Metrnl在防治溃疡性结肠炎中的应用的制作方法

本发明涉及分子生物学和生物医药领域，具体地说，涉及Metrnl在防治溃疡性结肠炎中的应用。

背景技术：

炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease，IBD)又称肠炎，是一组反复发作的炎症性肠道疾病。炎症性肠病主要包括克罗恩病(Crohn’s disease，CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)两类。在发达国家，IBD的发病率达到了1/1000。在中国，近十年间炎症性肠病的总病例约为35万。值得注意的是，该病患病人数在逐年增加，与前10年相比，炎症性肠病总病例数增长约超过24倍，其中，克罗恩病患者数量增长甚至超过15倍。溃疡性结肠炎病变主要位于结肠的黏膜层，且以溃疡为主，多累及直肠和远端结肠，但可向近端扩展，以致遍及整个结肠，其重要症状有腹泻、脓血便、腹痛和里急后重，该病病程长，病情轻重不一，常反复发作，与结肠癌的发病有关，临床上常常表现为反复发作而治愈难度大，被世界卫生组织列为现代难治病之一。治疗溃疡性结肠炎的药物包括柳氮磺胺吡啶、肾上腺皮质激素等广谱抗炎药物和免疫抑制、免疫调节剂等，目前尚无治疗溃疡性结肠炎的特效药物。

Metrnl蛋白共由311个氨基酸组成，在NCBI中的注册号为NM_001004431.1，注释为人神经胶质细胞分化调节因子meteorin样分子。Metrnl蛋白已经在人、小鼠、牛、鸡、非洲瓜蟾和斑马鱼中鉴定出来。

中国专利文献CN200980137344.4，公开了Metrnl的治疗用途，用于制备治疗神经系统的疾病、疾患或损害的药物，并指出Metrnl是分泌性生长因子，可促进神经迁移、再生和分化，可用于治疗一般性的神经系统疾病，特别是用于治疗涉及脑、脑干或脊髓和/或外周神经损伤的疾病。中国专利ZL201310525184.9，公开了Metrnl蛋白在制备降血糖药物或保健食品中的应用。中国专利ZL201310525181.5，公开了Metrnl蛋白在制备降血脂药物或保健食品中的应用。

然而，关于Metrnl蛋白在防治溃疡性结肠炎中的应用，还未见报道。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是针对现有技术中的不足，提供Metrnl蛋白或基因的新用途。

本发明的第二个目的是，提供一种筛选防治溃疡性结肠炎的潜在物质的方法。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

Metrnl蛋白或基因或它们的增效剂在制备防治溃疡性结肠炎的药物中的应用。

Metrnl蛋白或基因或它们的增效剂在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用。

进一步，所述药物改善溃疡性结肠炎肠粘膜糜烂程度。

进一步，所述增效剂选自激动剂、上调剂或稳定剂等。

进一步，所述Metrnl蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步，所述药物还可包含常规的药用载体或药学上可接受的辅料，以药物组合物的形式，制备成各种剂型。例如可将其制备成常规的固体制剂药物如片剂、粉剂或胶囊剂等；用于注射时，可将其制备成注射液。在各种制剂中，活性成分的重量含量为0.01％～99.9％。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

一种筛选防治溃疡性结肠炎的潜在物质的方法，包括以下步骤：

a)将候选物质与含Metrnl蛋白或基因的体系接触；

b)观察候选物质对于Metrnl蛋白或基因表达及活性的影响，其中，若所述候选物质能够促进Metrnl基因表达或提高Metrnl蛋白活性，则所述候选物质是防治溃疡性结肠炎的潜在物质。

本发明优点在于：

本发明采用Metrnl肠上皮特异性敲除小鼠及相应的对照野生型小鼠，制备DSS诱导的溃疡性结肠炎模型，结果显示：Metrnl肠上皮特异性敲除小鼠溃疡性结肠炎严重程度显著高于对照野生型小鼠，Metrnl肠上皮特异性敲除小鼠肠粘膜糜烂程度显著高于对照野生型小鼠，表明Metrnl蛋白可作为防治溃疡性结肠炎新的更有效的药物。本发明为防治溃疡性结肠炎提供了一种新方法，且由于Metrnl蛋白本身是一种人体的内源性蛋白质，其对人体可能的副作用很小，因此作为潜在药物的安全性很高。

附图说明

附图1为DSS诱导下两组动物体重变化的比较。

附图2为DSS诱导下两组动物溃疡性结肠炎整体指标综合评分的比较。

附图3为两组动物不造模时肠道形态学图片。

附图4为两组动物DSS造模5天后肠道形态学图片。

附图5为DSS诱导5天后两组动物肠粘膜糜烂程度的比较。

附图6为人、大鼠、小鼠Metrnl氨基酸序列全长比对图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Metrnl蛋白及基因

人、大鼠、小鼠Metrnl氨基酸序列全长比对图见图6。可参考文献：CNS Neurosci Ther.2014Apr；20(4):344-354。

在本文中，所用的Metrnl蛋白可以是天然存在的，比如其可被分离纯化自哺乳动物。此外，所述Metrnl蛋白也可以是人工制备的，比如根据常规基因工程技术来制备得到。任何合适的Metrnl蛋白均可适用于本发明。所述Metrnl蛋白包括全长的Metrnl蛋白或其生物活性片段。优选地，可以与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列基本相同。

