一种含辣椒素和索拉非尼的药物组合物及其应用的制作方法

本发明涉及抗肿瘤药物领域，具体涉及一种含辣椒素和索拉非尼的药物组合物及其应用。

背景技术：

原发性肝癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势，严重威胁着人类的健康。在中国，由于存在着较为严重的乙型肝炎病毒感染等致癌风险因素，肝癌的发病率和死亡率态势尤为严峻。根据世界卫生组织2014年发布的统计报告，2012年中国肝癌新发病例数超过40万，约占全球新发病例总数的55％。肝癌起病隐匿，多数患者首次确诊时已处于中晚期，失去手术治疗的最佳时机。射频消融、肝动脉化疗栓塞术等局部疗法在应对微小转移灶方面亦受到限制。因此，系统化疗是临床上亟需的治疗手段。

靶向药物索拉非尼(sorafinib)是近年来在美国、欧盟和中国等多个国家批准应用于临床的肝癌和肾癌系统化疗药物。索拉非尼通过双重机制发挥抗肿瘤作用：一方面通过抑制肿瘤细胞RAF/MEK/ERK信号传导通路，直接抑制肿瘤生长；另一方面，它又可通过抑制血管内皮生长因子受体(VEGFR)和血小板衍生生长因子受体(PDGFR)而阻断肿瘤新生血管的形成，间接抑制肿瘤细胞的生长。索拉非尼是肝癌分子靶向药物治疗中的一座里程碑式的发现，在晚期肝癌综合性治疗方案中发挥着无法替代的治疗作用。尽管如此，索拉非尼的临床疗效尚不能令人十分满意。临床实践发现肝癌对索拉非尼存在不同程度的先天性耐药，经索拉非尼治疗的患者只有43％的病例能够得到短期控制。因此探索能够增强索拉非尼疗效的药物，特别是天然存在的对人体毒副作用小的药食同源物质，具有十分重要的意义。

CN103933039A公开了索拉非尼和一种天然药物水飞蓟宾的组合物，二者在抑制肝癌细胞生长增殖方面具有协同作用。CN102836160A公开了索拉非尼和一种化学合成小分子物质ABT-263的组合物，二者联合用药在抗肿瘤效果上具有协同和增效作用。

辣椒是人们广泛食用的一种蔬菜和调味品，其辛辣感源于其中所含有的辣椒素类物质，包括辣椒素(capsaicin)、二氢辣椒素(dihydrocasaicin)、降二氢辣椒素(nordihydrocapsaicin)等。辣椒素是辣椒素类物质中含量最高的组分，约占总量的69％。辣椒素具有许多药理活性，可用于镇痛和抗炎等。近年来的研究表明，辣椒素还具有一定的抗肿瘤活性，对肝癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌和膀胱癌等恶性肿瘤细胞具有抑制增殖和诱导凋亡的作用。辣椒素的抗肿瘤作用与下列因素有关：增加细胞膜通透性、抑制线粒体呼吸；上调抗癌基因p53表达和抑制细胞信号转导通路JNK；增加细胞内活性氧的含量。

CN104447777A公开了一种辣椒素-喜树碱类抗癌药物偶联物，该偶联物在体内能够以水解的方式直接释放辣椒素和喜树碱类药物，二者具有协同的抗肿瘤作用。CN104983900A公开了辣椒提取物与原青花素联合使用能够预防癌症化疗引起的恶心呕吐，同时起到辅助抑制肿瘤的作用。

目前，尚无将辣椒素与索拉非尼联合用药治疗恶性肿瘤的报道。

技术实现要素：

发明目的：为解决现有技术中存在的问题，本发明提出一种含辣椒素和索拉非尼的药物组合物及其应用，提高了抗肿瘤效果。

技术方案：为实现上述技术目的，本发明提出了一种含辣椒素和索拉非尼的药物组合物，其中，所述药物组合物中辣椒素与索拉非尼的摩尔比为5:1～10:1。

作为优选，所述含辣椒素和索拉非尼的药物组合物中，辣椒素和索拉非尼的摩尔比为10:1。

其中，所述含辣椒素和索拉非尼的药物组合物还包括药学上可接受的载体，所述药学上可接受的载体可以为本领域技术人员公知的药用载体。

本发明还提出了上述药物组合物在制备用于治疗恶性肿瘤的药物上的用途。

其中，所述恶性肿瘤为原发性肝癌和肾癌中的任意一种。

本发明的药物组合物可以以药剂学中常用的各种口服剂型给药。上述药剂学上常用的各种口服剂型可以是片剂、胶囊、颗粒剂、口服液等。

另外，还可按照常规方法将药物组合物中的单味活性药物或药物组合物制成缓控释制剂，如缓释片、微丸或控释片。

药理学试验表明，本发明的含辣椒素和索拉非尼的药物组合物具有协同治疗原发性肝癌等恶性肿瘤的功用，所述的恶性肿瘤优选为原发性肝癌和肾癌。

有益效果：与现有技术相比，本发明的含辣椒素和索拉非尼的药用组合物的抗肿瘤作用显著强于单一药物，辣椒素和索拉非尼联合使用可使药效产生协同作用。特别地，当辣椒素与索拉非尼的摩尔比为10:1的时候，二者的协同作用最好。

