a、mir-708-3p、mir-344a下调表达；与模型组相比， 中药复方能明显下调mirna-21、lncrna-mrak053938、bc158825的表达，而上调mir-30a、mir-708、mir-344a的表达(p<0.05)。

实施例8.中药组合物抗肺纤维化机制的体外研究

1、材料

ⅱ型上皮细胞株(a549)，肺成纤维细胞株(mrc-5)，购自中国科学院细胞库；rpmi1640培养基、高糖dmem培养基(dmem-lg)、胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)均购自美国hyclone公司，tgf-β1购自invitrogen公司，transwell小室购自美国corning公司，细胞周期和细胞凋亡试剂盒购自南京凯基生物技术公司，抗体均购自美国santacruz公司。

2、仪器

激光共聚焦显微镜(德国莱卡公司)；流式细胞仪(美国coulterepicsxl)；co2培养箱(thermo公司)；倒置相差显微镜(日本olympus公司)；clinx化学发光成像系统(上海勤翔)。

3、方法

3.1细胞培养及分组

a549和mrc-5细胞经由5ng/ml的tgf-β1刺激72h转化成肌成纤维细胞。a549细胞经由80μm的博来霉素作用48h，诱发肺泡上皮细胞损伤。a549和mrc-5细胞分别于含10％胎牛血清的rpmi1640和dmem培养液中，37℃、5％co2饱和湿度的培养箱内培养。选取处于对数生长期的细胞，制成单个细胞悬液，接种培养板或盖玻片上。分为正常组、模型组(tgf-β1组/博来霉素组)、中药组合物组。

3.2细胞周期检测：

取处于对数生长期的a549和mrc-5细胞，胰酶消化后接种与6孔板，培养过夜，分为正常组、tgf-β1模型组、中药组合物组，每组3个复孔，实验重复3次。中药组合物组于tgf-β1刺激72h后，更换含药物的完全培养基(终浓度1.5mg/ml)继续培养24h，tgf-β1组则更换成正常的完全培养基继续培养24h后，pbs洗涤一次，收集细胞并调整浓度为1*10^6/ml，取1ml单细胞悬液；制备单细胞悬液离心后去除上清，在沉淀中加入体积分数70％的冷乙醇500ul固定，4℃保存，染色前pbs洗去固定液；加入100ulrnasea37℃水浴30min，再加入400ulpi混匀，4℃避光30min；上机检测，记录激发波长488nm处红色荧光。

3.3细胞凋亡检测：取处于对数生长期的a549细胞株，胰酶消化后接种与6孔板，培养过夜，分为正常组、模型组、中药组合物组，每组3个复孔，实验重复3次。中药组合物组与博莱霉素(终浓度为80μm)作用12h后，加入中药组合物悬液(终浓度1mg/ml)继续培养至48h。贴壁细胞用胰酶消化，用pbs洗涤细胞二次(2000rpm离心5min)收集1～5×10⁵细 胞；加入500ul的bindingbuffer悬浮细胞；加入5ulannexinv-fitc混匀后，加入5ulpropidiumiodide，混匀；室温、避光、反应5～15min；1小时内，进行流式细胞仪的观察和检测。

3.4westernblot检测相关蛋白的表达变化

胰酶消化收集细胞提取蛋白，按如下步骤操作：配胶，上样电泳(恒压80v，30min；100v，1～2h)，转膜(低温进行，恒流200ma,2h)，tbst洗膜5min×3次，室温封闭2h，滴加一抗(1：200，4℃过夜)，37℃恒温孵育30min，tbst洗膜10min×3次，滴加二抗(1：5000，室温摇床1h)，tbst洗膜15min×3次，加入发光试剂(1:1配置)clinx化学发光成像系统曝光拍照。

3.5transwell小室检测细胞迁移

不含edta的胰酶消化收集细胞，pbs洗涤细胞两次(2000rpm离心5min)，加无血清培养基重悬细胞，使细胞浓度1-5×10⁵，上室加200ul细胞悬液，下室加入500ul含10％fbs的完全培养基，放入细胞培养箱培养24h后将小室取下，pbs冲洗2次，甲醇固定30min，0.1％结晶紫染色20min，pbs冲洗多余染液，镜下观察进行细胞计数。

4.结果

4.1中药组合物对博来霉素诱发肺泡上皮细胞损伤的保护作用

如图3所示，与正常组相比，模型组凋亡细胞数明显增多；中药组合物能够显著提高肺泡上皮细胞的活性，抑制细胞凋亡(p<0.05)。

4.2中药组合物抑制肺泡上皮细胞的转分化

如图4所示，与正常组相比，tgfβ1模型组细胞的snail、α-sma表达量明显增多(p<0.05)；中药组合物能够显著下调snail、α-sma的表达，抑制a549细胞上皮-间(充)质细胞转化(p<0.05)；

4.3中药组合物干扰肌成纤维细胞的细胞周期

如图5所示，与正常组相比，tgfβ1模型组细胞s期和g2期细胞数明显增多，中药组合物能够显著减少s和g2期的细胞数，抑制细胞周期的进程；

4.4中药组合物抑制肌成纤维细胞的迁移

如图6所示，与tgfβ1模型组的肌成纤维细胞相比，中药组合物组细胞的迁移能力明显下降；与中药组合物组相比，mrak053938sirna+中药组合物组细胞迁移能力显著下降，表明中药复方干扰细胞迁移的作用与其调控mrak053938的表达密切相关。

综上所述，本发明提供了一种中药组合物的组成及制备方法，该组合物具有较好的治疗肺纤维化的效果，且发现其保护肺泡上皮细胞和抑制肌成纤维细胞的活性的机制可能涉及mirna和lncrna。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。