本申请要求于2015年9月29日提交的标题为“novelformulationandtreatmentmethods(新型制剂和治疗方法)”的澳大利亚临时申请号2015903951以及于2016年5月20日提交的标题为“novelformulationandtreatmentmethods(新型制剂和治疗方法)”的澳大利亚临时申请号2016901896的优先权，其内容以其整体通过引用的方式并入本文。
本发明大体上涉及6-硫鸟嘌呤(6-tg)的新制剂及其在改进的治疗方法中的用途。
发明背景
硫嘌呤化合物6-巯基嘌呤(6-mp；3,7-二氢嘌呤-6-硫酮)和硫唑嘌呤(aza；6-(3-甲基-5-硝基咪唑-4-基)硫烷基-7h-嘌呤)是前药，其经由嘌呤代谢的补救途径代谢形成作为主要活性代谢物的6-硫代鸟苷-三磷酸酯(6-tgtp)。aza和6-mp用于治疗许多疾病和状况，如炎症性状况；癌症；自身免疫状况；和移植后免疫抑制。这些化合物也用于炎性肠病(ibd)的治疗中，尽管临床活性的起效时间通常长达三至四个月，并且在受控的免疫抑制的期望临床终点与白细胞减少症的副作用之间具有相对细的联系。
体内的一些细胞(包括肝细胞和白细胞)转化aza或6-mp产生硫鸟嘌呤核苷酸形式的活性代谢物(6-tgn；主要是6-tgtp，次之为6-tgmp或6-tgdp)。这种代谢途径用图解的方式总结在图1中。
6-tgtp作用于活化的循环t-淋巴细胞，导致增殖停滞，然后细胞凋亡。然后，肠归巢循环免疫细胞的减少关闭适应性免疫系统在ibd部位的炎症放大。然而，aza/6-mp向硫鸟嘌呤核苷酸(6tgn)的代谢速率受到酶肌苷单磷酸脱氢酶(impdh)的限制。来自aza/6-mp代谢的6-tgn的出现需要数天，至少需要大约四周才能达到稳态。通常需要三至四个月才能实现药效作用，即临床作用。此外，在aza和6-mp转化期间还产生甲基化代谢物如me6mp、me6mpr和metimp。这些甲基化代谢物的高水平与许多不期望的副作用相关，包括肝毒性、恶心、极度疲劳、肌痛、胰腺炎和骨髓抑制(超出由6-tgtp诱导的免疫抑制作用预测的那些)。这些副作用在很大比例的开处方6-mp或aza的患者中是严重的，这一因素以及起效慢限制了6-mp和aza的使用。
根据目前的临床实践，在6-mp或aza治疗不成功的情况下可以将替代硫嘌呤化合物6-硫鸟嘌呤(6-tg；2-氨基-6,7-二氢-3h-嘌呤-6-硫酮)作为替代物开处方。
6-tg转化为tgn，但功能上不等同于6-mp或aza治疗。参照图1，将6-tg转化为6-tgtp(与6-mp或aza相同的主要活性代谢物)，但6-tg更直接被酶次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hprt)代谢，即通过6-mp或aza的代谢形成相同的主要活性代谢物，但代谢途径不同。6-tg首先被hprt转化为单磷酸类似物(6-tgmp)，然后经由激酶转化为活性代谢物6-tgtp。将6-tg转化为活性药物需要更少的代谢步骤，并且6-tg的转化速率不受impdh酶的限制。因此，6-tg转化为6-tgtp显著快于6-mp或aza，因此通过使用6-tg而在临床上更快地起效是可能的。此外，当身体代谢6-tg时，不产生在6-mp或aza代谢过程中产生的不太期望的甲基化代谢物。
不幸的是，6-tg治疗的较快起效与严重的肝毒性副作用强烈相关，产生肝血管疾病，包括窦性阻塞综合征(sos)；静脉闭塞性疾病(vod)；或结节性再生性增生(nrh)。这些血管性肝毒性副作用与6-mp或aza无显著相关性。
研究表明，接受口服6-tg的小鼠表现出与6-tg相关的血管性肝毒性副作用。然而，当分成两个单独的剂量口服施用相同日总剂量的6-tg时，小鼠的这些副作用大幅减少，表明肝血管毒性与峰浓度有关(us2013005749a1)。开发6-tg的剂量方案，其提供的活性代谢物的全身浓度的量足以诱导有效治疗，但在肝脏中不提供毒性水平的活性代谢物。然而，这些形式的6-tg施用仍然主要依赖于肝脏转化为活性代谢物，其中肝毒性可能是考虑因素。此外，由于6-tgtp的全身浓度作用于循环免疫细胞，这种作用机制是缓慢的，并且更显著地是，还与因血液和骨髓中的白细胞破坏而引起的免疫抑制(骨髓抑制)相关。
需要改进的疗法来克服目前的炎性肠病治疗的一个或多个缺点。
