重组高密度脂蛋白在治疗妊娠期高血压疾病中的应用的制作方法

本发明涉及重组高密度脂蛋白在治疗妊娠期高血压疾病中的应用，特别是涉及重组高密度脂蛋白的制备，及其在生产用于预防和治疗妊娠期高血压疾病的药物中的应用。重组高密度脂蛋白的主要特征是蛋白组分包括使用甲基营养酵母生产的重组人载脂蛋白A-I、重组人载脂蛋白E两种载脂蛋白；并以维生素E代替天然高密度脂蛋白中的胆固醇酯，作为重组高密度脂蛋白的核心部分，使其具有更强的抗氧化活性。

背景技术：

妊娠期高血压疾病(HDCP)是最常见的妊娠期并发症，严重威胁母婴的健康，是导致孕产妇死亡、围生儿发病及死亡的主要原因之一(梁娟,李维敏,王艳萍,周光萱,吴艳乔,朱军,代礼,缪蕾.1996～2000年全国孕产妇死亡率变化趋势分析.中华妇产科杂志,2003,38(5):257-260)。子痫前期以妊娠20周后高血压、蛋白尿、水肿为特征，常存在不同程度的代谢综合症表现，其中血脂代谢紊乱在子痫前期中表现比较明显。血脂代谢紊乱可能导致妊娠期高血压疾病的发生，并且可能加重病情，引起子宫及胎盘床小动脉的急性动脉粥样硬化，导致胎盘功能下降、胎儿生长受限、胎儿宫内窘迫等不良后果。近年来随着分子生物学、蛋白质组学、医学生物工程等科学技术的迅速发展，人们更加深入地认识了HDCP的发生、发展过程，但是目前临床治疗高脂血症的药物都不能应用于孕妇的治疗。因此研究新型的既可以降脂同时又对母婴无毒副作用的药物，以纠正子痫前期患者的血脂代谢异常及减轻胎盘氧化应激损伤，有望成为治疗及预防子痫前期的有效途径。

目前已有的研究表明，在小鼠发生子痫前期改变的同时给予高脂饮食，其妊娠结局更为不良。脂肪浸润情况较为严重的孕鼠，其胎盘重量、胎仔重量明显降低，推测胎盘脂质过氧化物增多及脂质代谢紊乱，导致胎盘滋养叶细胞能量供应不足及胎盘组织细胞氧化应激，从而引起胎盘滋养细胞和血管内皮系统功能障碍，影响胚胎发育，最终导致生长发育受阻(Sun MN,Yang Z,Ma RQ.Effect of high-fat diet on liver and placenta fatty infiltration in early onset preeclampsia-like mouse model.Chin Med J(Engl),2012,125(19):3532-3538.)。

子痫前期患者体内存在子宫螺旋动脉及胎盘床小动脉的急性动脉粥样硬化(As)并且有着与As相似的血脂异常——As的危险因子血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)显著升高；而保护因子高密度脂蛋白(HDL)及载脂蛋白A-I(ApoA-I)显著下降。氧化应激和脂质过氧化反应增多，同时几种重要的抗氧化物缺乏，是子痫前期发病的主要机制之一。

HDL，即高密度脂蛋白，在生理上起着将肝外组织的胆固醇运送到肝脏的作用，因而可以防止游离胆固醇在肝外组织细胞上的沉积，是一种抗动脉粥样硬化的血浆脂蛋白，是冠心病的保护因子，俗称“血管清道夫”。HDL的心血管保护作用主要体现在胆固醇逆转运及抗炎、抗氧化功能，升高HDL己经成为针对As的一种疗效较为肯定的治疗方法。HDL可下调血管内皮细胞烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶表达，降低活性氧簇(ROS)水平，发挥其抗氧化作用(Campbell S,Genest J.HDL-C:clinical equipoise and vascular endothelial function.Expert Rev Cardiovasc Ther,2013,11(3):343-53.)。

国内外学者在升高血浆HDL水平方面进行了相关研究，但是目前研究中的降脂药物仍存在如下弊端：①他汀类、贝特类、烟酸类等降脂药存在明显的副作用，不能用于孕妇及哺乳期妇女。②注射天然HDL可有效纠正由高脂血症引起的血脂代谢紊乱，预防或逆转As等并发症，具有巨大的临床应用价值。然而，获得天然的HDL需要大量的血浆，原料来源有限，并且生产成本高、规模难以扩大。③HDL替代疗法中使用单一组分的ApoA-I无法实现HDL功能的多样性，不能完全替代HDL用于治疗。

