核酸‑脂聚合物组合物的制作方法

本申请是申请日为2008年8月6日、申请号为200880110306.5、发明名称“核酸-脂聚合物组合物”的专利申请的分案申请。

本发明涉及包含核酸和脂聚合物的浓缩稳定制剂，还涉及所述制剂的制备方法和应用。因此，本发明涉及分子生物学和生物化学领域。

背景技术：

由于其更好的安全顺应性、简单的化学和经济有效的制造，合成基因传输载体具有比病毒载体更显著的优点。然而，由于合成载体与病毒载体相比较低的转染效率，因而大多数对合成基因传输体系的开发致力于改善传输效率。结果，尽管在制剂稳定性、扩大规模和给药灵活性中已经发现问题，但对合成传输体系的药物开发却几乎没有给予关注。自组装为纳米颗粒的含dna药物常常显示出较差的稳定性，特别是当制剂为水性悬浮液时。在这类制剂中，带有合成载体的dna通常会随时间进行而聚集，尤其在临床设定中的最佳给药所需的浓度时。这类制剂往往难以制备浓度>0.3mg/ml的dna，这限制了其商业应用，尤其是对于其中体积的约束会限制灵活给药的局部输送。dna聚集降低或消除了dna的活性并因此使组合物不适于在治疗中使用。

所述物理不稳定性是转染活性损失的基本原因之一。由于脂双层的高曲率或脂质从dna物理解离而表现出的颗粒破裂或融合也已经被假定为基于阳离子脂质的基因传输复合物的不良稳定性和聚集的可能的根本原因。如传输载体的氧化性水解等化学修饰也可能促成颗粒不稳定性。

由于不良稳定性，早期临床试验需要在病床边制备dna制剂。不具备制备和储存浓度为最佳给药所需的临床产品的能力是病毒dna产品在广泛临床实践和商业化中的主要障碍。这将需要培训过药物配方的医师并提出实地质量控制措施。

冻干法是一种有用的用于改善多种药品的长期稳定性的方法。然而，该方法一般不适于干燥带有合成载体的dna复合物，这是因为如此易于改变所述dna复合物的物理化学性质并导致聚集和在复水(reconstitution)时转染的损失。

已经尝试了若干方法以避免制剂在冻干过程中聚集和损伤。在某些情况下，在如低分子量糖、葡聚糖和聚乙二醇等冷冻保护剂的存在下冻干dna复合物可以对产品提供更好的稳定性，但该方法似乎没有改善给药灵活性。出于这一目的通常最常用的方法是添加糖。已发现测试糖中许多会在某种程度上避免制剂的损伤和颗粒聚集，但该效果的品质随糖的种类和所用的传输载体的不同而变化。

尽管冻干提供了对制剂保存期的一定改善，生产冻干dna产品所需要的条件使得仅能用于有限的药学应用。即使采用最有效的冻干保护剂糖，也需要很高的糖/dna摩尔比(通常大于1000:1)以获得稳定性。结果，往往必须将冻干产品稀释很大的倍数以获得等渗制剂，而这导致最终dna浓度降至冻干前的dna浓度。对于许多阳离子载体，最终dna浓度通常可为约0.1mg/ml～0.2mg/ml，且常常低于0.1mg/ml。尽管低浓度制剂足以用于体外研究，其临床应用可能因最佳给药的高体积需求而受到限制。例如，在稳定性所需的最佳糖浓度下，1mg的dna剂量可能需要被稀释在5ml～10ml中以保持等渗性，这对于局部体内施用而言体积过大。抑制了灵活给药的这种药学限制是合成基因传输体系在人类临床试验中效力不理想的主要促成因素之一，并且确证需要稳定且生物活性的更浓缩的dna制剂。

技术实现要素：

本发明提供了在高核酸浓度下展示出出人意料的稳定性并且增加核酸转染的效率和给药灵活性的组合物。本文所述的组合物能被有效地冻干并复水为包括高核酸浓度在内的各种核酸浓度，而不会损失生物活性或使核酸聚集。

在一方面，本发明提供了包含阳离子脂聚合物和至少约0.5mg/ml的核酸的混合物的组合物，优选为药物组合物，其中所述混合物悬浮于水溶液中。所述阳离子脂聚合物包含具有独立地与其共价相连的胆固醇和聚乙二醇基团的阳离子聚合物主链。胆固醇与阳离子聚合物主链的摩尔比是约0.1～约10，而聚乙二醇与阳离子聚合物主链的摩尔比是约0.1～约10。所述组合物还可包含填料赋形剂。在某些方面，核酸与脂聚合物的混合物形成复合物。在某些方面，所述组合物包含缩合的核酸。缩合的核酸的量通常取决于核酸的组成性构成和制备组合物时的条件。

本发明还提供了制备上述组合物的方法。

在另一方面，本发明提供了核酸和脂聚合物的冻干组合物。本发明的冻干组合物，优选为冻干药物组合物包含填料赋形剂、缩合核酸和阳离子脂聚合物。如上所述，阳离子脂聚合物包含具有与其共价相连的胆固醇和聚乙二醇基团的阳离子聚合物主链，且其中胆固醇与阳离子聚合物主链的摩尔比是约0.1～约10，而聚乙二醇与阳离子聚合物主链的摩尔比是约0.1～约10。

另外，本发明还提供了使用本文所述的组合物通过例如转染各种细胞和组织来治疗疾病和/或病症的方法。

附图说明

图1是本发明的制造过程的示意图。

图2显示了浓缩状态和非浓缩状态下的核酸粒径的图。

图3显示了电泳实验结果以显示核酸的缩合。

图4显示了本发明的另一个实施方式的转染活性的图。

图5a和图5b是显示采用带有和不带il-12的脂聚合物进行治疗的结果的神经切片的照片。

图6显示了带有脂聚合物的il-12与对照相比的抗癌效力的两幅图。

图7a和图7b是不同核酸/阳离子聚合物混合物的粒径的图。

图8a和图8b是由不同核酸/阳离子聚合物混合物引起的荧光素酶表达的图。

图9是显示核酸/阳离子脂聚合物组合物在长期储存后的生物活性的图。

具体实施方式

在公开和描述本发明之前，应当理解，本发明不限于本文所公开的特定的结构、方法步骤或材料，而可延伸至相关领域的普通技术人员认可的所属结构、方法步骤或材料的等同物。还应理解，由于本发明的范围仅由所附权利要求及其等同物的限制，故本文采用的术语仅用于描述特定实施方式的目的而并非旨在进行限制。

必须注意的是，除非上下文明确地另外指出，如本说明书和所附权利要求中所用，单数形式“a”、“an”和“the”也包括复数指代物。

如本文所用，术语“缩合的核酸”和“部分缩合的核酸”被用来指已与本发明的阳离子脂聚合物接触的核酸。在某些方面，缩合核酸保持与阳离子脂聚合物相接触。缩合核酸通常比非缩合核酸占据显著更小的体积。然而，认识到缩合核酸的量可能随局部环境的变化而不同(例如，脂质之于水性环境)。在本发明的不同方面中，缩合核酸是核酸和阳离子脂聚合物的纳米颗粒中的那些核酸，所述纳米颗粒缩合的尺寸为约50nm～约300nm、更优选为约50nm～200nm且进而更优选为约50nm～150nm。“部分缩合的核酸”是指已与本发明的阳离子脂聚合物接触的核酸，其中所述核酸未达到完全缩合，然而仍然比非缩合核酸占据明显更小的体积。