技术实现要素：
现已发现低剂量的6-tg但不是6-mp导致结肠中的快速局部抗炎作用且没有显著的免疫抑制。此外，靶向释放提供了治疗ibd的方法，其提供了不产生可察觉的全身浓度的6-tgn的更快速作用机理，并因此解决了6-tg的毒副作用问题，即由于6-tg的快速合成代谢导致的血管性肝毒性(如sos)和免疫抑制。
本发明基于以下令人惊讶的发现：在已用在饮用水中的葡聚糖硫酸钠(dss)诱导了结肠炎的hprt-/-小鼠(即缺乏催化6-tg代谢的关键酶的小鼠)中，疾病活动(炎症)快速且可察觉地减少。这一发现是特别出乎意料的，因为这些小鼠缺乏在肝脏和白细胞中通过常规的代谢途径形成tgn(活性代谢物)的能力。然而，在普遍理解的机理之外发现了活性代谢物的形成。疾病活动减少的幅度与在已用dss诱导结肠炎的野生型小鼠中发现的幅度相似。相比之下，在dss诱导的结肠炎中即使使用大剂量的6-mp，在一个月内结肠炎也没有减少，反映了快速起效与6-tg的施用相关，与此相比，6-mp和aza的起效需大约12至16周。6-tg在完全缺乏宿主hprt并且缺乏全身性6-tgtp的情况下实现了治疗，这一令人惊讶的发现暗示了6-tg经由驻留肠道细菌中的hprt转化为6-tgtp。在60分钟内用6-tg或6-mp体外孵育代表性肠道细菌大肠杆菌(e.coli)、粪肠球菌(enterococcusfaecalis)或多形拟杆菌(bacteroidesthetaiotamicron)证实这些细菌可以将6-tg代谢成活性代谢物6-tgtp。在相同的时期内相关硫嘌呤6-mp转化为6-tgtp的转化率相当低，与细菌的嘌呤补救途径中的限速impdh一致。
当6-tg以立即释放形式(丸剂剂量(bolusdose))施用于ibd患者时，其通过肝脏和白细胞全身性地转化为6-tgtp。据信6-tgtp作用于循环白细胞(特别是t淋巴细胞)，因而介导有益的免疫调节来治疗ibd。令人惊讶的是，在小鼠中，已经发现6-tg不需要t淋巴细胞和b淋巴细胞来改善结肠炎。6-tg能以独立于适应性免疫系统的方式在治疗上起作用。不希望受到理论的束缚，据信6-tg在炎症部位被肠腔细菌或患病粘膜转化为活性代谢物6-tgtp而没有任何可察觉的全身浓度。
这些令人惊讶的发现使得能够开发在远端肠(即远端回肠和结肠)的区域中释放6-tg的药物组合物。证明6-tg的局部作用的这些新发现使得直肠灌肠剂能够得以开发，所述直肠灌肠剂可直接在炎症部位有效治疗结肠的患病组织。此外，这些发现还使得能够开发口服缓释制剂，所述口服缓释制剂被配制为在炎症部位在远端肠中释放6-tg。这种靶向的6-tg施用是有效的，因为活性代谢产物在炎症部位产生并释放。因为结肠吸收较差，并且治疗作用大部分是通过局部低剂量的6-tg在远端肠起作用，所以大大减少或避免了血管性肝毒性和骨髓抑制。
因此，在一个方面，本发明有利地提供了包含一种包含6-硫鸟嘌呤(6-tg)的药物组合物，其中该组合物被配制用于在远端肠中释放6-tg。
在另一方面，本发明有利地提供了一种药物组合物，其包含6-tg和药学上可接受的载体，其中该组合物被配制用于灌肠施用。
在又一方面，本发明提供了一种配制用于口服施用的药物组合物，其包含6-tg和药学上可接受的载体，其中该组合物被配制用于在远端肠中释放6-tg。
在另一方面，本发明有利地提供了一种配制用于口服施用的药物组合物，其包含6-tg和药学上可接受的载体，其中该组合物被配制成在口服施用大约12小时后以0.2mg/小时至1mg/小时的速率释放6-tg。
在又一方面，本发明提供一种包含6-tg的药物组合物，其中该组合物为适合口服施用的形式并且包含与6-tg混合的药学上可接受的载体，对药学上可接受的载体进行选择以在从口服施用后大约12小时延伸直至24-36小时之间的时间段内以0.2mg/小时直至1mg/小时的速率在远端肠中提供6-tg的缓释。在某些实施方案中，该组合物还包含肠溶包衣。
在另一方面，本发明提供了一种配制用于口服施用的包含6-tg的药物组合物，其中至少45％的6-tg在结肠中释放。
在另一方面，本发明有利地提供了根据本发明的药物组合物，其中所述组合物用于治疗对6-tg有响应的远端回肠和/或结肠的炎症性疾病或状况，例如炎性肠病。