HDL颗粒包含具有抗氧化活性的载脂蛋白，这包括ApoA-I、载脂蛋白E(ApoE)等。ApoA-I是HDL抗氧化活性的主要成份，可以通过清除LDL、动脉壁细胞或两者中氧化的磷脂，抑制或延迟LDL氧化。ApoE的脂质转运功能和显著的抗氧化活性使其具有明确的抗动脉硬化活性。此外，ApoE作为受体识别标志能与低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)特异性结合，ApoE运载循环中的脂蛋白残体，与LRP结合后可以介导脂蛋白残体的清除。大量的研究已证实，人早期及进展型As斑块中平滑肌细胞、巨噬细胞均有LRP的高表达(Lupu F,Heim D,Bachmann F,Kruithof EK.Expression of LDL receptor-related protein/alpha 2-macroglobulin receptor in human normal and atherosclerotic arteries.rioscler Thromb,1994,14(9):1438-1444.)。

因此，针对目前已有研究中的不足，本项目利用前期工作中获得的重组人载脂蛋白A-I(rhApoA-I)、重组人载脂蛋白E(rhApoE)为主要的蛋白成分，利用基因工程技术、发酵技术、蛋白纯化技术、胆酸钠法，获得高活性、高产量、低成本的新型重组高密度脂蛋白(rhHDL)颗粒。利用rhApoE-LRP的特异性结合，使rhHDL靶向作用于子痫前期患者胎盘发生急性As的血管，发挥rhApoA-I、rhApoE调节血脂代谢，抗氧化应激作用。此外，与天然HDL不同的是，在制备rhHDL的过程中，我们还将利用脂溶性抗氧化剂——维生素E取代rhHDL核心的胆固醇酯，使rhHDL具有更强的抗氧化能力。新型rhHDL颗粒治疗子痫前期的创新之处就在于，通过rhApoE与子痫前期患者胎盘发生急性As组织中高表达的LRP结合，实现rhHDL的靶向作用；rhApoE-LRP特异性结合后，rhHDL颗粒的成分(rhApoA-I、rhApoE和维生素E)释放于胎盘局部，调节血脂转运及抵抗氧化应激作用双管齐下，从而减轻子痫前期患者胎盘氧化应激损伤。

技术实现要素：

本发明涉及重组高密度脂蛋白(rhHDL)的制备，特别是涉及rhHDL治疗子痫前期，及其在生产用于预防和治疗妊娠期高血压疾病的药物中的应用。

本发明的一个目的是提供一种新的重组高密度脂蛋白(rhHDL)的制备方法，特征在于它的蛋白组分包括使用甲基营养酵母生产的重组人载脂蛋白A-I和重组人载脂蛋白E两种载脂蛋白以及维生素E。利用胆酸钠法制备rhHDL(Kato H，Nakano ST，Arai H，et al.Purification,micoheterogeneity，and stability ofhuman lipid transfer protein[J].J Biol Chem，1989，264(7)：4082-4087.)，可得到稳定、大小适宜的颗粒。胆酸钠可促进载脂蛋白进入卵磷脂的酰基链。HDL中载脂蛋白的亲脂基团结合胆固醇酯，亲水基因暴露在表面突入周围水相，从而使HDL颗粒能稳定地分散在水相中；为提高rhHDL的抗氧化活性，我们利用脂溶性的维生素E为核心合成rhHDL，即利用脂溶性维生素E替代HDL核心部分的脂溶性胆固醇酯，

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的重组人载脂蛋白A-I是使用甲基营养酵母生产的。该方法包括在以甲醇为碳源和能源的培养基中培养甲基营养酵母,其中所说的甲基营养酵母是用包括下列可操作连接的元件的DNA构建体转化的：(1)甲基可诱导的转录启动子；(2)编码载脂蛋白A-I的DNA片段；(3)转录终止子和(4)可选择标志，从而重组表达产生人载脂蛋白A-I。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的重组人载脂蛋白E是使用甲基营养酵母生产的。该方法包括在以甲醇为碳源和能源的培养基中培养甲基营养酵母,其中所说的甲基营养酵母是用包括下列可操作连接的元件的DNA构建体转化的：(1)甲基可诱导的转录启动子；(2)编码载脂蛋白E的DNA片段；(3)转录终止子和(4)可选择标志，从而重组表达人载脂蛋白E。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的甲基营养酵母是巴斯德毕赤酵母，并且所说的甲基可诱导的启动子和转录终止子均来自巴斯德毕赤酵母AOX1基因。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的rhHDL是用胆酸钠法制备的。

