小檗碱在预防和治疗胸主动脉夹层/主动脉瘤中的应用的制作方法

本发明属于医药生物领域，具体而言，涉及小檗碱在预防和治疗胸主动脉夹层/主动脉瘤中的应用。

背景技术：

主动脉瘤与主动脉夹层是血管外科的常见病，随着人口老龄化和影像学诊断技术不断提高，发病率和检测发现的病人数常年呈上升趋势，针对主动脉瘤与主动脉夹层的治疗方案中，传统经胸腹手术是主要的治疗方法，但手术创伤大，并且严重的并发症如截瘫和死亡率高达17％和26％。

除了手术治疗之外，常见的针对主动脉瘤和主动脉夹层的治疗还包括药物治疗和介入治疗。低危患者可先应用药物治疗，并进行密切观察，高危患者则常选则手术或介入治疗。

针对主动脉瘤和主动脉夹层的药物治疗常用药物包括肾上腺素β受体阻滞药(β受体阻滞药)、血管紧张素Ⅱ受体1拮抗药、血管紧张素转换酶抑制药、他汀类药物等。其中，β受体阻滞药可降低心肌收缩力、降低血压，从而降低血管壁张力，可延迟胸主动脉瘤进展、减少血管破裂和胸主动脉夹层的发生率。血管紧张素Ⅱ受体1拮抗药是一类常用的降压药物，可抑制血管紧张素Ⅱ和其受体1的结合，有报道表明该类药物可延迟马凡综合征患儿主动脉根部增宽，并且年龄越小应用效果越佳。他汀类药物可减少动脉粥样硬化的产生，对动脉壁有保护作用。但是，上述各种药物，临床上也存在很多不良反应和副作用，例如，他汀类药物的肝肾毒性，β受体阻滞药和某些药物的配伍禁忌等等。因此，需要更为安全有效的能够预防和缓解主动脉瘤和主动脉夹层的药物。

针对这一问题，本申请发明人首次通过动物模型对常见的植物来源的传统中药成分或化合物进行筛选，获得了能够针对主动脉瘤和主动脉夹层的新的药物。

技术实现要素：

本发明首先涉及一种盐酸小檗碱(黄连素)对胸主动脉夹层/胸主动脉瘤的治疗应用，所述的应用为，对于临床确诊的胸主动脉夹层/胸主动脉瘤患者，通过注射给药的方式施用盐酸小檗碱。

本发明还涉及盐酸小檗碱在制备治疗胸主动脉夹层/胸主动脉瘤的药物中的应用，所述的药物包括但不限于，经胃肠消化道道给药的药物、经静脉注射给药的药物、经皮下包埋给药方式给药的药物。

本发明还涉及盐酸小檗碱在制备预防胸主动脉夹层/胸主动脉瘤的药物中的应用，所述的药物包括但不限于，经胃肠消化道给药的药物、经静脉注射给药的药物、经皮下包埋给药方式给药的药物。

本发明还涉及一种用于评价主动脉夹层/主动脉瘤的药物疗效的动物模型的制备方法，所述方法步骤为，取3周龄C57BL/6背景雄性小鼠给予正常饮食，将BAPN以1g/kg/day剂量溶于饮水中，饲喂小鼠4周。

本发明还涉及一种用于评价主动脉瘤的药物疗效的动物模型的制备方法，所述方法步骤为：取6周龄Apoe^-/-雄性小鼠20～22g左右给予正常饮食和饮水，对小鼠以皮下埋泵的方式进行人血管紧张素II灌注，灌注的剂量和方法为：以1.5μg/kg/min剂量，皮下灌注6周。

附图说明

图1、盐酸小檗碱对小鼠模型的胸主动脉夹层/主动脉瘤的预防效果。

图2、盐酸小檗碱对小鼠模型的胸主动脉夹层/主动脉瘤的治疗效果

具体实施方式

实验动物、试剂及试剂盒、仪器

实验动物

胸主动脉夹层/主动脉瘤模型：3周龄雄性野生型小鼠(C57BL/6)；ApoE^-/-小鼠(C57BL/6J)均购自北京华阜康生物科技股份有限公司。所有动物均在北京市心肺血管疾病研究所SPF级环境动物房进行饲养繁殖。野生小鼠需为达到3周龄，体重在10g左右的雄性小鼠。ApoE-/-小鼠要求6W左右，体重在20～22g左右的雄性小鼠。所有实验操作均根据NIH与1996年制定的《实验动物管理及使用指南》和首都医科大学实验动物管理委员会规定的实验流程进行。所有实验动物按照随机方法进行分组。

生化试剂及试剂盒名称及供应商见下表1

表1、生化试剂及试剂盒名称及供应商

实验仪器设备名称及供应商见下表2

表2、实验仪器设备名称及供应商

实施例1、胸主动脉夹层/主动脉瘤小鼠模型(小鼠TAD模型)的构建

BAPN喂水组小鼠TAD模型的构建及评价

取3周龄C57BL/6背景雄性小鼠给予正常饮食，

BAPN喂水组(n＝16)：将BAPN以1g/kg/day剂量溶于饮水中。

喂BAPN第14天，随机选择5只小鼠进行胸主动脉超声，判断是否已经存在胸主动脉的增宽/夹层。经多次重复实验，14天时部分小鼠已经形成主动脉夹层/主动脉瘤，并开始陆续死亡。对模型诱导夹层/动脉瘤的效果评价方案为：

