含OTU功能域的泛素醛结合蛋白1在制备治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用的制作方法

本发明属于基因的功能与应用领域，特别涉及一种去泛素化酶，即含OTU 功能域的泛素醛结合蛋白1(OTU Domain-Containing Ubiquitin Aldehyde-Binding Protein 1，OTUB1)在脂肪肝中的功能和应用，以及OTUB1作为靶基因在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝的药物中的应用。

背景技术：

非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种无过量饮酒史，以肝细胞脂肪变性和脂质贮积为特征的临床病理综合征[1][2]。随着人类社会经济发展和医疗水平的提高，多种慢性肝病发病率保持稳定甚至下降，而 NAFLD的发病率却呈现快速上升的趋势。最新流行病学调查显示，NAFLD是世界范围内慢性肝病的首要病种，在普通人群中发病率为25％-30％，其中 10％-20％病人发展为非酒精性脂肪肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis，NASH)，即以肝脏脂肪变性、炎症和纤维化为主要特征的肝脏疾病[3][4]。据统计，NAFLD 的单纯脂肪变性与严重肝脏疾病的发病率和病死率并无显著相关，但进展到 NASH则显著增高肝硬化、肝衰竭及肝细胞癌等疾病的发病风险[5][6]。在NASH 病人中15％-50％出现肝纤维化，7％-25％则出现肝硬化及更为严重的肝细胞癌 [7]。然而，针对该疾病目前尚无确证的临床用药和治疗手段^[3][8]。由于发病率高、并发症多、死亡率高等特点，NASH及其导致的肝脏和代谢性疾病给家庭和社会带来巨大的经济负担，并成为威胁我国居民健康和社会发展的重大公共卫生问题。因此，寻求积极有效的NASH预防措施和治疗手段迫在眉睫。

OTUB1是半胱氨酸蛋白酶OTU超家族中的一员。其编码的蛋白可以从多聚泛素链上切除泛素基团，是一个高度特异性的泛素肽酶。OTUB1在不同的信号通路中都发挥了重要的生物学功能。首先，OTUB1参与炎症反应，可以和泛素化E3连接酶TRAF3相互作用而抑制免疫系统中IRF3基因的表达[8]。其次， OTUB1在肿瘤的发生发展过程中也起到了十分重要的作用。它可以通过和RAS 蛋白相互作用而稳定RAS蛋白并且激活RAS信号通路，从而促进了肿瘤细胞生长[9]。而另一方面，OTUB1能够稳定p53的蛋白水平并且激活DNA损伤信号通路[10]。但是关于本发明OTUB1在NAFLD中的功能及其应用目前尚未见报道。

参考文献

[1].Musso G,Cassader M,Gambino R.Non-alcoholic steatohepatitis:emerging molecular targets and therapeutic strategies.Nat Rev Drug Discov 2016；15:249-274.

[2].朱鹏,徐宗,王宇明.世界胃肠病学会全球指南:非酒精性脂肪性肝病及非酒精性脂肪性肝炎.临床肝胆病杂志2014；30:842-845.

[3].Review T,LaBrecque DR,Abbas Z,Anania F,Ferenci P,Khan AG,et al.World Gastroenterology Organisation global guidelines:Nonalcoholic fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis.J Clin Gastroenterol 2014；48:467-473.

[4].Bellentani S.The epidemiology of non-alcoholic fatty liver disease.Liver Int 2017；37Suppl 1:81-84.

[5].Michelotti GA,Machado MV,Diehl AM.NAFLD,NASH and liver cancer.Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2013；10:656-665.

[6].Hardy T,Oakley F,Anstee QM,Day CP.Nonalcoholic Fatty Liver Disease: Pathogenesis and Disease Spectrum.Annu Rev Pathol 2016；11:451-496.

[7].Day CP,Saksena S.Non-alcoholic steatohepatitis:definitions and pathogenesis. J Gastroenterol Hepatol 2002；17Suppl 3:S377-384.

[8].Zhang HJ,He J,Pan LL,Ma ZM,Han CK,Chen CS,et al.Effects of Moderate and Vigorous Exercise on Nonalcoholic Fatty Liver Disease:A Randomized Clinical Trial.JAMA Intern Med 2016；176:1074-1082.

[9].Peng,Y.,Xu,R.,&Zheng,X.(2014).HSCARG negatively regulates the cellular antiviral RIG-I like receptor signaling pathway by inhibiting TRAF3 ubiquitination via recruiting OTUB1.PLoS pathogens,10(4),e1004041.

