肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子1在制备治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用的制作方法

本发明属于基因的功能与应用领域，具体涉及一种肿瘤坏死因子α诱导蛋白8 样分子1(tumor necrosis factor alpha induced protein 8like 1,TIPE1)基因在脂肪肝及相关疾病中的功能及应用，具体是在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病的药物中的应用。

背景技术：

随着现代人生活方式以及生活环境的改变，肥胖、脂质异常及糖尿病等代谢性疾病已经成为全球性的重大疾病，严重威胁公众的健康及生活质量。非酒精性脂肪肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)为一种无过量饮酒史，以肝细胞脂肪堆积及变性为病理特征的代谢性疾病，其发病因素包括肥胖、Ⅱ型糖尿病、血脂异常及代谢综合征等^1-3。NAFLD是最为常见的慢性肝脏疾病，根据全球大范围统计，NAFLD的发病率大约为25％，其中10-20％的患者最终发展为非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis,NASH)，而约三分之一的NASH 患者逐步演化为肝硬化，甚至肝癌^4,5。此外，伴随着NAFLD及NASH的出现，机体也会产生一系列的代谢紊乱综合征，如血脂代谢异常，糖尿病等。然而，目前尚无有效的药物及治疗手段攻克这一临床难题，鉴于此，寻找有效的预防措施及治疗手段势在必行。

肿瘤坏死因子α诱导蛋白8(tumor necrosis factor alpha induced protein 8, TIPE)家族类基因近几年被鉴定确认，包括TIPE、TIPE1、TIPE2、TIPE3，已有研究表明TIPE家族分子主要在肿瘤发生发展及免疫调控机制中发挥重要作用^6-9。 TIPE1是其中最晚被发现的基因，至今关于它的研究较少。TIPE1广泛表达于多种组织，研究报道TIPE1在肝癌组织中表达下调且与肿瘤恶性分级呈负相关，其通过抑制p65及JNK信号通路活性进而促进细胞凋亡¹⁰。关于TIPE1在肝脏脂肪累积及变性中的研究尚未见报道。

参考文献

[1]Reccia I,Kumar J,Akladios C,Virdis F,Pai M,Habib N,et al. Non-alcoholic fatty liver disease:A sign of systemic disease.Metabolism 2017 Jul；72:94-108.

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[4]Dyson J,Jaques B,Chattopadyhay D,Lochan R,Graham J,Das D,et al. Hepatocellular cancer:the impact of obesity,type 2diabetes and a multidisciplinary team.J Hepatol 2014Jan；60(1):110-117.

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技术实现要素：

为解决上述现有技术的缺陷和不足，本发明的目的在于提供一种TIPE1基因的表达与脂肪肝及相关疾病之间的相互关系，提供一个用于治疗脂肪肝及相关疾病的靶基因TIPE1的新用途，进而把TIPE1基因应用于脂肪肝及相关疾病的治疗。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明第一方面，提供肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子1在制备保护肝脏的药物中的应用。

优选地，所述药物具有抑制肝脏脂质堆积的功能。

本发明第二方面，提供肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子1在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用。

本发明涉及的肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子1在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用，所述的药物的活性成分是肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子1。

本发明涉及的肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子1在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用，具体的是肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子1作为药物靶点筛选预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病的药物，所述药物是提高肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子1表达量的试剂。

优选地，提高肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子1表达量的试剂，给药方式为直接裸DNA注射法、脂质体包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法、复制缺陷腺病毒携带目的DNA法、PEG 修饰蛋白药物注射法、脂质体包裹蛋白静脉注射法，或蛋白微球制剂皮下注射法。

所述的肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子1或TIPE1，包括基因或蛋白。所述的TIPE1基因在对象体内经转录翻译为肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子1 蛋白产物。

所述脂肪肝及相关疾病包括但不限于：胰岛素抵抗、代谢综合征、肥胖、糖尿病、高血糖、高血脂症、单纯性肝脏脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎，肝纤维化、肝硬化、肝癌等。

本发明通过试验确定了肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子1的表达与脂肪肝及相关疾病之间的关系：

本发明以人正常肝脏L02细胞系及TIPE1过表达的L02细胞系为研究对象，通过棕榈酸酯(PA)及油酸(OA)刺激诱导肝脏细胞脂质堆积模型进而研究TIPE1 基因的功能。研究发现，TIPE1过表达能够显著改善肝脏细胞内脂质堆积，说明TIPE1能够保护肝脏细胞免受脂肪样变性，TIPE1在肝脏脂质代谢性疾病中起着保护作用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明发现TIPE1基因的新功能，即TIPE1基因具有能够抑制脂肪肝及相关疾病的作用。