在又一方面，本发明有利地提供了一种用于治疗有需要的个体的对6-tg有响应的末端回肠和/或结肠的疾病或状况的方法，所述方法包括将6-tg施用于该个体，其中6-tg在远端肠中释放。例如，基本上避免了6-tg的全身浓度。例如，6-tg在与疾病或状况相关的炎症部位被肠腔细菌或患病粘膜代谢。该方法可以包括口服或灌肠施用。该方法可以包括施用本发明的组合物。
在又一方面，本发明提供了根据本发明的方法，其还包括施用另外的活性剂来治疗对6-tg有响应的疾病或状况。
在另一方面，本发明提供了6-tg在制备药物中的用途，其中该药物被配制成通过在远端肠中释放药物来治疗对6-tg有响应的末端回肠和/或结肠的疾病或状况。
附图简要说明
图1是说明硫嘌呤的代谢途径的示意图。
硫嘌呤：aza：硫唑嘌呤；6mp：6-巯基嘌呤；tg：6-硫鸟嘌呤；硫代嘌呤核苷酸：tgmp：硫代鸟苷单磷酸；tgdp：硫代鸟苷二磷酸；tgtp：硫代鸟苷三磷酸；合成代谢酶&代谢物：impdh：肌苷单磷酸脱氢酶；gmps：鸟苷单磷酸合成酶；timp：硫代肌苷单磷酸酯；itpa：肌苷三磷酸酶；hprt：次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶。
图2a-2c显示证明急性施用6-tg改善了winnie小鼠的自发性结肠炎的数据。c57bl/6(wt，空白符号)或winnie(灰色符号)小鼠每天强饲6-tg0、0.5、1或2.5mg/kg，长达14天。图2a)近端结肠(pc)和远端结肠(dc)的组织学结肠炎的盲评分；图2b)用每天6-tg0或2.5mg/kg治疗的wt和winnie的pc和dc的代表性h&e；图2c)相对于β-肌动蛋白(β-actin)基因以及相对于tnf-α、ifn-γ、il-1b、il-17、muc2的wt对照标准化的mrna倍数变化。中位数、四分位数和范围的箱须图，n＝4-6。符号：*：相比于wttg0mg/kg；#：相比于winnie6-tg0mg/kg。统计分析：mann-whitney非参数检验。比例尺＝100μm。
图3a-3g显示证明在28天内施用临床相关低剂量的6-tg改善了自发性winnie结肠炎和慢性dss诱导的结肠炎的数据。图3a-3c：winnie小鼠每天强饲6-tg0、0.5或6-mp2.5mg/kg/天，持续28天。图3a)外周血白细胞计数(wbc)，图3b)28天时综合腹泻分数单因素anovap<0.05；图3c)winnie中pc和dc的组织学结肠炎分数。图3d-3g：对wt小鼠施用水或含0.5％dss的饮用水，持续4个周期(5个工作日，然后对于前两个周期是7个休息日，最后2个周期是9个休息日)。对于最后两个周期(28天)，wt小鼠每天还管饲6-tg0或0.5mg/kg。图3d)外周血白细胞计数(wbc)；图3e)综合腹泻分数在治疗后得到显著改善(第34天时双因素anovap<0.05，第40天后p<0.001)；图3f)结肠重量；图3g)在使用或不使用dss或6-tg的情况下wt小鼠的pc和dc的组织学结肠炎分数。
图4a-4b显示证实6-tg具有独立于t淋巴细胞的治疗作用的数据。rag-/-小鼠缺乏t淋巴细胞和b淋巴细胞。将它们与winnie小鼠杂交以产生没有t淋巴细胞和b淋巴细胞的raw小鼠，其具有自发性结肠炎。图4a和4b：在winnie和raw(rag-/-xwinnie)小鼠中急性施用tg，每天强饲6-tg0或2.5mg/kg/天，持续至多14天。图4a)winnie(浅灰色条)和raw(深色条)的pc和dc的组织学结肠炎分数；图4b)用每天6-tg0或2.5mg/kg治疗12天的winnie和raw小鼠的dc的代表性h&e/阿尔新蓝染色。统计分析：mann-whitney非参数检验。符号：*相比于winnie6-tg0mg/kg；#相比于rawtg0mg/kg。