[10].Baietti M F,Simicek M,Asbagh L A,et al.OTUB1triggers lung cancer development by inhibiting RAS monoubiquitination.EMBO molecular medicine, 2016,8(3):288-303.

技术实现要素：

为解决现有技术的缺陷和不足，本发明旨在提供一种OTUB1基因的表达与脂肪肝之间的相互关系，提供一个用于治疗脂肪肝的靶基因OTUB1的新用途，进而把OTUB1基因应用于脂肪肝的治疗中。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

本发明第一方面，提供含OTU功能域的泛素醛结合蛋白1在制备保护肝脏的药物中的应用。

优选地，所述药物具有抑制肝脏脂质堆积的功能。

本发明第二方面，提供含OTU功能域的泛素醛结合蛋白1在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用。

本发明涉及的含OTU功能域的泛素醛结合蛋白1在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用，所述的药物的活性成分是含OTU功能域的泛素醛结合蛋白1。

本发明涉及的含OTU功能域的泛素醛结合蛋白1在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用，具体的是含OTU功能域的泛素醛结合蛋白 1作为药物靶点筛选预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病的药物，所述药物是提高含OTU功能域的泛素醛结合蛋白1表达量的试剂。

优选地，提高含OTU功能域的泛素醛结合蛋白1表达量的试剂，给药方式为直接裸DNA注射法、脂质体包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法、复制缺陷腺病毒携带目的DNA法、PEG 修饰蛋白药物注射法、脂质体包裹蛋白静脉注射法，或蛋白微球制剂皮下注射法。

所述的含OTU功能域的泛素醛结合蛋白1或OTUB1，包括基因或蛋白。所述的OTUB1基因在对象体内经转录翻译为含OTU功能域的泛素醛结合蛋白1 蛋白产物。

所述脂肪肝及相关疾病包括但不限于：胰岛素抵抗、代谢综合征、肥胖、糖尿病、高血糖、高血脂症、单纯性肝脏脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎，肝纤维化、肝硬化、肝癌等。

本发明通过试验确定了含OTU功能域的泛素醛结合蛋白1的表达与脂肪肝及相关疾病之间的关系：

本发明以正常人肝细胞L02细胞系为研究对象，利用慢病毒构建OTUB1敲除及过表达载体系统，得到OTUB1基因敲除或过表达的L02细胞。通过棕榈酸(palmitate)、油酸(oleic acid)(PA+OA)联合诱导的脂肪肝细胞模型来研究 OTUB1基因在脂肪变性中的功能。结果显示，在相同的PA+OA刺激下，与OTUB1基因正常表达的L02细胞相比，OTUB1基因敲除的L02细胞内红色脂肪滴大而多；相反的，OTUB1基因过表达的L02细胞内红色脂肪滴小而少。结果表明OTUB1基因能显著抑制肝脏脂质沉积，抑制脂肪肝的发生。

本发明人的研究证明了：在PA+OA联合刺激诱导的L02细胞脂肪肝体外模拟模型中，OTUB1具有抑制脂质沉积、保护肝细胞的作用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明发现OTUB1基因的新功能，即OTUB1基因具有能够保护脂肪肝的作用。

(2)基于OTUB1在保护脂肪肝中的作用，其可以用于制备预防、缓解和/ 或治疗脂肪肝的药物。由于OTUB1是机体内源性蛋白质，因此作为药物的安全性很高。

附图说明

图1是OTUB1稳定过表达(左)及敲低(右)L02细胞系的WB鉴定结果图；

图2是OTUB1稳定敲低L02细胞系在PA+OA刺激之后的油红O染色结果图；

图3是OTUB1稳定过表达L02细胞系在PA+OA刺激之后的油红O染色结果图；

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

本发明中的实验所涉及的试剂在国内外市场购买，或按照说明书中的配方自行配制；未做特殊说明的实验方法都是采用本领域已知的常规方法。

实验用细胞及培养：

人肝脏细胞系L02购自中国科学院细胞库(目录号GNHu6)，人胚肾 HEK293T细胞购自美国菌种保藏中心(American type culture collection，ATCC)。上述细胞均采用DMEM高糖培养基(含10％FBS，1％青霉素-链霉素)置于5％ CO2的37℃恒温细胞专用培养箱培养，实验用细胞培养时间不超过三个月，每三个月进行一次支原体检测。细胞冻存采用含10％DMSO的FBS冻存。