(2)基于TIPE1在保护脂肪肝及相关疾病中的作用，其可以用于制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病的药物。由于TIPE1是机体内源性蛋白质，因此作为药物的安全性很高。

附图说明

图1为L02细胞株TIPE1蛋白表达量Western Blot检测结果。

图2为L02细胞经PA+OA(0.4mM+0.8mM)刺激后油红O染色结果(×400)。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

本发明中的实验所涉及的试剂在国内外市场购买，或按照说明书中的配方自行配制；未做特殊说明的实验方法都是采用本领域已知的常规方法。

细胞培养

人肝脏细胞系L02购自中国科学院细胞库(目录号GNHu6)，人胚肾HEK293T 细胞购自美国菌种保藏中心(American type culture collection，ATCC)。上述细胞均采用DMEM高糖培养基(含10％FBS，1％青霉素-链霉素)置于5％CO2的 37℃恒温细胞专用培养箱培养，实验用细胞培养时间不超过三个月，每三个月进行一次支原体检测。细胞冻存采用含10％DMSO的FBS冻存。

TIPE1过表达质粒构建

1)PCR扩增TIPE1基因，引物为：

正向：5’-CGCGGATCCATGGACACCTTCAGCACCAA-3’，

反向：5’-ACGCGTCGACTCAGAGGCTGCCCTCGTCCA-3’；

2)PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，随后使用DNA凝胶回收试剂盒(天根) 进行DNA片段的回收；

3)将所得DNA产物和限制性核酸酶内切BamHI和SalI(Thermo)、buffer orGreen buffer、ddH2O混合均匀(50μl体系)，置于37℃条件下反应。使用AxyPrep^TMPCR Clean-Up Kit(Axygen) 回收酶切产物；

4)使用PCR一步定向克隆试剂盒(Novoprotein)按照试剂盒说明书进行重组反应；

5)制作大肠杆菌感受态细胞，将上述连接产物进行转化实验，涂板，置于 37℃培养箱，过夜培养；

6)从37℃培养箱中取出过夜培养的平板，挑克隆摇菌，并检测菌落PCR阳性克隆；

7)将PCR鉴定为阳性的菌液吸取5-10μl接种至5ml LB(含抗性)培养基中，在220rpm，37℃摇床中过夜培养；

8)取出过夜培养的菌液，对已经混浊的菌液进行质粒提取(天根质粒DNA 小提试剂盒)；

9)提取后的质粒可直接用于构建慢病毒包装。

慢病毒载体构建和包装

1)前一天开始在6孔板中培养HEK293T细胞，使每孔细胞预计在铺板后第二天的细胞汇聚度为50％以上。

2)在200μlI Reduced Serum Medium中加入转染试剂(PEI Max，或Lipofectamine 2000)，轻轻混匀，简短离心(DNA(μg)：转染试剂(μl)＝1:0.5 ～1:5)；

3)在200μl Opti-MEMR○I Reduced Serum Medium中加入目的基因质粒1μg、包装质粒(慢病毒常用pMD2.G(Addgene，12259)0.5μg和psPAX2(Addgene， 12260)0.75μg，轻轻混匀，简短离心；

4)将2)和3)体系轻轻混匀，简短离心，室温孵育20min；

5)将混合体系滴加到培养HEK293T细胞的6孔板中，轻轻混匀；

6)转染6h后，换新鲜培养基；

7)转染后48-72h收获含病毒的上清，3000rpm离心10min，去除沉淀，并用0.45μm的滤膜过滤；

8)过滤后的病毒可立即用于感染或-80℃贮存。

细胞感染

(1)L02细胞铺板：每种病毒感染两个孔，并留出一孔作为空白对照，以便后期筛选细胞用。

(2)第一次感染：将病毒液与待感染的L02细胞(和普通转染密度一致) 培养基混合，混合比率取决于病毒滴度和细胞承受能力(本次每孔使用500μl 病毒液+2ml完全培养基)，并随后加入2.5μl聚凝胺(8mg/mL)，使其终浓度为8μg/ml。