图5a-5g显示证实低剂量6-tg改善hprt-/-小鼠的慢性诱导型结肠炎的数据。对hprt-/-小鼠施用水或含0.5％dss的饮用水持续4个周期，并且对于最后两个周期(28天)每天管饲6-tg0或0.5mg/kg：图5a)最后2个周期内的体重变化％。统计分析：单因素anova与dunn多重比较；图5b)从第42天起疾病活动指数(dai)双因素anovap<0.001；图5c)结肠重量/长度比；图5d)用或不用dss或6-tg治疗的hprt-/-的pc、mc(中段结肠)和dc的组织学结肠炎分数；图5e)比较用0.5％dss、6-tg0mg/kg和用0.5％dss、6-tg0.5mg/kg治疗的hprt-/-的mc的代表性h&e；图5f)外周血白细胞计数和肠系膜淋巴结(mln)总细胞数；图5g)在hprt-/-小鼠中mln中的cd3e+cd4+t淋巴细胞数、髓细胞(cd3e-cd11b+)数和树突细胞(cd3-cd11c+mhcii+)数未被6-tg改变。n＝2-8，来自两次至三次实验。统计分析：mann-whitney非参数检验。符号：*相比于hprt-/-6-tg0mg/kg；#相比于hprt-/-dss6-tg0mg/kg。比例尺＝100μm。
图6a-6g显示证明以1mg/kg每天施用直肠内6-tg实现了自发性结肠炎的快速局部改善但6-mp没有实现这种改善的数据。图6a)综合腹泻评分；图6b)结肠重量/长度比；图6c)winnie小鼠的远端结肠(dc)、中段结肠(mc)和近端结肠(pc)的结肠炎的盲组织学评分。肠代表性细菌将6-tg转化为硫鸟嘌呤核苷酸(6-tgn)。体外：图6d)与1mm6-tg或6-mp一起孵育长达120分钟的大肠杆菌(革兰氏阴性)、粪肠球菌(革兰氏阳性)、多形拟杆菌(革兰氏阴性厌氧菌)培养物的平均tgn(sem)，n＝3-4；*相比于t0，#相比于t30，&相比于t60；图6e)转化为6-tg后的6-tgn的lc-ms测量(红色表示5μm6-tg标准)；图6f)散点图，在与0、5或10μm6-tg一起孵育的hprt-/-小鼠粪便中6小时时的平均6-tgn。体内：图6g)wt和hprt-/-小鼠管饲5mg/kg6-tg：散点图，肝脏和粪便中的平均6-tgn。统计分析：mann-whitney非参数检验。符号：*相比于wt小鼠。
图7a-7f显示证明6-tg促进自噬的数据。
6-tg的施用增强体外自噬：lc3-i、lc3-ii和β-肌动蛋白的蛋白质印迹。图7a)用dmso0.1％(溶媒对照)、6-tg(10或100μm)或这两者加上胃酶抑素a(pepstatina)和e64d(pe)处理hela细胞16h；图7b)用dmso0.1％或6-tg50μm处理ht29、hct116和hepg2细胞系16h；图7c)在使用和不使用6-tg的情况下raw细胞中的lc3-i:lc3-ii比率；细菌复制检测：图7d)hela细胞用溶媒对照(dmso)或6-tg(10、50和100μm)预处理过夜，然后用sl1344感染再施加处理：感染后12h时的sl1344lux复制读数；6-tg在此期间不改变细菌生长(od600吸光度)。n＝4-8次实验；图7e)在hela细胞中在用或不用6-tg50μm处理的情况下sl1344细菌的自噬体包封的荧光显微镜定量和图像。细菌的自噬体包封：蓝色-dapi核染色；红色-自由沙门氏菌；绿色-lc3。条形图，平均值±sd，n＝3。统计分析：未配对t检验*p<0.05。6-tg对自噬的作用是hprt依赖性的：图7f)lc3-ii与β-肌动蛋白比率的定量。wt和hprt-/-来源的原代鼠成纤维细胞用dmso0.1％或50μm6-tg处理16h。n＝5-6。蛋白质印迹图像。统计分析：mann-whitney非参数检验：*p<0.05wt6-tg50相比于0μm；##p<0.016-tg50μmhprt-/-相比于wt6-tg50μm。
图8a和8b显示6-tg片剂1至4的6-tg累积释放百分比的图示。这些溶出研究在ph1-2下进行1小时，然后在ph7.5下进行48小时。在进行6-tg片剂在40℃/75％rh(相对湿度)条件下的稳定性研究之前获得初始阶段的数据(图8a)。在40℃/75％rh条件下进行6个月的稳定性测试后，测定6-tg片剂的6-tg累积释放百分比(图8b)。
图9显示制剂5至11的6-tg片剂在ph7.5下在48小时内6-tg的累积释放百分比的图示。
图10显示制剂1至11的6-tg片剂在ph7.5下6-tg释放速率的图示。
图11是制剂9(t052)在48小时内的累积释放百分比(实线)以及制剂9的肠溶包衣形式在相同时间段内的估计累积释放百分比(虚线)的图示。
图12显示制剂9的片剂(t052/u-tg052)在42小时内的累积释放百分比以及制剂12(制剂9的片剂的肠溶包衣形式，ec-tg052)在相同时间段内的累积释放百分比的图示。
图13显示目前可接受的6-tg全身性转化成活性药物的范例的示意图。