如本文所用，术语“复合物”是指与脂聚合物，优选为阳离子脂聚合物相结合的核酸。包含缩合核酸和阳离子脂聚合物的复合物通常作为颗粒，优选作为纳米颗粒而存在。

如本文所用，术语“进行转染”和“转染”是指核酸从细胞的外部环境向细胞内环境(特别是指细胞质和细胞核)的转运。不受特定理论的束缚，应该理解，核酸可以在被封装在一个或多个阳离子聚合物/核酸复合物内或附着于其上或者被与其一起携带后被输送至细胞。特定的转染实例将核酸输送至细胞核。

如本文所用，“受试对象”是指可以受益于本发明的药物组合物的施用或方法的哺乳动物。受试对象的实例包括人类，并且还可包括如马、猪、牛、狗、猫、兔和水生哺乳动物等其它动物。

如本文所用，“组合物”是指两种以上的化合物、元素或分子的混合物。在某些方面，术语“组合物”被用来指代核酸和传输体系的混合物。

如本文所用，“n:p比”是指功能化阳离子脂聚合物中的氨基氮与核酸中的磷酸根基团的摩尔比。

如本文所用，“物理化学性质”是指例如但不限于带有阳离子聚合物的核酸复合物的粒径和表面电荷、颗粒溶液的ph和渗透摩尔浓度(osmolality)等各种性质。

如本文所用，术语“施用”、“进行施用”和“输送”是指将组合物呈递给受试对象的方式。施用可以通过如口服、胃肠外、透皮、吸入和植入等各种本领域已知途径来完成。因此，口服施用可以通过吞咽、咀嚼、吮吸包含组合物的口服剂型来实现。胃肠外施用可以通过在静脉内、动脉内、肌内、关节内、鞘内、腹膜内、皮下等注射组合物来实现。作此用途的注射剂可以被制备为作为液体溶液或悬浮液的常规形式，或者适于在注射前在液体中制备为溶液或悬浮液的固体形式，或被制备为乳化液。另外，透皮施用可以通过将透皮组合物涂敷、粘附、展涂、贴附、灌涂、按压或涂抹于皮肤表面上而完成。这些及其它施用方法是本领域内公知的。在一个具体方面，施用可包括将组合物输送至受试对象从而所述组合物进行系统循环并与靶标细胞结合以便通过胞吞作用而被摄取。

如本文所用，术语“核酸”是指dna和rna以及它们的合成同源物。核酸的非限制性实例可以包括编码蛋白的质粒dna或产生核苷酸序列的抑制性rna、单链或双链、错义、反义、无义的合成序列以及控制蛋白、肽和核酸制备的开关调节性核苷酸和速率调节性核苷酸。另外，核酸还可以包括但不限于基因组dna、cdna、sirna、shrna、mrna、trna、rrna、杂交序列或者合成或半合成序列以及天然来源或人工来源的核酸。在一方面，核苷酸序列还可以包括对治疗性蛋白的合成或抑制进行编码的那些核苷酸序列。所述治疗性蛋白的非限制性实例可以包括抗癌剂、生长因子、降血糖剂、抗血管生成剂、细菌抗原、病毒抗原、肿瘤抗原或代谢酶。抗癌剂的实例可以包括白细胞介素-2、白细胞介素-4、白细胞介素-7、白细胞介素-12、白细胞介素-15、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞刺激因子、抗血管生成剂、肿瘤抑制基因、胸苷激酶、enos、inos、p53、p16、tnf-α、fas配体、突变癌基因、肿瘤抗原、病毒抗原或细菌抗原。在另一方面，质粒dna可以编码shrna分子，所述shrna分子被设计来抑制参与肿瘤细胞或其它过度增殖细胞的生长或维持的蛋白。此外，在某些方面，质粒dna可以同时编码治疗性蛋白和一种或多种shrna。在其他方面，核酸还可以为质粒dna和包括正义rna、反义rna、核酶在内的合成rna的混合物。另外，核酸的尺寸可能有所不同，可从寡核苷酸到染色体。这些核酸可以源自人类、动物、植物、细菌、病毒和合成。它们可以通过本领域技术人员已知的任何技术而获得。

如本文所用，术语“浓缩的”是指其稀释度被降低的组合物。在本发明的某些方面，“浓缩的”组合物包含缩合dna(优选在等渗溶液中)。在本发明的一个特定方面，浓缩的组合物包含悬浮于等渗溶液中的至少约0.5mg/ml的缩合dna。

如本文所用，术语“聚合主链”用于指代重均分子量在指定范围内的一系列聚合主链分子。就此而言，当如胆固醇等分子被描述为与聚合主链分子以一定的摩尔比共价连接时，应该理解所述比例代表与所述聚合主链分子系列连接的胆固醇分子的平均数目。例如，如果据描述胆固醇以0.5的摩尔比与聚合物主链共价连接，则平均将有一半的聚合主链分子具有相连的胆固醇。作为另一个实例，如果据描述胆固醇以1.0的摩尔比与聚合物主链共价连接，则平均每个聚合主链分子将与一个胆固醇分子相连。然而，实际上应该理解的是，某些聚合主链分子在这种情况下可能没有相连的胆固醇分子，而其它聚合主链分子可能有多个相连的胆固醇分子，而所述比例是由相连的胆固醇分子的平均数导出。同样的推理适用于聚乙二醇与聚合主链的摩尔比。

如本文所用，术语“肽”可以被用来指代包含两个以上的由一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的α-氨基相连的氨基酸的天然或合成分子。本发明的肽不受长度限制，因而“肽”可以包括多肽和蛋白。

如本文所用，术语“共价的”和“共价地”是指电子在原子对间共享的化学键。

如本文所用，为方便起见，可以将多个项目、结构元素、组成元素和/或材料呈现在一个通表中。然而，应该将列表中的每个成员如同被单独确定为独立和独特的成员那样看待这些列表。因此，在有相反的指示时，不应仅凭它们出现在共同的组中而将这类列表中的任何个体成员视作相同列表中任何其它成员的实际等价物。

浓度、量和其它数字数据可以以范围形式在本文中表达或呈现。应该理解，这种范围形式仅出于方便和简洁而使用，因而应将其灵活地解读为不仅包含所述范围的极值所明确列出的数值，而且还包含该范围内涵盖的所有的个体数值或子范围，如同每个数值和子范围都被明确列出。举例而言，“约1～约5”的数值范围应被解读为不仅包含约1～约5的明确列出值，还包含该指定范围内的各个值和子范围。因此，在该数值范围内包含如2、3、和4等个体数值和如1～3、2～4和3～5等子范围以及单独的1、2、3、4和5。相同的原则也应用于仅列出作为最小值或最大值的一个数值的范围。此外，不论范围的宽度或所描述的特性如何，该解读方式都适用。