(3)感染后最快2h即可换液终止感染，若细胞承受力强，最长可持续感染24h。

(4)第二次感染：感染24h后，再感染一次。

加药筛选细胞

第一次感染48h后，在六孔板中(包括空白孔)加入含有嘌呤霉素的完全培养基(终浓度为1μg/ml)，待空白孔细胞完全死亡，将六孔板中细胞传代至 T25培养瓶，一般空白细胞在24～48h后全部死亡。待细胞长满后，收取一部分细胞做Western blot验证过表达，并冻存部分细胞。

Western blot分析

1)制胶

根据目的蛋白大小选择需要的分离胶浓度，一般8％-10％的分离胶可满足大部分实验需求。

2)蛋白提取

细胞用适量RIPA(50mM Tris-HCl PH7.4,150mM NaCl,1％Triton X-100or NP-40,1％Sodium deoxycholate,0.1％SDS,1mM EDTA，使用前加蛋白酶或磷酸酶抑制剂)冰上裂解10-30min；4℃，12000g离心10min，上清即为总蛋白；采用BCAProtein Assay Kit进行蛋白定量，取30-50μg总蛋白进行Western blot 分析。

3)上样及电泳

保证上样量及上样体积一致，恒压电泳，上层胶采用80-90V，下层胶采用 100V。

4)转膜

配制转膜液，提前预冷；PVDF膜使用前用甲醇浸泡1-2min；转膜，胶在负极侧，膜在正极侧，海绵、滤纸提前浸泡。转膜电压设为250V，电流设为0.2A，转移1.5h。

5)封闭

5％脱脂奶粉(in TBST)于震荡摇床室温封闭1h。

6)一抗孵育

封闭结束后用TBST洗涤蛋白膜3次，每次5min，加一抗(TIPE1，AVIVA system，ARP52919_P050)，4℃孵育过夜。

7)二抗孵育(抗兔二抗来源，购自北京博奥龙免疫技术有限公司，抗兔二抗货号为BF03008/BF03008X)

一抗孵育后膜用TBST洗3遍，每次5min，加一定比例二抗(in TBST)室温孵育1h。

8)显影。

孵育后用TBST洗涤3次，每次5min。利用Bio-Rad Chemi Doc XRS+凝胶成像系统检测目的条带。

油红O染色

1)细胞固定：细胞用PBS洗涤2-3次，去除死细胞，加入300μl 4％多聚甲醛固定20min；

2)加入1×PBS洗涤2次后，加入60％异丙醇漂洗10s，弃去异丙醇，晾干；

3)每孔加入500μl油红O染色1min；

4)加入PBS洗涤2-3次，去除背景的红色，在显微镜下观察，拍照。

实施例1TIPE1过表达对肝细胞脂肪堆积的影响

构建过表达TIPE1的慢病毒表达载体，转染HEK-293T细胞，包装慢病毒，感染L02细胞构建过表达TIPE1的稳定细胞株(pHAGE-TIPE1)，同时过表达空载体作为对照组(pHAGE组)，通过Western blot检测稳定细胞株是否高表达TIPE1；表达成功的L02细胞种板，分为4组，即pHAGE对照组，pHAGE-TIPE1对照组， pHAGE实验组，pHAGE-TIPE1实验组。待细胞贴壁后，实验组加入棕榈酸酯(PA，终浓度0.4mM)和油酸(OA，0.8mM)刺激，同时对照组加入同等量的BSA， 16h后进行油红O染色。

Western blot检测结果如图1所示，感染过表达TIPE1慢病毒的L02细胞株中，TIPE1的蛋白表达量显著高于空载对照组，说明过表达TIPE1的L02稳定细胞株构建成功。油红O染色结果如图2所示，BSA处理细胞时，pHAGE对照组， pHAGE-TIPE1对照组细胞均无明显着色，而当加入PA+OA刺激后，与对照组相比，pHAGE实验组和pHAGE-TIPE1实验组被油红O染色的细胞数目及着色程度显著增多。但pHAGE-TIPE1实验组与pHAGE实验组相比较，pHAGE-TIPE1实验组中被油红O染色的细胞数目及着色程度显著减弱，说明TIPE1过表达能够抑制 PA和OA刺激导致的肝细胞脂质沉积。

上述结果表明TIPE1过表达能够抑制PA和OA刺激导致的肝细胞脂质沉积， TIPE1在脂肪肝及其相关疾病的病理过程中起着保护作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉大学

<120> 肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子1在制备治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgcggatcca tggacacctt cagcaccaa 29

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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