经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的Metrnl蛋白的氨基酸序列也包括在本发明中。Metrnl蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述氨基酸替代的序列并不影响其活性或保留了其部分活性。适当替换氨基酸是本领域内的公知技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变已知分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必需氨基酸区域改变单个氨基酸并不会改变生物活性。

任何一种Metrnl蛋白的生物活性片段均可以应用到本发明中。在这里，Metrnl蛋白的生物活性片段的含义是指一种多肽，其仍然能保持全长的Metrnl蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％、60％至99％或者100％的全长Metrnl蛋白的活性。

本发明也可以采用经修饰或改良的全部或部分氨基酸的Metrnl蛋白，比如，可以为了促进半衰期、有效性、代谢和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的Metrnl蛋白。所述经过修饰或改良的Metrnl蛋白可以是一种Metrnl蛋白的共轭物，或其可被取代的或人工的氨基酸。所述经过修饰或改良的Metrnl蛋白或基因可以与天然Metrnl蛋白或基因有一定的不同点，但也能够扩张血管，且不会带来其它不良反应或毒性。也就是说，任何不影响Metrnl蛋白的生物活性或者说是基因的生物学功能的变化形式都可用于本发明中。

Metrnl增效剂及其用途

所述的“Metrnl增效剂”包括了激动剂、上调剂、稳定剂等，是指任何可提高Metrnl的活性、提高Metrnl的稳定性、上调Metrnl的表达、增加Metrnl有效作用时间的物质，这些物质均可用于本发明。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子等。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，蛋白水平的，也可以是上调Metrnl表达的病毒产品等。

实施例

一、方法

1.动物：采用Metrnl肠上皮特异性敲除小鼠及相应的对照野生型小鼠，每组9～12例小鼠，这些小鼠的培育方法详见已申请专利(申请号201610458874.0)及发表文献(Acta Pharmacol Sin.2016Aug 22.doi:10.1038/aps.2016.70.[Epub ahead ofprint])。

2.葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)给药：采用MP公司的DSS(分子量36000-50000)，配置3％浓度，采用自由饮用方式给药，制备DSS诱导的溃疡性结肠炎模型。

3.整体指标检测：体重测量为每天上午10点钟测定，并对体重变化进行评分(体重增加及变化在1％以内为0分，变化在1％-5％为1分，变化在5％-10％为2分，变化在10％-15％为3分，变化在15％以上为4分)；观察小鼠粪便及肛门出血情况，采用分级打分(不腹泻为0，稀便不占肛门为2，稀便占肛门为4；不出血为0，中度出血为2，重度出血为4)。

4.形态学检测：组织切片采用HE染色，镜下观察，各病变程度按照轻、中、重三级制打分，III级为最重，-为无明显病变，评分越高病变越重。粘膜糜烂：坏死累及粘膜浅层为I级,累及全层为II级，若有二处以上的粘膜浅层坏死为III级。

二、结果

1、给DSS前，两组小鼠体重均值皆为27.2g。在DSS诱导下，小鼠体重明显下降；与对照野生型小鼠相比，Metrnl肠上皮特异性敲除小鼠的体重下降更加明显(图1，*P<0.05)。

2、在DSS诱导下，根据体重、粪便及肛门出血情况进行整体指标综合评分，观察到Metrnl肠上皮特异性敲除小鼠溃疡性结肠炎严重程度显著高于对照野生型小鼠(图2，*P<0.05)。

3、形态学检测显示，在未给予DSS诱导的情况下，两组动物肠道形态学检测未发现明显异常(图3)；在给予DSS诱导5天后，Metrnl肠上皮特异性敲除小鼠肠粘膜糜烂程度显著高于对照野生型小鼠(图4，图5，*P<0.05)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海风劲生物医药科技有限公司

<120> Metrnl在防治溃疡性结肠炎中的应用

<130> /

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 127

<212> PRT

<213> mouse

<400> 1

Ser Ala Pro Cys Arg Pro Cys Ser Asp Thr Glu Val Leu Leu Ala Ile

1 5 10 15

Cys Thr Ser Asp Phe Val Val Arg Gly Phe Ile Glu Asp Val Thr His

20 25 30

Val Pro Glu Gln Gln Val Ser Val Ile Tyr Leu Arg Val Asn Arg Leu

35 40 45

His Arg Gln Lys Ser Arg Val Phe Gln Pro Ala Pro Glu Asp Ser Gly

50 55 60

His Trp Leu Gly His Val Thr Thr Leu Leu Gln Cys Gly Val Arg Pro

65 70 75 80

Gly His Gly Glu Phe Leu Phe Thr Gly His Val His Phe Gly Glu Ala

85 90 95

Gln Leu Gly Cys Ala Pro Arg Phe Ser Asp Phe Gln Arg Met Tyr Arg

100 105 110

Lys Ala Glu Glu Met Gly Ile Asn Pro Cys Glu Ile Asn Met Glu

115 120 125