附图说明

图1索拉非尼联合辣椒素对肿瘤细胞增殖的抑制作用

图2索拉非尼联合辣椒素对肿瘤细胞形态的影响

图3索拉非尼联合辣椒素对肿瘤细胞Caspase 3/7活性的影响

具体实施方式

以下实施例所用的肿瘤细胞株来源如下：肝癌细胞PLC/PRF/5和肾癌细胞OS-RC-2来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

药物与试剂：索拉非尼购自美国Selleck Chemicals公司；辣椒素购自英国Tocris公司。两种药物均用二甲基亚砜(DMSO)溶解，于-80℃保存，实验时稀释至工作浓度(DMSO浓度<0.5％)。MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)、Hoechst33258、Propidium Iodide(PI)及Caspase 3/7检测试剂均购自美国ThermoFisher公司。

实施例1索拉非尼与辣椒素对肿瘤细胞半数抑制浓度(IC₅₀)的测定。

本实施例采用MTT法测定辣椒素和索拉非尼对肝癌细胞PLC/PRF/5和肾癌细胞OS-RC-2的抑制作用。细胞以5×10⁴/mL的浓度接种于96孔培养板，每孔100μL，培养过夜待细胞贴壁后加入药物。索拉非尼设置5个药物浓度，分别是0.3、1、3、10、30μM；辣椒素设置5个药物浓度，分别是10、30、100、300、1000μM。细胞与药物溶液在培养箱中孵育72小时后，每孔加入10μL MTT溶液(5mg/mL)，37℃孵育4小时，弃培养基，每孔加入150μL DMSO，37℃放置1小时，然后用酶标仪在490nm处测定各孔的吸光度(OD)，计算药物对细胞的抑制率。细胞抑制率计算公式为：抑制率(％)＝(对照组OD值–试验组OD值)/(对照组OD值–空白组OD值)×100％。

结果表明，索拉非尼和辣椒素均能剂量依赖性地抑制肿瘤细胞的增殖。索拉非尼对PLC/PRF/5和OS-RC-2细胞的半数抑制浓度分别为7.6和17.0μM。辣椒素对PLC/PRF/5和OS-RC-2细胞增殖的半数抑制浓度分别为137.0和169.8μM。

实施例2索拉非尼联合辣椒素对肿瘤细胞增殖的抑制作用。

将对数生长期的PLC/PRF/5和OS-RC-2细胞以5×10⁴/mL的浓度接种于96孔培养板，每孔100μL，培养过夜待细胞贴壁后加入药物。实验分组如下：阴性对照组、辣椒素组、索拉非尼组、辣椒素和索拉非尼联合给药组。辣椒素组分别给予10、50、100μM的辣椒素；索拉非尼组给予10μM的索拉非尼；联合用药组按1:1、5:1、10:1的比例同时加入辣椒素和索拉非尼(联合用药组1：辣椒素10μM+索拉非尼10μM；联合用药组2：辣椒素50μM+索拉非尼10μM；联合用药组3：辣椒素100μM+索拉非尼10μM)。细胞与药物溶液在培养箱中孵育72小时后，每孔加入10μL MTT溶液(5mg/mL)，37℃孵育4小时，弃培养基，每孔加入150μL DMSO，37℃放置1小时，然后用酶标仪在490nm处测定各孔的吸光度，计算药物对肿瘤细胞增殖的抑制率。用Chou-Talalay联合指数法判定索拉非尼和辣椒素相互作用的类型(拮抗、相加或协同效应)。用CompuSyn软件计算药物联合效应指数(combination index,CI)，当CI值在0.90-1.10范围内时判定为相加作用，当CI值小于0.90时判定为协同作用，当CI值大于1.1时判定为拮抗作用。