Western blot实验操作过程：

1)细胞中蛋白提取

细胞加入裂解液，裂解完成后离心取上清，运用BCA Protein Assay Kit定量收集蛋白样品。

2)上样与电泳

配置好电泳凝胶，并在电泳槽内加入电泳液。把蛋白样品上样到SDS-PAGE 胶加样孔内，点样完成后开始电泳。

3)转膜

①配制转膜液，于4℃预冷。

②将PVDF在甲醇中浸泡15s后放入转膜液中备用。

③取出凝胶板中的凝胶，用转膜液洗涤凝胶，将凝胶平铺在负极的滤纸上，将PVDF膜覆盖其上，夹上夹板。

④将夹板放入转膜槽中，灌满转膜液以淹没凝胶。

⑤转膜槽接通电源，电压设为250V，电流设为0.2A。转移1.5h。

⑥转移结束后，取出PVDF膜。

4)封闭

把蛋白膜放置到预先准备好的TBST中，洗去膜上的转膜液。蛋白膜放入封闭液中，在摇床上缓慢摇动，室温封闭1-4h。

5)一抗孵育

①用TBST洗涤蛋白膜3次，每次5min。

②封口机将薄膜封入杂交袋中，加上一抗(CST OTUB1(D8F7)Rabbit mAb #3783)。

③将杂交袋放入4℃摇床中，过夜。

6)二抗孵育

①将薄膜取出用TBST洗涤3次，每次5min，回收一抗。

②将膜放入对应的加有二抗(北京博奥龙免疫技术有限公司， BF03008/BF03008X)的二抗稀释液中，避光孵育1h。

7)蛋白检测

孵育后用TBST洗涤3次，每次5min。利用Bio-Rad Chemi Doc XRS+凝胶成像系统检测目的条带。

油红O染色实验操作：

1)样品组和对照组用1×PBS洗涤2次，加入300μl 3％多聚甲醛固定20min；

2)加入1×PBS洗涤2次后，加入60％异丙醇漂洗10s；

3)加入1×PBS洗涤2次，通风橱吹干；

4)每孔500μl加入油红O染色1h；

5)加入1×PBS洗涤2次，60％异丙醇进行分选，再加入1×PBS洗2次；镜检，拍照。

稳定转染细胞系的构建：

1.OTUB1慢病毒过表达质粒的构建

1)PCR扩增OTUB1基因，引物为：

正向：5’-CGC GGATCCATGGACGAGAAGACCACCGG-3’；

反向；5’-CCG CTCGAGCG TTTGTAGAGGATATCGTAGTGTCC-3’；

2)PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，随后使用DNA凝胶回收试剂盒(天根) 进行DNA片段的回收；

3)将所得DNA产物和限制性内切核酸酶FastDigest restriction enzymes (Thermo)、buffer orGreen buffer、ddH2O混合均匀(50μl体系)，置于37℃条件下反应。使用AxyPrep^TM PCR Clean-Up Kit(Axygen)回收酶切产物；

4)使用PCR一步定向克隆试剂盒(Novoprotein)按照试剂盒说明书进行重组反应；

5)制作大肠杆菌感受态细胞，将上述连接产物进行转化实验，涂板，置于 37℃培养箱，过夜培养；

6)从37℃培养箱中取出过夜培养的平板，挑克隆摇菌，并检测菌落PCR 阳性克隆；

7)将PCR鉴定为阳性的菌液吸取5-10μl接种至5ml LB(含抗性)培养基中，在220rpm，37℃摇床中过夜培养；

8)取出过夜培养的菌液，对已经混浊的菌液进行质粒提取(天根质粒DNA 小提试剂盒)；

9)提取后的质粒可直接用于OTUB1瞬转或构建慢病毒稳转细胞系。

2.OTUB1慢病毒敲低表达质粒的构建

1)OTUB1靶向干扰序列为shOTUB1-1:5’AGGAGTATGCTGAAGATGACA 3’和shOTUB1-2:5‘TGTGGTTGTAAATGGTCCTAT 3’；

2)将shOTUB1的序列克隆到pCDH-EF1-copGFP-T2A-Puro的(从addgene 购买，Plasmid#72263))载体中，并进行转化和氨苄抗性筛选；

3)所得质粒可用于慢病毒介导的OTUB1敲低细胞系构建。

3.慢病毒载体构建和包装：

1)用胰酶消化并记数HEK293T细胞，按1×106个HEK293T/孔传至6孔板中；

2)第二天细胞汇合度至80％时开始转染；

3)取1.5ml灭菌EP管，加入2个包装质粒psPAX2(Addgene，12260)和 pMD2.G(Addgene，12259)和过表达或干扰质粒各1μg溶于100μl的无血清培养基。轻柔混匀，室温孵育5min。