本发明提供了可以在不影响核酸或核酸组合物的物理化学性质或生物性质时将低浓度核酸组合物(例如，0.15mg/ml)高度浓缩的技术。在一方面，可以将核酸组合物浓缩33倍而不会影响所述性质。这些高度浓缩的核酸组合物使得可以使用范围较大的体内给药方案，这在以前由于与试图达到高于约0.3mg/ml的先前尝试相关的较差稳定性而极为困难。

更具体而言，本发明提供了浓缩且稳定的药物组合物，包括用于制备和使用这类组合物的方法。在一方面，例如，提供的药物组合物包含至少约0.5mg/ml的核酸，其中，核酸与阳离子脂聚合物复合并且该复合物悬浮于等渗溶液中。悬浮于等渗溶液中的所述复合物包含部分缩合或完全缩合的核酸分子。所述阳离子脂聚合物包含具有与其共价相连的胆固醇和聚乙二醇基团(即分子)的阳离子聚合物主链。胆固醇分子与阳离子聚合物主链的摩尔比为约0.1～约10，而聚乙二醇分子与阳离子聚合物主链的摩尔比为约0.1～约10。在另一方面，聚乙二醇分子与阳离子脂聚合物中的阳离子聚合物主链的摩尔比为约1～约10。在再一方面，聚乙二醇分子与阳离子脂聚合物中的阳离子聚合物主链的摩尔比为约1～约5。在另一方面，胆固醇分子与阳离子脂聚合物中的阳离子聚合物主链的摩尔比为约0.3～约5。在又一方面，胆固醇分子与阳离子脂聚合物中的阳离子聚合物主链的摩尔比为约0.4～约1.5。

所述组合物还包含填料赋形剂。所得组合物适于将核酸输送至靶标细胞以便根据核酸的功能来诱发、抑制或修饰生物响应。

在一方面，胆固醇和聚乙二醇分子可以独立地并直接地与阳离子聚合物主链共价连接。在另一方面，胆固醇和聚乙二醇分子各自间接地与阳离子聚合物主链共价连接。例如，可以通过连接子或间隔子使胆固醇分子直接或间接地与聚乙二醇分子偶联，而该聚乙二醇分子再与阳离子聚合物主链共价连接。另外一种方式，胆固醇分子可以直接与阳离子脂聚合物主链连接，而聚乙二醇分子通过连接子或间隔子间接地与所述脂聚合物连接。

聚乙二醇与阳离子聚合物主链之间的一个具体连接子是带有端羧基的亚烷基，优选为1～20个碳原子、且更优选为约2～约4个碳原子的直链亚烷基。该连接子上的端羧基在与阳离子聚合物主链的氨基连接时形成阳离子脂聚合物与聚乙二醇之间的酰胺键。适于与阳离子聚合物主链分子反应的起始聚乙二醇是带有以活化基团(例如，n-羟基琥珀酰亚胺基酯)结尾的连接子分子的聚乙二醇。

从聚乙烯亚胺、氯甲酸胆固醇酯(忽略立体化学)和甲氧基聚乙二醇-丙酸n-羟基琥珀酰亚胺基脂的反应得到的阳离子脂聚合物结构的一部分的实例是以下结构。图例反映了伯胺基、仲胺基和叔胺基在聚乙烯亚胺中的适当分布，并且此处为明确起见，采取了不存在的规则聚乙烯亚胺链。

在本发明的各方面中，n通常为约8～约20，更具体为约10～约15，且进而更具体为约12；x通常为约2～约3，更具体为约2.5；y通常为约6～约10，更具体为约7～约9，进而更具体为约7.5；z通常为约0.4～约0.8，更具体为约0.5～约0.7，且进而更具体为约0.6。

另外，在某些方面，可以使用本文所提出的技术将此前已经使用二次缩合体系(secondarycondensingsystem)缩合的核酸进一步缩合以实现核酸在高浓度下更高的稳定性。同样地，在根据本发明的方面进行缩合之前，核酸可以处于部分缩合形式或非缩合形式。二次缩合体系可以包括本领域普通技术人员已知的任何缩合材料或技术，这些缩合材料或技术包括但不限于阳离子脂、阳离子肽、环糊精、阳离子化明胶、树枝状分子(dendrimer)、壳聚糖及其组合。

对于本发明的方面的组合物可以实现各种核酸缩合程度。在一方面，通过与阳离子聚合物形成复合物而将组合物中的所有核酸或很大部分的核酸缩合。在另一方面，组合物中约30重量％的核酸被缩合。在又一方面，组合物中约50重量％的核酸被缩合。在再一方面，组合物中约70重量％的核酸被缩合。在另一方面，约90重量％的核酸被缩合。

另外，组合物中核酸的浓度会根据组合物中所用材料、浓缩方法和核酸的预期用途而有所不同。然而，在一方面，核酸浓度至少为约0.5mg/ml。在另一方面，核酸浓度至少为约1mg/ml。在又一方面，核酸浓度至少为约3mg/ml。在再一方面，核酸浓度可以至少为约5mg/ml。在另一方面，核酸浓度可以至少为约10mg/ml。在又一方面，核酸浓度可以至少为约20mg/ml。在再一方面，核酸浓度可以为约10mg/ml～约40mg/ml。

可以利用各种方法来确定核酸组合物的缩合程度。例如，在一方面，可以使组合物经过电泳来确定组合物中的核酸与添加至组合物中的阳离子聚合物形成聚合物的程度。带负电的核酸与带正电的阳离子脂聚合物的静电吸引抑制核酸移动通过琼脂糖凝胶。于是，进行电泳后，通过与阳离子聚合物复合而缩合的核酸在凝胶中保持不动，而非缩合的核酸、没有与阳离子聚合物结合的核酸已移动了与凝胶中的电流强度有关的一定距离。在另一个实例中，可以通过组合物内的粒径来确定核酸的缩合。粒径可以通过动态光散射来测定。通常，缩合核酸将具有比非缩合核酸更小的粒径。优选的缩合核酸是处在核酸与阳离子脂聚合物的纳米颗粒中的那些核酸，其尺寸为约50nm～约300nm、更优选为约50nm～200nm且进而更优选为约50nm～150nm。

在本发明的方面的组合物和方法中可以利用任何已知的核酸，包括上述那些实例。同样，不应将本文所述的核酸视为一种限制。在一方面，例如，核酸可以包括编码蛋白、多肽或肽的质粒。众所周知，许多肽在根据本发明的方面配制为药物组合物时被证实是有益的。一些这类肽的非限制性实例可以包括白细胞介素-2、白细胞介素-4、白细胞介素-7、白细胞介素-12、白细胞介素-15、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、血管生成剂、凝血因子、降血糖剂、凋亡因子、抗血管生成剂、胸苷激酶、p53、ip10、p16、tnf-α、fas配体、肿瘤抗原、神经肽、病毒抗原、细菌抗原及其组合。在一个具体方面，核酸可以是编码白细胞介素-12的质粒。在另一方面，核酸可以是编码抑制性核糖核酸的质粒。在再一方面，核酸可以是合成短干扰核糖核酸。在又一方面，核酸是设计来抑制治疗性肽的表达的反义分子。