图14显示在6-tg被共生细菌和/或粘膜细胞局部代谢的情况下6-tg前药转化为6-tgtp药物的局部效应的新范例的示意图。
发明详述
定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本文描述的那些相似或等同的任何方法和材料，但是描述了优选的方法和材料。为了本发明的目的，在下文对以下术语进行定义。
冠词“一(a)”和“一(an)”在本文中用于指该冠词的一个或多于一个(即，至少一个)语法对象。举例来说，“一个要素”意思是一个要素或多于一个要素。
如本文所用，术语“约”是指基准数量、水平、浓度、值、尺寸或量变化了多达10％或甚至多达9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的数量、水平、浓度、值、尺寸或量。
在本说明书通篇中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”将被理解为意指包括所陈述的步骤或要素或者步骤或要素组，但不排除任何其他步骤或要素或步骤或要素组。
如本文所用，术语“远端肠”是指包含远端回肠和结肠的肠段。在一些实施方案中，相关的远端肠段是结肠。
如本文所用，术语“结肠”是指减去直肠的大肠。也就是说，术语“结肠”是指由盲肠、升结肠、横结肠、降结肠和乙状结肠组成的肠段。
如本文所用，短语“对6-tg有响应的远端回肠和/或结肠的疾病或状况”、“对6-tg有响应的远端肠的疾病或状况”或类似表述是指能被6-tg治疗的远端回肠或结肠的任何疾病或状况，包括治疗该疾病或状况的任何症状。优选地，该疾病或状况是炎症性疾病或状况。此类炎症性疾病或状况的实例包括溃疡性结肠炎、克罗恩病(crohn’sdisease)和ibd-u(ibd-未分化型)。
在本文中使用时，短语“炎性肠病”是影响远端回肠和/或结肠的状况，包括溃疡性结肠炎、克罗恩病和ibd-u(ibd-未分化型)。
术语“缓释制剂”是指在延长的时间段内转化或降解或代谢为其所含活性成分(例如6-tg)或提供其所含活性成分(例如6-tg)的来源的制剂。这种制剂在本领域中也可以称为缓释制剂或持续释放制剂。
术语“缓释”是指在延长的时间段内从药物制剂中释放活性药物成分(6-tg)，因此在制剂通过远端肠时提供连续的局部递送6-tg。在一些实施方案中，6-tg的缓释具有基本上零级动力学。
术语“个体”、“患者”和“受试者”在本文中可互换地用于指人类或其他动物来源的个体，包括期望使用本发明的方法检查或治疗的任何个体。然而，将理解这些术语并不意味着存在症状。落入本发明范围内的适合的动物包括但不限于人类、灵长类动物、家畜动物(例如羊、牛、马、驴、猪)、实验室试验动物(例如兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠)、陪伴动物(例如猫、狗)和圈养野生动物(例如狐狸、鹿、澳洲野狗、鸟、爬行动物)。
短语“6-tg副作用”和类似表述是指由其6-tg代谢物(包括6-tgtp(和/或相关代谢物))引起的不良或不期望的副作用，包括但不限于血管性肝毒性，包括窦性阻塞综合征(sos)、静脉闭塞性疾病(vod)和结节性再生性增生(nrh)；和免疫抑制或骨髓抑制。
“药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂”意为能安全用于局部或全身施用的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。
如本文所用的术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”涵盖在患有对6-tg有响应的疾病或状况的个体中对该疾病或状况的治疗，包括：抑制该疾病或状况，即阻滞其发展；缓解该疾病或状况，即导致该疾病或状况消退；或缓解由该疾病或状况引起的症状，即缓解疼痛或炎症而不解决该基础疾病或状况。