1.对死亡后的小鼠主动脉进行HE或者弹力纤维染色(具体方法见实施例2)，测量脉管直径是否增粗(夹层)；或者观察是否出现弹力板的紊乱或出现动脉瘤；

2.对活体小鼠进行主动脉弓部超声，计算直径，观察是否增粗或出现夹层。

4周后BAPN喂水组小鼠加AII灌注：以1μg/kg剂量皮下灌注24小时，如在AII灌注24H后仍未死亡，统一处死。

实施例2、给予盐酸小檗碱对主动脉夹层/主动脉瘤的预防效果

盐酸小檗碱订购来自ALADDIN公司，货号是LOT#K1524072具体名称是盐酸小檗碱水合物(Berberine Chloride Hydrate)

使用如实施例1所述的BAPN喂水法构建TAD小鼠模型。

将诱导TAD的小鼠随机分为两组，

一组为盐酸小檗碱预防组：从喂BAPN的水的首日起，按照5mg/kg的剂量腹腔注射盐酸小檗碱，每两天一次；

另一组为对照组：与盐酸小檗碱治疗组同样的频率，经腹腔注射给予同样体积的生理盐水。

四周后，两组小鼠都给予血管紧张素II(AII)灌泵，24h。

给药后观察指标包括：

1.体重：每天对两组小鼠进行称重。观察药物是否影响体重对增长。

2.BAPN摄取量：大致每天观察两组小鼠的饮水情况，判断药物是否影响小鼠体重的变化

3.血压变化：自第三周开始，每3天进行一次血压的测定，以排除小鼠由于对血压的改变致使其动脉瘤不宜破裂，影响生存率

观察终点：

1.小鼠在造模期间自然死亡：纪录死亡时间和死亡原因(是否因夹层/动脉瘤破裂而死)；

2.未死亡小鼠：在灌泵24h后将小鼠处死，收集所有小鼠的血管进行染色，统计其血管直径和夹层发生率。

组织冰冻切片制备：

在实验结束时用戊巴比妥(100mg/kg)麻醉处死小鼠，采用肝素化生理盐水进行心脏灌流，去除心脏残留血液。用4％多聚甲醛继续灌注，使血管组织形态原位固定。在体视显微镜下分离剪取主动脉弓部和降部，在4％多聚甲醛中浸泡固定2小时，后转移至30％蔗糖溶液中4℃过夜，充分脱水。第二天从蔗糖溶液中取出血管，用滤纸充分吸干组织水分，将血管竖直包埋于OCT包埋剂中，锡箔纸包绕后于液氮中缓慢冻凝，可贮存于-80℃冰箱。进行连续冰冻组织切片，厚度5μm，用多聚赖氨酸涂层玻片贴片。

组织石蜡切片制备

在实验结束时用戊巴比妥(100mg/kg)麻醉处死小鼠，采用肝素化生理盐水进行心脏灌流，去除心脏残留血液。在体视显微镜下分离剪取主动脉弓部，放于10％甲醛溶液中固定；将正常主动脉和TAD组织放于10％甲醛溶液中固定。至少24小时后取出血管进行脱水处理，并用石蜡包埋组织(血管竖直向下)。切片时采用连续切片，厚度5μm，用多聚赖氨酸涂层玻片贴片。

组织病理学检测：

I.通过弹力纤维染色观察弹力板情况，

具体操作如下：

1.冰冻切片：

(1)冰冻切片PBS中洗去OCT；

(2)加入1滴(100μl)Lugol碘液(试剂A)孵育5分钟，稍加水洗；

(3)加入1滴(100μl)硫代酸钠(试剂B)处理5分钟；

(4)用流水冲洗5分钟，70％酒精稍洗；

(5)加入1滴(100μl)醛品红染液(试剂C)，进行染色10分钟，用70％酒精浸洗2次(每次约30秒，至切片不再脱色为止)，稍水洗；

(6)加入1滴(100μl)橙黄G染液(试剂D)染色10秒，稍水洗；

(7)95％酒精脱水5min；

(8)无水酒精脱水5min；

(9)二甲苯透明5min，封片；

2.石蜡切片：

(1)石蜡切片常规用二甲苯脱蜡，经各级不同浓度的乙醇将石蜡切片脱蜡至水：二甲苯I(20min)→二甲苯II(20min)→二甲苯III(20min)→100％酒精(5min)→95％酒精(5min)→80％酒精(5min)→自来水洗去酒精。