如上文所述，阳离子脂聚合物可以包含具有与其共价连接的胆固醇和聚乙二醇的阳离子聚合物主链。阳离子聚合物主链可以包括本领域普通技术人员已知的可以用于缩合和浓缩本发明的各方面的核酸的任何阳离子聚合物。然而，在一方面，阳离子聚合物主链可以包括阳离子聚合物主链是选自聚乙烯亚胺、聚(三甲亚胺)、聚(四甲亚胺)、聚丙烯亚胺、氨基糖苷-聚胺、二脱氧二氨基-b-环糊精、精胺、亚精胺、聚甲基丙烯酸(2-二甲基氨基)乙酯、聚赖氨酸、聚组氨酸、聚精氨酸、阳离子化明胶、树枝状分子、壳聚糖及其组合。在一个具体方面，阳离子聚合物主链可以是聚乙烯亚胺。

在一个特定方面，脂聚合物由独立地与胆固醇和聚乙二醇共价连接的聚乙烯亚胺(pei)构成。在该方面，阳离子脂聚合物中peg:pei:胆固醇的平均摩尔比是约2～3:1:0.25～1，且优选为约2.25～2.75:1:0.4～0.8，且更优选为约2.5:1:0.6。在一个特定方面，该脂聚合物的分子量(作为游离碱)为约3kd～4kd，优选为约3.25kd～3.75kd，且更优选为约3.54kd；相应的盐酸盐的分子量为约4kd～5kd，优选为约4.5kd。

另外，阳离子聚合物主链的分子量可能根据包括核酸性质、组合物的预期用途等多种因素而有所不同。然而，在一方面，阳离子聚合物主链的分子量可能为约100～约500,000道尔顿。此外，阳离子脂聚合物的其它各种组分的分子量也可能不同。在一方面，例如，聚乙二醇的分子量可能为约50～约20,000道尔顿。

在构建本发明的药物组合物时，已发现功能化阳离子脂聚合物中的氨基氮与核酸中的磷酸根之间的摩尔比(n:p比)可能影响核酸可以被缩合和/或浓缩的程度。然而，最佳n:p比可能根据核酸的化学性质而在某种程度上有所不同，在一方面，阳离子聚合物主链中的氨基氮与核酸中的磷酸根之比为约0.1:1～约100:1。在另一方面，阳离子聚合物主链中的氨基氮与核酸中的磷酸根之比为约3:1～约20:1。在再一方面，阳离子聚合物主链中的氨基氮与核酸中的磷酸根之比为约6:1～约15:1。在其它方面，氨基氮与核酸中的磷酸根之比为约3:1～约100:1，或约5:1～约100:1，或约7:1～约100:1。在又一方面，该比例为约10:1～约100:1，或更优选为约10:1～约20:1。在一个具体方面，阳离子聚合物主链中的氨基氮与核酸中的磷酸根之比为约11:1。

另外，还设想可在所述药物组合物中包含填料赋形剂。这类填料可以为制剂提供多种有益性质，例如，冻干和复水期间的冷冻保护、粘合、等渗平衡、稳定化等。应该理解，不同的组合物之间填料材料可以不同，且所用的特定填料不应被视作限制性的。在一方面，例如，填料赋形剂可以包括各种糖、糖醇、淀粉、纤维素及其组合物。在另一方面，填料赋形剂可以包括乳糖、蔗糖、海藻糖、右旋糖、半乳糖、甘露醇、麦芽糖醇、麦芽糖、山梨糖醇、木糖醇、甘露糖、葡萄糖、果糖、聚乙烯吡咯烷酮、甘氨酸、麦芽糊精、羟甲基淀粉、明胶、山梨糖醇、菲可(ficol)、氯化钠、磷酸钙、碳酸钙、聚乙二醇及其组合。在又一方面，填料赋形剂可以包括乳糖、蔗糖、海藻糖、右旋糖、半乳糖、甘露醇、麦芽糖醇、麦芽糖、山梨糖醇、木糖醇、甘露糖、葡萄糖、果糖、聚乙烯吡咯烷酮、甘氨酸、麦芽糊精及其组合。在一个具体方面，填料赋形剂可以包括蔗糖。在另一个具体方面，填料赋形剂可以包括乳糖。

组合物中填料赋形剂的浓度可以为约0.01％～约5％，更具体为约0.1％～约3.0％，再更具体为约0.1％～约0.3％。

在某些方面，可能有益的是将阳离子脂聚合物功能化以使得可以靶定受试对象或培养物中的特定细胞或组织。这种靶定是公知的，且本文所说的实例不应被视作限制性的。在一方面，例如，阳离子脂聚合物可以包含与阳离子脂聚合物或聚乙二醇分子共价连接的靶定部分。这类靶定部分可以允许阳离子脂聚合物在受试对象中系统地循环以定位并特异性靶定特定的细胞类型或组织。这类靶定部分的实例可以包括转铁蛋白、去唾液酸糖蛋白、抗体、抗体片段、低密度脂蛋白、细胞受体、生长因子受体、细胞因子受体、叶酸、转铁蛋白、胰岛素、去唾液酸血清类粘蛋白、甘露糖-6-磷酸、甘露糖、白细胞介素、gm-csf、g-csf、m-csf、干细胞因子、红细胞生成素、表皮生长因子(egf)、胰岛素、去唾液酸血清类粘蛋白、甘露糖-6-磷酸、甘露糖、lewis^x和sialyllewis^x、n-乙酰乳糖胺、叶酸、半乳糖、乳糖，和血栓调节蛋白、如多粘菌素b和血球凝集素ha2等融合剂、亲溶酶体剂(lysosomotropicagent)、如t抗原等核定位信号(nls)以及它们的组合。特定靶定部分的选择和连接完全在本领域普通技术人员的知识范围内。

本发明还提供了能够被长期储存并在使用前复水的冻干药物组合物。在一方面，冻干药物组合物可以包含填料赋形剂和与阳离子脂聚合物缩合的核酸的冻干混合物，其中所述阳离子脂聚合物包含具有与其共价相连的胆固醇和聚乙二醇的阳离子聚合物主链，且其中胆固醇与阳离子聚合物主链的摩尔比为约0.1～约10，而聚乙二醇与阳离子聚合物主链的摩尔比为约0.1～约10。冻干药物组合物可以为从干粉到部分复水的混合物的多种形式。

本发明还包括制备含有缩合核酸的各种药物组合物的方法。在一方面，例如，本发明提供了制备具有以至少0.5mg/ml浓缩于等渗溶液中的缩合核酸的药物组合物的方法。该方法可以包括将核酸与阳离子脂聚合物在填料赋形剂中混合，其中所述阳离子脂聚合物包含具有与其共价相连的胆固醇和聚乙二醇的阳离子聚合物主链，且其中胆固醇与阳离子聚合物主链的摩尔比为约0.1～约10，而聚乙二醇与阳离子聚合物主链的摩尔比为约0.1～约10。可以将所述混合物冻干为粉末以浓缩核酸混合物并其后用稀释剂复水以形成包含在等渗溶液中的至少约0.5mg/ml的缩合核酸的溶液。