本发明源于以下发现：6-tg可以在炎症部位局部且快速地起作用，并且被肠腔细菌转化成活性代谢物6-tgtp而没有任何可察觉的全身浓度。还据信在6-tg转化为6-tgtp的过程中可能牵涉结肠和/或远端回肠的内膜(lining)中的病变粘膜或上皮和驻留的白细胞。6-tg的有益作用可以独立于t淋巴细胞。由于在炎症部位的附近产生活性代谢物，这允许比依赖全身代谢的方案更快速的治疗作用。这也解决了6-tg毒副作用如血管性肝毒性和免疫抑制的问题。基于6-tg在治疗hprt缺陷型宿主的结肠炎中效果良好这一令人惊讶的发现，已经开发了更快速地治疗对6-tg有响应的远端回肠和/或结肠的疾病或状况而无可察觉的全身浓度并且与常规6-tg疗法相比减少或无6-tg副作用的治疗方案。
已进一步证明直肠内施用6-tg在14天内改善了远端结肠中的自发性结肠炎。对中段结肠或近端结肠中的结肠炎没有改善表明6-tg的有益作用是局部的。直肠内施用6-mp没有提供任何显著的结肠炎改善，证明6-tg和6-mp/aza缺乏功能等同性。因此，将6-tg局部递送到ibd的肠炎症部位比当前的免疫调节疗法提供显著的优点。
不受理论的束缚，据信6-tg被肠道细菌和/或通过粘膜代谢来代谢。6-tg被转化为6-tgn。6-tgn本身不存在于细胞外。然而，据信在ibd中易位共生或致病细菌被肠上皮细胞和免疫细胞吞噬。会另外阻止细菌的显著易位的粘膜屏障在ibd中被损害。胞质内自噬体中细菌的自噬被6-tgn增加，导致上皮细胞的细菌清除增加。还据信6-tg的细菌来源的代谢物(特别是6-tgtp)将由细菌释放，所述细菌被内衬在末端回肠和结肠的肠上皮细胞和免疫细胞杀死。6-tg还被粘膜中催化加成核糖基-磷酸酯的hprt转化以形成6-tgmp，其然后在细胞内被硫代鸟苷激酶转化为6-tgdp和6-tgtp。这之后可被磷酸酶和磷酸化酶分解代谢为6-硫代鸟苷(6-tgr)，随后代谢为6-tg。也可以由6-tgr激酶直接将6-硫代鸟苷(6-tgr)转化为6-tgmp。
因此，本发明提供包含6-tg的组合物，其中该组合物被配制用于在远端肠(优选结肠)中释放6-tg。适合地，该组合物是药物组合物。适合地，该组合物被配制成基本上在远端肠中释放6-tg。适合地，该组合物被配制用于在远端肠中缓释6-tg。适合地，该组合物在远端肠中释放至少45％的6-tg。在一些实施方案中，远端肠段是结肠。适合地，该组合物用于治疗对6-tg有响应的远端回肠和/或结肠的疾病或状况。适合地，该组合物用于治疗ibd，例如溃疡性结肠炎、克罗恩病或ibd-u。在一些实施方案中，该组合物可以用于治疗显微镜下结肠炎(microscopiccolitide)；例如淋巴细胞性(肠)结肠炎和胶原性(肠)结肠炎。
适合地，该组合物被配制用于口服施用或灌肠施用。优选地，该组合物被配制用于口服施用。
适合地，该组合物是口服组合物。适合地，口服组合物为缓释形式并且包含6-tg的缓释制剂。该组合物可以是包含6-tg和适合用于提供6-tg的缓释的药学上可接受的载体的药物组合物。
口服组合物从口到肛门的转运时间(transittime)在个体与个体之间有很大差异，并且许多参数如年龄、固体或液体食物摄取、饮食、体重、性别、健康状况、肠的疾病状态等都会影响实际的转运时间。不是所有的摄入物质都以相同的速率转运，以至于通常按照同时摄入的口腔标记物的50％清除率来测量转运。从口到进入十二指肠的转运时间通常在大约30分钟到90分钟的范围内变化。从十二指肠转运通过小肠进入盲肠的平均时间为大约2-6小时。从口到盲肠的典型转运时间被认为是大约4-8小时。通过结肠(从盲肠到肛门)的转运时间为大约12到36小时)。因此，从口到肛门的典型转运时间被认为是大约36小时，尽管这可能差别很大。典型的转运时间可以在约20小时至约48小时范围内变化。适合地，该口服组合物被配制成在口服施用大约12小时后提供6-tg的缓释。根据本发明的示例性口服制剂的释放曲线在图11中示出。
适合地，该口服组合物被配制成在口服施用大约12小时后以0.2mg/小时至1mg/小时的速率释放6-tg。不受理论的束缚，据信在施用缓释口服制剂后经过12小时后，该制剂将进入结肠，在此随着其继续通过远端肠的剩余部分，其将释放6-tg。在一些实施方案中，该制剂将提供6-tg释放的近似零级动力学。
适合地，该组合物被配制成在口服施用后12至48小时以至少0.2mg/小时的速率释放6-tg。适合地，该组合物被配制成在口服施用后12至48小时以0.2mg/小时至5mg/小时的速率释放6-tg。适合地，释放速率是在ph6至约ph7.5。适合地，组合物被配制成在约ph6至约ph7.5下释放6-tg。适合地，该制剂在ph<5时不释放6-tg。