(2)加入1滴(100μl)Lugol碘液(试剂A)孵育5分钟，稍加水洗；

(3)加入1滴(100μl)硫代酸钠(试剂B)处理5分钟；

(4)用流水冲洗5分钟，70％酒精稍洗；

(5)加入1滴(100μl)醛品红染液(试剂C)，进行染色10分钟，用70％酒精浸洗2次(每次约30秒，至切片不再脱色为止)，稍水洗；

(6)加入1滴(100μl)橙黄G染液(试剂D)染色10秒，稍水洗；

(7)95％酒精脱水5min；

(8)无水酒精脱水5min；

(9)二甲苯透明5min，封片；

采用Nikon ECLIPSE 90i显微镜观察，弹力纤维呈蓝紫色，背景呈不同程度黄色。弹力板内侧为新生内膜部分。

II.通过HE染色观察血管壁结构破坏情况，

具体操作如下：

1.冰冻切片：

(1)冰冻切片PBS中洗去OCT；

(2)4％的多聚甲醛固定10min，PBS洗3遍。

(3)苏木素染色(1-2min)，自来水冲三遍去除浮色。

(4)盐酸乙醇分化液2秒(沾两下)，自来水小流速度冲洗进行返蓝(5min)。

(5)伊红液染色(1-2min)染胞浆，自来水冲洗去除浮色(30秒)。

(6)常规脱水、透明、封片：80％酒精(5min)→95％酒精(5min)→100％酒精(5min)→100％酒精(5min)→二甲苯I(5min)→二甲苯II(5min)→中性树胶封片。

(7)显微镜下观察标本形态。

2.石蜡切片：

(1)石蜡切片常规用二甲苯脱蜡，经各级不同浓度的乙醇将石蜡切片脱蜡至水：二甲苯I(20min)→二甲苯II(20min)→二甲苯III(20min)→100％酒精(5min)→95％酒精(5min)→80％酒精(5min)。

(2)自来水冲洗，洗去酒精。

(3)苏木素染色(3-5min)，自来水冲三遍去除浮色。

(4)盐酸乙醇分化液2秒(沾两下)，自来水小流速度冲洗进行返蓝(5min)。

(5)伊红液染色(2-3min)染胞浆，自来水冲洗去除浮色(30秒)。

(6)常规脱水、透明、封片：80％酒精(5min)→95％酒精(5min)→100％酒精(5min)→100％酒精(5min)→二甲苯I(5min)→二甲苯II(5min)→中性树胶封片。

(7)显微镜下观察标本形态。

结果显示，腹腔注射盐酸小檗碱组的小鼠的生存时间较TAD对照组的小鼠有明显的改善(图1A)动脉破裂率有了明显的降低(图1B)，夹层发生率降低明显(图1C)，血管直径扩张率降低明显(图1D)，小鼠模型的血管染色图见图1E，可见，黄连素预防组的小鼠动脉管腔相对完整圆润，未发生扩张，阳性对照组(BAPN诱导TAD的小鼠)血管内壁弹力板紊乱，血管直径增粗超过150％(明显的主动脉瘤症状)，同时部分血管内壁弹力板破口，动脉血管壁中出现大量夹层血栓。

实施例3、给予盐酸小檗碱对主动脉夹层/主动脉瘤的治疗效果

使用如实施例1所述的BAPN喂水法构建TAD小鼠模型。

将诱导TAD的小鼠随机分为两组，

一组为盐酸小檗碱治疗组：从喂含BAPN的水的第14日起，按照5mg/kg的剂量腹腔注射盐酸小檗碱，每两天一次；

另一组为对照组：与盐酸小檗碱治疗组同样的频率，经腹腔注射给予同样体积的生理盐水。

四周后，两组小鼠都给予血管紧张素II(AII)灌泵，24h。

给药后观察指标包括：

1.体重：每天对两组小鼠进行称重。观察药物是否影响体重对增长。

2.BAPN摄取量：大致每天观察两组小鼠的饮水情况，判断药物是否影响小鼠体重的变化

3.血压变化：自第三周开始，每3天进行一次血压的测定，以排除小鼠由于对血压的改变致使其动脉瘤不宜破裂，影响生存率

观察终点：

1.小鼠在造模期间自然死亡：纪录死亡时间和死亡原因(是否因夹层破裂而死)；

2.未死亡小鼠：在灌泵24h后将小鼠处死，收集所有小鼠的血管进行染色，统计其血管直径和夹层发生率。

冰冻切片、石蜡切片、组织病理学检测方法同实施例3。

结果显示，腹腔注射盐酸小檗碱组的小鼠的生存时间较TAD对照组的小鼠有明显的改善(图2A)，夹层破裂率有了明显的降低(图2B)，夹层发生率降低明显(图2C)，血管直径扩张率(主动脉瘤)降低明显(图2D)，小鼠模型的血管染色图见图1E，可见，黄连素治疗组的小鼠动脉管腔平滑，直径正常，BAPN诱导TAD的小鼠动脉管腔扩张超过150％(为明显的动脉瘤症状)，同时部分血管内壁弹力板破口，出现大量血栓夹层。

最后需要说明的是，以上实施例仅用作帮助本领域技术人员理解本发明技术方案的实质，不用做对本发明保护范围的限定。