通常，所述组合物可以通过将核酸溶液与阳离子脂聚合物溶液在二糖的存在下混合并随后冻干并在等渗溶液中复水而获得。该方法可以缩放，从而生产数毫克(实验室规模)至数百毫克(gmp规模)的延长保存期的高度浓缩核酸制剂。如上所述，阳离子脂聚合物具有其中聚乙二醇和胆固醇通过共价键与之连接的阳离子聚合物主链。在聚乙烯亚胺的情形中，在一方面，聚乙二醇与聚乙烯亚胺之间的化学计量比以及胆固醇与聚乙烯亚胺之间的化学计量比分别为0.5～10和0.1～10。阳离子聚合物的化学组成对于获得高度浓缩的稳定核酸制剂可能非常重要。没有显示出胆固醇和peg连接的阳离子聚合物不容易产生稳定的高度浓缩制剂，如下文实施例中所示。

本发明的方面的组合物还可以与其它的缩合核酸复合物合并以在较高核酸浓度下获得更大的复合物稳定性。例如，可以添加不同量的peg-pei-胆固醇以提高在高核酸浓度下通常不稳定的其它核酸传输体系的稳定性。

在各个方面，合成传输体系包含核酸和可以通过本领域中可利用的各种技术来制备的阳离子载剂。已知有多种核酸用阳离子载剂：例如，聚乙烯亚胺、聚(三甲亚胺)、聚(四甲亚胺)、聚丙烯亚胺、氨基糖苷-聚胺、二脱氧二氨基-b-环糊精、精胺、亚精胺、聚甲基丙烯酸(2-二甲基氨基)乙酯、聚赖氨酸、聚组氨酸、聚精氨酸、阳离子化明胶、树枝状分子、壳聚糖、如1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(dotap)、n-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(dotma)、1-[2-油酰氧基乙基]-2-油烯基-3-(2-羟乙基)氯化咪唑啉(dotim)、2,3-二油烯基氧基-n-[2-(精胺羧基酰胺基)乙基]-n,n-二甲基-1-丙基三氟乙酸铵(dospa)、3β-[n-(n',n'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]盐酸胆固醇(dc-胆固醇hcl)、二(十七烷基)酰胺基(氨基乙酰基)亚精胺(dogs)、n,n-二硬脂酰基-n,n-二甲基溴化铵(ddab)、n-(1,2-二肉豆蔻氧基丙-3-基)-n,n-二甲基-n-羟乙基溴化铵(dmrie)、n,n-二油烯基-n,n-二甲基氯化铵(dodac)等阳离子脂类及其组合。当这些传输体系与peg-pei-胆固醇组合时，核酸传输体系的稳定性得到增加。

本发明的方面还提供了药物组合物的使用方法。例如，在一方面，哺乳动物细胞的转染可以包括使哺乳动物细胞与本文所述的组合物接触，并将哺乳动物细胞在一定条件下温育以使所述组合物能进入细胞并引发核酸的生物活性。这类转染技术是本领域普通技术人员已知的。另外，在另一方面，可以通过将组合物传输至温血生物体或受试对象内而转染靶标组织。这种传输可以通过如其中输送所述组合物还可以包括选自肿瘤内、腹膜内、静脉内、动脉内、气管内、肝门内、口服、颅内、肌内、关节内及其组合等施用形式进行。所述靶标组织可以包括会受益于转染的任何组织或组织的亚类。例如，所述靶标组织可以包括但不限于卵巢、子宫、胃、结肠、直肠、骨、血液、小肠、胰腺、乳腺、头、颈、肺、脾、肝、肾、脑、甲状腺、前列腺、膀胱、甲状腺、皮肤、腹腔、胸腔及其组合

实施例

本文提供以下实施例以增进对本发明的特定实施方式的更清晰的理解，但绝不意味着对其的任何限制。

制剂a

将1g的1800da支链聚乙烯亚胺(pei)(0.56mm)溶解于5ml氯仿中并置于ml圆底烧瓶中，在室温搅拌20分钟。将380mg氯甲酸胆固醇酯(0.84mm)和500mg活化甲氧基聚乙二醇(mpeg-spa，甲氧基聚乙二醇丙酸n-羟基琥珀亚酰胺基酯)(550da)(0.91mm)溶解于5ml氯仿中病转移至滴液漏斗中，该滴液漏斗位于含有pei溶液的圆底烧瓶的顶部。在5～10分钟中于室温将氯甲酸胆固醇酯和mpeg-spa的混合物缓慢添加至pei溶液中。将溶液在室温再搅拌4小时。通过旋转蒸发仪除去溶剂之后，在搅拌下将残余粘性材料溶解于20ml乙酸乙酯中。通过缓慢添加20ml正己烷将产物从溶剂中沉淀析出；将液体从产物倾析除去。用20ml的乙酸乙酯/正己烷混合物(体积比1/1)将产物洗涤两次。倾析除去液体后，通过氮气吹扫10～15分钟将材料干燥。将材料溶解于10ml的0.05nhcl以制备氨基的盐形式。使水溶液过滤通过0.2μm滤纸。通过冻干获得最终产物。

该实施例制剂的摩尔比是3.0摩尔mpeg-spa和1.28摩尔胆固醇与1摩尔pei分子偶联。

制剂b

将20g(11.1mmol)的支链pei(bpei)和200ml干燥氯仿共同混合以使bpei溶解。溶解后，在搅拌下于20～30分钟内将含4g氯甲酸胆固醇酯和18.7g(26mmol)活化甲氧基聚乙二醇(mpeg-spa，甲氧基聚乙二醇丙酸n-羟基琥珀亚酰胺基酯，mpeg分子量550，酯分子量719)的200ml干燥氯仿溶液逐滴添加至反应混合物中，接着是3～4小时的温育期。然后将混合物置于真空下以浓缩溶液并除去残留氯仿。将所得残留物溶解于320ml的1mhcl水溶液中并搅拌。将该ppc盐酸盐溶液再次在真空下浓缩，从而产生高度粘稠的材料。为了分离ppc盐酸盐并除去反应副产物和未反应的起始原料，将浓缩的混合物与丙酮(<0.4％水)并搅拌，从而导致ppc盐酸盐沉淀为游离漂浮的材料。沉淀后，弃去上清液。将吸湿性的ppc盐酸盐在真空下干燥。

首先通过制备ppc和dna在10％乳糖中的适当浓度的溶液来产生聚合物dna复合物。将阳离子聚合物(mg/ml)和dna(3mg/ml)在注射用水中的储备溶液稀释于0.3％～3％的乳糖溶液中：这是在复水后获得最终的10％乳糖浓度所必需的。然后在搅拌下将dna逐滴加入ppc溶液中并在室温温育15分钟以形成复合物。

将500μl制得的组合物添加至2ml硼硅酸盐玻璃瓶内并置于冻干机中。将玻璃瓶于-34℃冷却4小时，其后开始初次干燥。24小时后，将搁板温度升至20℃并在真空下再保持24小时。最后将搁板温度升至4℃并将玻璃瓶在真空下封口。