本发明的另一个目的是提供一种新的重组高密度脂蛋白(rhHDL)，其主要成分具有天然高密度脂蛋白不具有的维生素E，从而提高rhHDL的抗氧化活性。

氧化应激和脂质过氧化反应增多，同时几种重要的抗氧化物缺乏，是子痫前期发病的主要机制之一。血脂代谢紊乱可能导致妊娠期高血压疾病的发生，并且可能加重病情。为研究rhHDL是否可以通过“一靶双效”的作用，减轻子痫前期患者胎盘氧化应激损伤。我们研究了rhHDL对子痫前期小鼠胎盘及妊娠结局的影响。通过静脉注射一氧化氮合酶抑制剂，可诱发小鼠子痫前期病变。rhHDL治疗的实验组动物SBP、DBP和尿蛋白水平均显著下降。同时，rhHDL治疗组血清TC、TG、LDL-C和胎盘组织中MDA水平明显降低，血清中SOD和HDL-C升高，且与模型对照组有显著性差异。说明rhHDL可通过调节血浆中HDL水平，提高机体抗氧化能力。另外，通过病理组织学检查结果可见，rhHDL治疗组胎盘组织纤维素样坏死和绒毛间质水肿有所减轻，且有随剂量的增大而作用效果更明显的趋势。由此可见，rhHDL对子痫前期具有治疗作用(详见实施例2)。

因此，本发明的一个目的是提供重组高密度脂蛋白(rhHDL)在生产用于治疗妊娠期高血压疾病的药物中的应用。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的妊娠期高血压疾病选自子痫前期。

附图说明

图1显示透射电镜下观察重组高密度脂蛋白(rhHDL)的形态(放大6000倍的电镜观察)。

图2显示重组高密度脂蛋白(rhHDL)对子痫前期小鼠胎盘病理组织学改变的影响(所有组织切片均使用放大400倍的普通光学显微镜观察)。其中2a为空白对照组；2b为模型对照组；2c为小剂量rhHDL组(10mg/kg)；2d为大剂量rhHDL组(20mg/kg)。

具体实施方式

以下借助实施例描述本发明的最佳实施方式。这些实施例旨在进一步举例阐明本发明，而不是以任何方式限制本发明待批权利要求的范围。

实施例1：重组高密度脂蛋白(rhHDL)的制备

a.取卵磷脂4mg，维生素E10mg，溶于0.5ml无水乙醇。用皮试注射器吸入后快速注入12.1ml PBS中，N₂下搅拌15min；

b.5.4mg胆酸钠溶于0.5ml PBS；取10mg rhApoA-I、5mg rhApoE 4mg卵磷脂溶于0.8ml PBS中。在搅拌下加入上述液体中；

c.室温放置30min；移至4℃孵育12h，各组分聚合形成rhHDL；

d.将液体加入孔径为10kD的蛋白透析袋中，4℃对透析液(PBS)充分透析，去除胆酸钠。

e.rhHDL的透射电镜观察(见附图1)。

透射电镜结果显示，通过胆酸钠法处理，维生素E、各种载脂蛋白成分、卵磷脂、胆固醇等成功聚合为球形的rhHDL。该复合物在透射电镜下较为均匀圆整，粒径为150nm～200nm(见附图1)。利用胆酸钠法制备rhHDL，可得到稳定、大小适宜的颗粒。胆酸可促进载脂蛋白进入卵磷脂的酰基链，当胆酸钠与卵磷脂的比例在1/2～2/1范围内，可产生稳定rhHDL。