4)取1.5ml灭菌EP管，取3μl PEI(1.6μg/μl)溶于100μl无血清培养基中。轻柔混匀，室温孵育5min。

5)将DNA溶液和PEI溶液轻柔混匀，室温孵育15min；

6)将上述DNA-PEI混合液，逐滴加入6孔板中；

7)转染6h后，换新鲜培养基；

8)转染后48-72h收获含病毒的上清，3000rpm离心10min，去除沉淀，并用0.45μm的滤膜过滤；

9)过滤后的病毒可立即用于感染或-80℃贮存。

4.细胞感染：

(1)细胞铺板：每种病毒感染两个孔，并留出一孔作为空白对照，以便后期筛选细胞用。

(2)第一次感染：将病毒液与待感染的细胞(和普通转染密度一致)培养基混合，混合比率取决于病毒滴度和细胞承受能力(本次每孔使用500μl病毒液 +2ml完全培养基)，并随后加入2.5μl聚凝胺(8mg/ml)，使其终浓度为8μg/ml。

(3)感染后最快2h即可换液终止感染，若细胞承受力强，最长可持续感染 24h。

(4)第二次感染：感染24h后，再感染一次。

5.加药筛选细胞

第一次感染48h后，在六孔板中(包括空白孔)加入含有嘌呤霉素的完全培养基(终浓度为1μg/mL)，待空白孔细胞完全死亡，将六孔板中细胞传代至T25 培养瓶，一般空白细胞在24～48h后全部死亡。待细胞长满后，收取一部分细胞做WB验证过表达，并冻存部分细胞。

【实施例1】建立OTUB1稳定转染的L02细胞系

根据实施方式中L02稳定转染细胞系建立的步骤，建立OTUB1过表达和敲低的L02稳转细胞系。之后收集细胞，WB验证OTUB1的表达情况。结果如图 1所示，可见感染OTUB1过表达慢病毒系统的L02细胞中，OTUB1的表达显著升高；感染OTUB1敲低慢病毒系统的L02细胞中，OTUB1的表达显著降低，说明细胞系建立成功。

【实施例2】OTUB1敲低对肝细胞脂肪堆积的影响

(1)实验细胞分组：正常L02细胞对照组、OTUB1稳定敲低L02细胞对照组、正常L02细胞实验组、OTUB1稳定敲低L02细胞实验组。

(2)脂肪肝细胞模型的建立与检测：待细胞一贴壁，细胞培养到50％愈合度之后，向两个实验组中加入棕榈酸酯(PA)及油酸(OA)(PA 0.2mM+OA 0.4 mM)进行刺激，对照组中加入同等量的BSA，12h后收集各组细胞样品，进行油红O染色。

油红O染色结果如图2所示，对照组细胞无明显红色，实验组在加入PA+OA 刺激后，细胞中红色脂肪滴的面积显著增多，且OTUB1稳定敲低L02细胞中的红色脂肪滴面积的增加程度更为明显。该结果说明OTUB1表达的敲低可加重 PA+OA联合刺激诱导的的脂质沉积。

【实施例3】OTUB1过表达对肝细胞脂肪堆积的影响

1.实验细胞分组：正常L02细胞对照组、OTUB1稳定过表达L02细胞对照组、正常L02细胞实验组、OTUB1稳定过表达L02细胞实验组。

2.脂肪肝细胞模型的建立与检测：待细胞贴壁，细胞培养到50％愈合度之后，向两个实验组中加入棕榈酸酯(PA)及油酸(OA)(PA 0.2mM+OA 0.4mM) 刺激，对照组中加入同等量的BSA，12h后收集各组细胞样品，进行油红O染色。

油红O染色结果如图3所示，对照组细胞无明显红色，而当实验组中加入 PA+OA进行刺激后，实验组中红色脂肪滴的面积的细胞相比于对照组显著增多，而OTUB1稳定过表达L02细胞中的红色脂肪滴的面积相对于对照组phage中则显著减少。该结果说明，OTUB1过表达可抑制因PA+OA刺激产生的脂质沉积。

上述结果显示OTUB1基因过表达可显著抑制肝细胞脂质堆积，抑制脂肪肝的发生发展。OTUB1基因对脂肪肝病具有显著的抑制作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉大学

<120> 含OTU功能域的泛素醛结合蛋白1在制备治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgcggatcca tggacgagaa gaccaccgg 29

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccgctcgagc gtttgtagag gatatcgtag tgtcc 35

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aggagtatgc tgaagatgac a 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgtggttgta aatggtccta t 21