制剂c

将180毫克支链pei1800(0.1mm)溶解于4ml氯甲酸酯并在室温搅拌30分钟。将70毫克氯甲酸胆固醇酯(0.14mm)和48mgpeg330(0.14mm)溶解于1ml氯甲酸酯中，并用注射器在3～10分钟内缓慢添加至pei溶液中。将混合物在室温搅拌4小时。添加10ml乙酸乙酯以用于沉淀之后，将溶液在-20℃温育过夜，然后将液体从烧瓶中倾析除去。将剩余材料用5ml的乙酸乙酯/正己烷混合物(体积比为1/1)洗涤2次。通过氮气吹扫10～15分钟以干燥剩余材料，在20分钟内将其溶解于10ml的0.05nhcl中，然后使溶液过滤通过0.2μm注射器式过滤器。通过冷冻干燥将水溶液冻干以从聚合物中将水除去。

该制剂的摩尔比是0.85摩尔peg和0.9摩尔胆固醇与1摩尔pei分子偶联。

制剂d

将500毫克的25kda直链pei(0.02mm)溶解于30ml中并在65℃搅拌30分钟。将冷凝器和滴液漏斗与三颈烧瓶装配。将200mgmpeg-nhs1000(0.2mm)和40mg氯甲酸胆固醇酯(0.08mm)的5ml氯仿溶液在3～10分钟内缓慢添加至pei溶液中。将溶液在65℃再均匀搅拌4小时，并在旋转蒸发仪中将体积减至5ml。将溶液在50ml乙醚中沉淀以除去游离胆固醇，从烧瓶倾析除去液体，并用20ml乙醚将剩余材料洗涤2次。用纯氮气干燥后，将材料溶解于10ml的2.0nhcl和2ml三氟乙酸的混合物中。用mwco15000透析管将溶液在去离子水中透析48小时，每12小时更换新鲜水。将溶液冻干以除去水。

该制剂的摩尔比是12.0摩尔peg和5.0摩尔胆固醇与1摩尔pei分子偶联。

制剂e

将1g的pei(分子量：1200道尔顿)溶解于15ml无水二氯甲烷和100μl的三乙胺(tea)的混合物中。在冰上搅拌30分钟后，1.2g氯甲酸胆固醇酯缓慢添加至pei溶液中并将混合物在冰上搅拌过夜。通过添加乙醚使所得产物沉淀，接着离心并随即用额外的乙醚和丙酮洗涤。将非水溶性脂聚合物溶解于氯仿中以得到0.08g/ml的最终浓度。合成和纯化后，用maldi-toffms和¹hnmr对非水溶性脂聚合物进行表征。

非水溶性脂聚合物1200的nmr测定显示，与pei偶联的胆固醇的量约为40％。非水溶性脂聚合物的maldi-tof质谱分析显示其分子量约为1600。

制剂f

将3g的pei(分子量：1800道尔顿)在10ml无水二氯乙烷和100μl三乙胺的混合物中于冰上搅拌30分钟。将1g氯甲酸胆固醇酯溶解于5ml无水的冰冷二氯甲烷中然后在30分钟内缓慢添加至pei溶液中。将混合物在冰上搅拌12小时并将所得产物在旋转蒸发仪中干燥。将粉末溶于50ml的0.1nhcl中。将水溶液用100ml的二氯甲烷萃取3次，然后过滤通过玻璃微纤维过滤器。通过蒸发溶剂浓缩产物，用极大过量的丙酮进行沉淀，并在真空下干燥。用maldi-tof和10¹hnmr分析产物。非水溶性脂聚合物1800的nmr结果显示，与pei偶联的胆固醇的量约为47％。peace的maldi-toff质谱分析显示其分子量约为2200。这表明大多数的peace1800的胆固醇和pei的摩尔比为1/1，但是某些没有偶联或以2/1的摩尔比(胆固醇/pei)偶联。

制剂g

在冰上将50毫克pei1800溶解于2ml无水二氯甲烷中。然后将200μl氯甲酸苄酯缓慢添加至反应混合物中并将溶液在冰上搅拌4小时。搅拌之后，添加10ml二氯甲烷并用15ml饱和nh4cl萃取溶液。施用硫酸镁从二氯甲烷相除去水。在真空下减少溶液体积并用乙醚沉淀产物cbz保护pei。将50毫克的伯胺cbz保护pei溶解于二氯甲烷中，添加10mg氯甲酸胆固醇酯并将溶液在冰上搅拌12小时。将产物cbz保护脂聚合物用乙醚沉淀，用丙酮洗涤，然后在作为氢供体的h2下溶解在含作为催化剂的钯活性炭的dmf中。将混合物在室温搅拌15小时，过滤通过并通过旋转蒸发仪减少溶液体积。用乙醚沉淀来获得最终产物。

制剂h

在室温将500毫克nh2-peg-cooh3400(0.15mm)溶解在5ml无水氯仿中30分钟。将676mg氯甲酸胆固醇酯在1ml无水氯仿中的溶液(1.5mm)缓慢添加至peg溶液中然后在室温再搅拌4小时。在冰上将混合物在500ml乙醚中沉淀1小时，然后用乙醚洗涤3次以除去非偶联的胆固醇。用氮气吹扫干燥后，将粉末溶解于5ml的0.05nhcl以使peg上的羧基酸化。通过冻干机干燥材料。在室温将100毫克pei1800(0.056mm)、50mgdcc和50mgnhs溶解于5ml氯仿中，将混合物搅拌20分钟，然后将380mg的胆固醇-peg-cooh在1ml氯仿中的溶液缓慢添加至pei溶液中。在室温搅拌6小时之后，用旋转蒸发仪除去有机溶剂。将剩余材料溶解于10ml去离子水中并通过fplc纯化。

实施例1

带有阳离子脂聚合物的缩合核酸的浓缩脂制剂的制备

该实例说明了在实验室规模生产下完全缩合核酸的高度浓缩制剂的制备。这涉及制备带有阳离子聚合物的核酸复合物并随后冻干和复水于等渗溶液中。所用核酸是编码il-12或荧光素酶基因的质粒dna，且所述聚合物包含与聚乙二醇(peg)和胆固醇(chol)共价连接的聚乙烯亚胺(pei)主链(peg-pei-chol或ppc)。peg与pei的摩尔比和胆固醇与pei的摩尔比分别为0.5～10和0.1～10。首先，在注射用水中分别制备5mg/ml的dna溶液和ppc溶液，随后在3％乳糖中稀释至0.15mg/ml(dna)和0.554mg/ml(ppc)。用微量移液器将dna乳糖溶液添加至ppc乳糖溶液中以使氮与磷酸根之比(n:p比)为11:1，并将该制剂在室温温育15分钟以使得复合物能够形成。用来自labconcocorp.,kansascity,mo的freezone冻干系统将3％乳糖中的ppc/dna复合物冻干。将500μl制得的制剂添加至2ml硼硅酸盐玻璃管中，然后使用由以下阶段组成的冻干程序将其冻干：

1)冷冻阶段(变温(ramp)0.25℃/分钟，在34℃保持4小时)，

2)初次干燥阶段(在34℃保持24小时)，

3)二次干燥阶段(变温至20℃并保持24小时)，和

4)以0.25℃/分钟变温至4℃。

将所得冻干粉末用注射用水复水为0.1mg/ml～20mg/mldna的各种浓度。一批典型的小规模制剂的量为100mg～200mg的完全配制的dna。

实施例1a

基本根据上文实施例1所概述的步骤使用n:p比为11:1的阳离子脂聚合物和il-12核酸来制备核酸/阳离子脂聚合物制剂。该阳离子脂聚合物的peg:pei:胆固醇摩尔比为约2.5:1:0.6，且分子量(作为游离碱)为约3.54kd。将所得的含乳糖制剂冻干并可以复水为至少约0.5mg/ml的核酸浓度而不会有核酸聚集或明显的转染活性损失。