在一个方面，本发明提供了包含6-tg的药物组合物，其中该组合物为适合用于口服施用的形式并且包含与6-tg混合的药学上可接受的载体，对药学上可接受的载体进行选择以在从口服施用后约8小时延伸的时间段内提供6-tg的缓释。优选地，本发明提供包含6-tg的药物组合物，其中该组合物为适合用于口服施用的形式并且包含与6-tg混合的药学上可接受的载体，对药学上可接受的载体进行选择以在从口服施用后约12小时延伸的时间段内提供6-tg的缓释。优选地，释放基本上是在结肠中进行。适合地，该组合物在从口服施用后8小时、10小时或12小时延伸直至例如18、24、30、36、40或48小时的时间段内提供缓释。适合地，该组合物在6至7.5的ph范围下提供缓释。适合地，该组合物被配制成在从12小时延伸的时间段内以0.2-0.4mg/小时；0.4-0.6mg/小时、0.4-0.8mg/小时；0.2-0.6mg/小时；0.2-1.0mg/小时；0.4-1.0mg/小时；0.2-1.5mg/小时；0.2-2mg/小时；0.2-2mg/小时；或者大约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0、1.2、1.5或2mg/小时的速率释放6-tg。在一个实施方案中，该组合物从12小时至48小时以0.28-0.4mg/小时的速率释放6-tg。将理解，该时间终点可以是制剂残余物从肠排出的时间。
在一些实施方案中，本发明的口服制剂以受控方式释放6-tg，并在口服施用24小时结束时达到释放约80％的6-tg含量。
在一个实施方案中，组合物是灌肠剂组合物。该灌肠剂组合物可以是包含6-tg和至少一种药学上可接受的载体的药物组合物。适合地，灌肠剂组合物可以是溶液或悬浮液的形式。适合地，灌肠剂组合物可用于治疗结肠(特别是降结肠和/或乙状结肠)的炎症性疾病或状况。
在另一方面，本发明提供了包含6-tg和适用于灌肠施用的至少一种药学上可接受的载体的药物组合物。
在一个实施方案中，治疗有需要的个体的对6-tg有响应的远端回肠和/或结肠的炎症性疾病或状况的方法，所述方法包括向该个体施用6-tg，其中6-tg在远端肠中释放，是炎性肠病(ibd)。优选地，6-tg在结肠中释放。ibd形式的实例包括溃疡性结肠炎、克罗恩病和ibd-u。适合地，6-tg在远端回肠或结肠中被肠腔细菌或患病粘膜转化为活性药物。适合地，降低或避免6-tg的全身浓度。适合地，该方法避免或至少大幅减少了在产生活性或相关代谢物的肝门静脉或全身浓度时观察到的不期望的6-tg副作用，包括血管性肝毒性(如sos)和骨髓抑制。在一些实施方案中，该方法包括口服或灌肠施用6-tg。
在一些实施方案中，该方法包括口服施用。适合地，该方法包括施用包含6-tg的缓释制剂的组合物，例如该方法可以包括施用本发明的组合物。
在一些实施方案中，该方法包括灌肠施用。适合地，该方法包括施用包含6-tg的灌肠剂组合物，例如该方法可以包括施用本发明的组合物。适合地，灌肠剂组合物为溶液或悬浮液的形式。适合地，该方法用于治疗结肠(优选降结肠和/或乙状结肠)的炎症性疾病或状况。
在一些实施方案中，所述方法还包括施用除了6-tg之外的另一种活性剂来治疗对6-tg有响应的疾病或状况，包括但不限于选自以下的活性剂：美沙拉秦(或5氨基水杨酸)、巴柳氮、柳氮磺胺吡啶、皮质类固醇、环孢菌素化合物、抗tnf-α化合物。另外的活性剂可以以与包含6-tg的(一种或多种)组合物相同的(一种或多种)组合物或不同的(一种或多种)组合物施用。另外的活性剂可以与包含6-tg的组合物同时或不同时施用。本发明指出包含6-tg组合物和包含另外的活性剂的组合物的组合、试剂盒或商品包装。这样的试剂盒或商品包装可以包括使用说明。在一些情况下，提供包含6-tg和其他活性剂的组合物可能是适当的。在一些实施方案中，组合物不包含6-mp或aza。在一些实施方案中，组合物包含6-tg作为唯一的活性药物成分。
制剂和施用途径
本发明的组合物或在本发明方法中使用的组合物可以使用本领域已知的方法进行配制和施用。用于配制和施用的技术可以在以下书籍中找到：见于remington:thescienceandpracticeofpharmacy(雷明顿：药剂学科学与实践),loydv.allen,jr(ed),thepharmaceuticalpress,london,22ndedition,september2012。