实施例2：rhHDL对子痫前期小鼠胎盘氧化应激损伤及妊娠结局的影响

1)子痫前期小鼠模型的复制

选用健康成年性成熟ApoE^-/-60只、C57BL/6J 20只，雌雄各半，8-10周龄。在室温20-25℃、相对湿度40％-70％的屏障系统内饲养，12小时昼夜戒律照明，不限食水。雌雄小鼠于前日晚10:00按1:1夜间合笼，次日晨7:00前观察阴道栓。若观察到阴道栓为妊娠第1天，隔离饲养。C57BL/6J孕鼠为正常对照组，给予标准饲料；ApoE^-/-孕鼠随机分为3组，分别为模型对照组、rhHDL小剂量组和rhHDL大剂量组，饲喂高脂饲料。

自孕11天起，ApoE^-/-孕鼠每天皮下注射一氧化氮合酶抑制剂(L-NAME)50mg/kg/d诱发子痫前期改变，rhHDL小剂量组和rhHDL大剂量组分别经尾静脉给予10mg/kg、20mg/kg的rhHDL；空白对照组、模型对照组于同一时间给予等量生理盐水。

自孕2天起，每两天用动物无创血压仪检测孕鼠血压，连续测定三次收缩压和舒张压，取平均值并做记录。于标本采集前将孕鼠置于标准代谢笼内，留取24h尿液，测定尿蛋白含量。通过血压及尿蛋白进行动物模型鉴定。

结果显示，与空白对照组比较，模型对照组小鼠SBP、DBP及尿蛋白含量均显著升高(P<0.01或P<0.001)，表明连续静脉注射一氧化氮合酶抑制剂，可诱发小鼠子痫前期病变。给予rhHDL可显著降低子痫前期小鼠SBP和DBP，降低尿蛋白含量，表明rhHDL对子痫前期具有治疗作用(表1)。

表1 rhHDL对子痫前期小鼠血压和尿蛋白含量的影响(n＝10)

与正常对照组比较，^**P<0.01,^***P<0.001；与模型对照组比较，^▲P<0.05,^▲▲P<0.01,^▲▲▲P<0.001

2)血脂与生化指标测定

各组动物于孕18天进行标本取材。取材前禁食12h，1％戊巴比妥钠经腹腔注射麻醉小鼠，眼球摘除法获得血液标本，分离血清，用于测定血脂水平以及SOD活力。另取部分胎盘用冰盐水制成10％的组织匀浆，用于测定MDA含量。结果显示，喂饲高脂饲料的子痫前期小鼠出现血脂代谢紊乱，血清TC、TG、LDL-C均显著上升，HDL-C水平显著下降。给予rhHDL后，血清TC、TG、LDL-C均显著下降，HDL-C水平显著上升，且随剂量增加作用效果更为显著(表2)。对小鼠血清中的SOD活力以及胎盘组织中MDA含量进行检测，结果显示，与空白对照组相比，模型对照组血清SOD活力明显下降，胎盘组织中MDA含量显著上升。给予rhHDL后，血清中SOD活力明显上升，而胎盘组织中MDA含量明显下降，说明rhHDL可通过增强机体抗氧化，提高机体清除自由基能力，而对子痫前期小鼠起到治疗作用(表3)。

表2 rhHDL对子痫前期小鼠血脂代谢的影响(n＝10)

与正常对照组比较，^**P<0.01,^***P<0.001；与模型对照组比较，^▲▲P<0.01,^▲▲▲P<0.001

表3 rhHDL对子痫前期小鼠SOD和MDA水平的影响(n＝10)

与正常对照组比较，^**P<0.01,^***P<0.001；与模型对照组比较，^▲▲P<0.01,^▲▲▲P<0.001

3)胎仔发育情况评估

自孕鼠眼眶取血后处死孕鼠，打开孕鼠腹腔，自子宫远端沿子宫血管网对侧剪开子宫，依次取出胎仔、胎盘，记录胎仔数量、胎仔重量和鼻臀长。

表4rhHDL对子痫前期小鼠胎仔发育情况的影响(n＝10)

与正常对照组比较，^*P<0.05,^**P<0.01；与模型对照组比较，^▲P<0.05,^▲▲P<0.01

4)胎盘形态学观察

胎盘组织经固定、石蜡包埋、切片、HE染色后，于显微镜下观察其病理改变，结果如下：正常对照组胎盘可见迷路样结构，未见异常(图2a)。模型对照组可见纤维素样坏死，出现绒毛间质水肿(图2b)。rhHDL小剂量组和大剂量组病变程度减轻，且有剂量依赖趋势(图2c、2d)。