实施例2

带有阳离子脂聚合物的缩合核酸的浓缩液体制剂的制备

该实例说明了高度浓缩的缩合核酸制剂的制备，如图1所示。该方案已生产超过6000mg的完全配制的dna(与实施例1所述的小规模制备所生产的100mg～200mgdna相比)，并能扩展至甚至更高的生产量。该放大方法涉及用蠕动泵将大量dna和聚合物溶液混合从而实现在线混合情景以形成复合物，接着施行可配合大负载的冻干循环。简言之，将dna和ppc分别制备为3％乳糖中的0.3mg/ml和1.1mg/ml的溶液。用带有内径为0.89mm的硅套管(watsonmapvlow,z982-0088)的蠕动泵(watsonmarlow,sci400)于225±25ml/分钟的流速将两个组分以恒定流速合并。两个混合物通过聚丙烯t形连接器在各个管的末端会合。聚合物和dna溶液的混合导致立即形成纳米颗粒。将40毫升配制的复合物置于100ml玻璃管中并用由以下阶段组成的冻干程序冻干：

1)在-50℃预冷冻至多720分钟，

2)在65μmhg，在-40℃一次干燥至多180分钟，然后在-34℃干燥至多1980分钟，和

3)在65μmhg，在-25℃二次干燥至多720分钟，然后在-15℃干燥至多3180分钟，在-10℃干燥至多1500分钟，并在4℃干燥至多1440分钟。

将所得冻干粉末用注射用水复水为0.1mg/ml～20mg/mldna的各种浓度。一批典型的该规模产品的量为6000mg的完全配制的dna。

实施例3

带有阳离子脂聚合物的缩合核酸的浓缩液体制剂的粒径的测定

如实施例1和2所述制备带有阳离子脂聚合物ppc的质粒dna的高度浓缩制剂。为进行聚合物/核酸粒径测定，用来自brookhaveninstrumentscorp.,holtsville,ny的90plus/bi-masparticlesizer分析所述液体制剂的等分试样。具体而言，将50μl制剂添加至聚苯乙烯比色皿中的950μl的milli-q水中以进行分析。

图2显示了预冻干或非浓缩的制剂(0.15mg/mldna)中的dna/ppc复合物和在用il-12质粒(图2a)或荧光素酶质粒(图2b)复水为0.5mg/ml～10mg/ml的更高浓度之后的粒径。在更高浓度的复水没有显著影响粒径，这表明该复合物是稳定的。

实施例4

带有阳离子脂聚合物的核酸的浓缩液体制剂的核酸缩合物的分析

在该实例中评估了ppc聚合物缩合质粒dna的能力。如实施例1和2所述制备带有阳离子脂聚合物ppc的质粒dna的高度浓缩制剂。用1％琼脂糖凝胶对该核酸/聚合物复合物进行电泳。带负电的质粒dna与带正电的ppc聚合物的静电引力阻止dna运行通过琼脂糖凝胶。如图3所示，该高度浓缩制剂中存在的所有dna是缩合的。

实施例5

带有阳离子脂聚合物的核酸的浓缩液体制剂中的核酸浓度的测定

使用agilent8453分光光度计(agilenttechnologies,inc.santaclara,ca)对dna与ppc复合物的高度浓缩制剂中的核酸量进行定量。用950μl注射用水(wfi)将50μl所述制剂在石英比色皿中稀释并采用260nm波长测定吸光度。假设1光密度(260nm处)＝50μg/mldna，确定dna浓度。

实施例6

带有阳离子脂聚合物的核酸浓缩液体制剂的转染活性的测定

在体外确定dna与ppc的复合物的高度浓缩制剂的转染活性。将其与非浓缩制剂的转染活性进行直接比较。通过实施例1和2中所述的方法制备含有荧光素酶或il-12质粒的转染复合物，并复水为0.15mg/ml～10mg/ml的dna浓度。将cos-1细胞(1.5×10⁵细胞/孔)接种至10％胎牛血清(fbs)中的12孔组织培养板中。在没有fps存在时将各孔与4μg的复合dna在总体积为500μl的dulbecco/vogt改进eagle最小必需培养基(dmem)中温育6小时。当温育期结束时，将培养基置于1ml的补充有10％fbs的新鲜dmem中再40小时。在温育期结束时，在细胞培养基(il-12)或细胞裂解物(荧光素酶)中测定转染活性。对于il-12水平测定，通过il-12elisa测试直接分析细胞培养基。对于荧光素酶测定，用磷酸缓冲盐水洗涤细胞并用tent缓冲液(50mmtris-cl[ph8.0]2mmedta,150mmnacl,1％tritonx-100)裂解。使用orionmicroplateluminometer(bertholddetectionsystems,oakridge,tn)测定细胞裂解物中的作为相对光单位(rlu)的荧光素酶活性。最终荧光素酶值以rlu/mg总蛋白为单位报道。用bca蛋白测试试剂盒(piercebiotechnology,inc.,rockford,il)确定总蛋白水平。来自il-12和荧光素酶质粒/ppc复合物的高度浓缩制剂的il-12和荧光素酶表达水平分别如图4a和图4b。数据显示高度浓缩形式的核酸复合物的转染活性得到保留。

实施例7

带有阳离子脂聚合物的核酸的浓缩液体制剂的制备物中的各种赋形剂糖的评估及其表征

评估了作为冻干过程期间的可能填充剂或填料剂以用于制备高度浓缩制剂的两种常用糖(乳糖和蔗糖)。分别制备3％、1.5％和0.3％的ppc/dna复合物在乳糖和蔗糖中的溶液。使用实施例1中所用方案将这些制剂冻干。冻干过程后，将制剂用wfi复水为0.5mg/ml、1mg/ml和5mg/ml的最终dna浓度。对这些不同制剂评估其粒径和体外基因转移。如表1所示，不管冷冻保护剂填料是蔗糖或乳糖，粒径和转染活性均得到保留。这些结果显示超过一类糖可以被用于制备物理化学和生物学稳定的带有阳离子聚合物的高浓度核酸。

表1

带有阳离子聚合物的核酸的浓缩等渗制剂的制备物中的赋形剂糖的评估

实施例8

带有阳离子脂聚合物的核酸的浓缩液体制剂在颅内表达后的正常脑实质中的il-12表达

检验带有阳离子聚合物ppc的il-12质粒在正常脑组织中的直接施用以确定核酸和阳离子脂聚合物的高度浓缩制剂在体内是否是生物活性的。在来自治疗后14天或1月处死的动物的大脑切片上进行对il-12的免疫组织化学染色。仅用ppc治疗的动物的脑实质没有显示出任何il-12染色(图5a)。相反，用pmil-12/ppc在颅内进行注射的小鼠的脑实质对于il-12为阳性染色(图5b)。该实验表明，带有阳离子聚合物的核酸复合物的生物活性在浓缩过程中得到保留。另外，可以推断细胞因子在注射后的至少一个月中仍然存在。而且，该细胞因子在处死前仍然存活的动物的大脑中的存在表明il-12的实际表达没有导致大脑中的致命毒性。