实验结果如图1所示，辣椒素浓度为10μM时不能显著增强索拉非尼对PLC/PRF/5和OS-RC-2细胞的抑制作用(联合用药组1，p>0.05)，但在50和100μM时则能明显增强索拉非尼的抗增殖作用(联合用药组2和组3，p<0.01)，提示辣椒素与索拉非尼的摩尔比为5:1～10:1时，药物组合物的疗效可明显优于单一药物。进一步计算两种药物的联合效应指数CI，结果如下：在PLC/PRF/5细胞，辣椒素与索拉非尼的摩尔比为5:1和10:1时，CI值分别为1.09和0.55，提示前者为相加效应而后者为协同效应；在OS-RC-2细胞，辣椒素和索拉非尼的摩尔比为5:1和10:1时，CI值分别为0.43和0.32，提示在这两种比例下药物的相互作用均为协同效应，但后者的协同效应更加明显。以上结果表明，辣椒素与索拉非尼的摩尔比在5:1时即可获得相加或协同的抗肿瘤效应，当其摩尔比在10:1时对两种细胞均呈现出协同的抗肿瘤效应。

实施例3辣椒素联合索拉非尼对肿瘤细胞形态的影响。

将对数生长期的PLC/PRF/5和OS-RC-2细胞以1×10⁵/mL的浓度接种于96孔培养板，每孔100μL，培养过夜待细胞贴壁后加入药物。实验分组如下：阴性对照组、辣椒素组、索拉非尼组、辣椒素和索拉非尼联合给药组。辣椒素组给予100μM辣椒素；索拉非尼组给予10μM索拉非尼；联合用药组同时给予100μM辣椒素和10μM索拉非尼。细胞与药物在培养箱中孵育24小时后用倒置相差显微镜观察细胞的形态。

肝癌PLC/PRF/5细胞经过不同药物处理后的照片如图2A所示：阴性对照组细胞自然铺展于孔底，外观柔和饱满，形态正常；索拉非尼处理组，细胞皱缩，部分细胞脱壁，胞质中黑色颗粒状物质增多并出现空泡，提示细胞在药物作用下出现凋亡的迹象；辣椒素处理组，细胞中颗粒状物质增加，部分细胞细胞膜有皱缩的现象；辣椒素和索拉非尼联合处理组，大量细胞脱壁变圆，部分细胞破碎，提示细胞发生凋亡。肾癌OS-RC-2细胞经药物处理后形态的变化类似于PLC/PRF/5细胞。本实验结果表明，辣椒素联合索拉非尼对肿瘤细胞外观形态的影响最大，并提示细胞在药物的处理下可能发生了凋亡。

实施例4索拉非尼联合辣椒素诱导肿瘤细胞凋亡。

采用Hoechst 33258和PI双染法检测索拉非尼、辣椒素及二者联用对PLC/PRF/5细胞凋亡的影响。将PLC/PRF/5细胞以5×10⁴/mL的浓度接种于24孔培养板，每孔2mL，培养过夜待细胞贴壁后加入药物。给药方案设计如下：辣椒素组给予100μM辣椒素；索拉非尼组给予10μM索拉非尼；联合用药组同时给予100μM辣椒素和10μM索拉非尼。细胞与药物在培养箱中孵育24小时，收集细胞，分别进行Hoechst 33258和PI染色，然后用免疫荧光显微镜观察，在5个不同的区域随机拍照，计数发生凋亡的细胞数和总细胞数，计算细胞凋亡率。

Hoechst 33258和PI双染实验结果表明，阴性对照组细胞凋亡率为0.41％，辣椒素组细胞凋亡率为4.22％，索拉非尼组细胞凋亡率为9.76％，辣椒素和索拉非尼联用组细胞凋亡率为30.58％。联合用药组细胞凋亡率显著高于索拉非尼组和辣椒素组(p<0.05)。

实施例5辣椒素联合索拉非尼对凋亡相关蛋白Caspase 3/7活性的影响

Caspase蛋白级联激活能够直接导致细胞凋亡。本实施例采用荧光显微镜检测辣椒素联合索拉非尼对肝癌PLC/PRF/5细胞Caspase 3/7活性的影响。将PLC/PRF/5细胞以2.5×10⁵/mL的浓度接种于24孔培养板，每孔400μL，培养过夜待细胞贴壁后加入药物。给药方案设计如下：辣椒素组药物浓度为100μM；索拉非尼组药物浓度为10μM；联合用药组同时加入辣椒素和索拉非尼(浓度同上)。细胞与药物在培养箱中孵育24小时，弃培养基，加入Caspase 3/7检测试剂CellEvent^TMCaspase-3/7Green Detection Reagent，37℃孵育20分钟，荧光显微镜观察。Caspase 3/7活化的细胞显现绿色荧光，每孔随机取5个视野，计数并取平均值。

结果如图3所示，联合用药组显现绿色荧光的细胞数显著多于索拉非尼或辣椒素单独用药组(p<0.05)，提示联合用药可以更加有效的激活PLC/PRF/5细胞中的Caspase 3/7，从而诱导细胞发生凋亡。