实施例9

带有脂聚合物的核酸的浓缩液体制剂在小鼠成胶质细胞瘤模型中的效力

在小鼠成胶质细胞瘤模型中检验了表达il-12的完全复合核酸的高度浓缩制剂的抗癌效力。通过颅内注射1×10⁵个gl261成胶质细胞瘤细胞以及3μl的来自5mg/mlil-12质粒dna高度浓缩制剂的il-12/ppc复合物共注射物来将肿瘤植入小鼠大脑皮层。对动物监测任何的神经毒性征兆并在可能时进行尸体解剖以确证死亡是由颅内肿瘤造成的。使用kaplan-meier存活率分析对存活率作图。以15μg质粒剂量施用的pmil-12/ppc复合物的单次颅内注射的耐受良好，这是因为没有观察到显著的副作用。15μg质粒剂量的pmil-12/ppc复合物的单次注射显著提高了动物存活率。

实施例10

带有阳离子脂聚合物的核酸的浓缩液体制剂在卵巢癌患者中的生物活性

检验了表达il-12基因的完全缩合核酸的高度浓缩制剂在患有复发性卵巢癌的患者中的生物活性。每周4次的il-12质粒和ppc的高度浓缩等渗制剂在患有复发性卵巢癌的女性中的腹膜内施用在受治疗的患者的腹膜液中产生显著的ifn-γ(il-12的替代标记物)水平。ifn-γ水平为20pg/ml腹膜液～275pg/ml腹膜液。这些数据表明，il-12核酸的高度浓缩制剂适于临床应用。

实施例11

评估阳离子聚合物的化学组成对带有阳离子脂聚合物的核酸的浓缩液体制剂的性质的影响

此前的尝试已经表明，由于浓缩过程造成的不良稳定性和转染损失，因而对带有如脂质或聚合物等阳离子基因载剂的核酸制剂进行浓缩是极为困难的。为了确定物理化学和生物学稳定的高浓度完全缩合核酸的成功制备是否对于测试阳离子聚合物peg-pei-胆固醇(ppc)是独一无二的，测试了包括带有游离pei、与胆固醇相连的pei或与peg相连的pei的阳离子聚合物以及阳离子脂质体dotap。制备0.15mg/ml的dna复合物并如实施例1所述浓缩至0.5mg/ml～5mg/ml。如实施例3和6所述确定粒径和转染活性。如图7和8所示，用游离pei(pei1800、pei15000、pei25000)或pei-胆固醇、pei-peg或阳离子脂质dotap制备的dna复合物没有产生稳定的复合物，因为这些复合物在冻干并复水为0.5mg/ml～5mg/ml后聚集并损失了转染活性。去稳定化效果在5mg/ml比0.5mg/ml更加显著。相比之下，用peg-pei-胆固醇(ppc)制备的dna复合物在冻干和于高dna浓度复水期间保持了其物理化学性质和转染性质(图7和8)。这些结果表明，用胆固醇和peg对阳离子聚合物的共价修饰对于浓缩过程中的活性保留是至关重要的。

实施例12

带有阳离子聚合物的核酸的冻干制剂或浓缩液体制剂的长期稳定性

用实施例2中概述的方法在cgmp下制备了大规模的冻干il-12/ppc复合物，并储存于-80℃、-20℃、4℃和25℃(60％rh)以用于稳定性评估。进行分析时，从储存器中取出管并添加2.4ml的wfi。对于每个样品，测定ph、dna浓度、渗透摩尔浓度、粒径和生物活性。如图9所示，il-12/ppc复合物的dna浓度、ph、渗透摩尔浓度和粒径在指定温度的两年储存期间都得到维持。如实施例6所述，在cos-1细胞中对pil-12/ppc的基因转移活性进行定量。用4μgdna的生物材料转染cos-1细胞。转染后48小时，用商购elisa试剂盒对细胞培养基中的il-12水平进行定量。在-80℃或-20℃的储存期间，生物产品的生物活性没有明显改变。在时间为0时，活性为151±130pg/ml，其余数据在该标准偏差内波动，例外的是在25℃处随时间进行活性持续下降。在4℃，在360天时观察到转染活性的降低，但由于样品不足，没有可利用的后续时间点以得出结论性评估。

实施例13

带有阳离子聚合物的核酸的浓缩液体制剂的复水材料的稳定性

在单独的研究中检验了复水材料的稳定性。根据实施例2所述的方法制备冻干的il-12质粒dna/ppc复合物，并在注射用水中复水为0.5mg/ml。将复水材料储存于4℃。在第60天和第90天取出样品并分析粒径、渗透摩尔浓度和基因表达。同时分析储存于-80℃的密封管中的冻干产物以进行比较。如表2所示，在用wfi复水后，复水的egen-001在4℃至少在90天中是稳定的。与储存于-80℃的密封管中的冻干产物相比，包括dna浓度、粒径、渗透摩尔浓度或基因表达的稳定性参数均未显著改变。

表2

带有阳离子聚合物的核酸的高度浓缩及完全缩合的等渗制剂在4℃的长期稳定性

实施例14

通过与peg-pei-胆固醇共同配制来制备合成核酸传输体系的高度浓缩稳定dna制剂

将peg-pei-胆固醇添加至现存的合成核酸传输体系中以提高在高核酸浓度下通常不稳定的核酸制剂的稳定性。

在一个实施例中，将peg-pei-胆固醇添加至用25kda的直链聚乙烯亚胺(lpei25kd)制备的dna制剂中。可以用lpei25kd以10:1(n:p比)在3％乳糖的存在下制备浓度为0.15mg/ml的dna制剂。然后可以将peg-pei-胆固醇以不同的ppc与配制的dna之比添加至lpe125kd/dna复合物中。例如，ppc/dna(n:p比)可以为(0:1)、(1:1)、(5:1)、(7.5:1)、(11:1)、(15:1)和(20:1)。可以将500μl的各个制剂加入2ml硼硅酸盐玻璃管中，然后在冷冻干燥系统中冻干。冻干程序由以下阶段组成：

1)冷冻阶段(变温0.25℃/分钟，在-34℃保持4小时)，

2)初次干燥阶段(在-34℃保持24小时)，

3)二次干燥阶段(变温至-20℃并保持24小时)，和

4)以0.25℃/分钟变温至4℃。

可以将冻干制剂用注射用水复水为0.5mg/ml或其它合适的浓度。

应该理解，上述组合物和应用模式仅是对本发明的优选实施方式的说明。本领域技术人员可以在不背离本发明的实质和范围的情况下设想出多种修改和替代性设置，且所附权利要求旨在包括这些修改和设置。因此，尽管上文已经用目前被视为是最实际和优选的本发明的实施方式对本发明进行了具体和详细的描述，但对于本领域技术人员显而易见的是，可以在不背离本文所述的原则和概念的情况下进行多种修改，这些修改包括但不限于尺寸、材料、形状、形式、功能和操作方式的变化。