组合物可以包含至少一种药学上可接受的赋形剂、载体和/或稀释剂，包括赋予期望的稠度、强度、粘度、质地和外观的那些赋形剂、载体和/或稀释剂。根据美国食品和药物管理局发布的国际协调会议(internationalconferenceonharmonisation)，组合物还应该具有要求的保质期。
例如，使用药学上可接受的赋形剂、载体和/或稀释剂(包括本领域公知的那些)可以容易地将组合物配制成适于施用的剂量。这样的赋形剂、稀释剂和载体能够将组合物配制成用于口服施用于个体的剂型，如片剂、丸剂、胶囊剂等。这样的赋形剂、稀释剂和载体能够将组合物配制成用于施用于个体的灌肠剂型，如溶液和混悬液等。可接受的赋形剂、稀释剂和载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于生理盐水、无热原或无菌水、糖、糖醇、淀粉、纤维素及其衍生物、明胶、滑石、胶体二氧化硅、硬脂酸镁、硫酸钙、植物油、合成油、多元醇、磷酸盐缓冲溶液和乳化剂。
用于口服施用的药物制剂可通过以下步骤获得：将6-tg与固体载体合并，任选地研磨所得混合物，在加入合适的助剂(如果需要)后加工颗粒混合物以获得片剂或糖衣丸核。合适的载体特别是填充剂，如糖或糖醇，包括乳糖和甘露糖醇；纤维素制剂，举例来说，如淀粉、黄蓍胶、羟丙基甲基纤维素和/或聚乙烯吡咯烷酮(pvp)及其衍生物。如果需要，可以加入崩解剂，如淀粉、交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐如海藻酸钠。这样的组合物可以通过任何一种制药方法来制备，但所有方法都包括使6-tg与构成一种或多种必需成分的载体联合的步骤。一般而言，本发明的药物组合物可以以本身是已知的方式制备，例如通过常规混合、溶解、制粒、糖衣丸制作、乳化、包封、包裹(entrapping)或冻干工艺。糖衣丸核提供有合适的包衣。为此目的，可以使用浓糖溶液，其可以任选地含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液以及合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以将染料或色素加入片剂或糖衣丸包衣中用于标识或表征活性化合物剂量的不同组合。
口服制剂可以在由明胶制成的推入配合胶囊(push-fitcapsule)中施用，以及在由明胶和增塑剂(如甘油或山梨糖醇)制成的软密封胶囊中施用。推入配合胶囊可含有与填充剂(如乳糖)、粘合剂(如淀粉)和/或润滑剂(如滑石或硬脂酸镁)以及任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性化合物可以溶解或悬浮在合适的液体中。另外，可以加入稳定剂。
灌肠剂制剂
在一些方面和实施方案中，本发明的组合物被配制用于作为灌肠剂施用。
本发明提供包含6-tg的灌肠剂制剂的组合物。还提供了用于治疗有需要的个体的对6-tg有响应的远端肠(优选远端结肠)的炎症性疾病或状况的方法，该方法包括向个体施用包含6-tg的本发明的灌肠剂组合物。
在一些实施方案中，灌肠剂制剂包含6-tg和至少一种药学上可接受的赋形剂。
用于灌肠施用的6-tg组合物可以被配制成例如溶液或混悬液。
在一些实施方案中，6-tg灌肠剂组合物是溶液。在一些实施方案中，灌肠剂组合物包含1mg/100ml至100mg/100ml的6-tg。在一个实施方案中，6-tg组合物是包含约10mg/100ml至100mg/100ml的6-tg(例如10mg/100ml至30mg/100ml；例如约20mg/ml6-tg)的溶液。在另一个实施方案中，6-tg组合物是包含70mg/100ml至90mg/100ml6-tg(例如约80mg/100ml6-tg)的溶液。
在一些实施方案中，6-tg灌肠剂组合物是混悬液。在一些实施方案中，灌肠剂混悬液组合物包含10至100mg/100ml的6-tg。在另一个实施方案中，6-tg组合物是包含10至30mg/100ml的6-tg(例如约20mg/ml的6-tg)的混悬液。在另一个实施方案中，6-tg组合物是包含70至90mg/100ml6-tg(例如约80mg/ml6-tg)的混悬液。
在一些实施方案中，灌肠剂组合物作为每日单位剂量施用。在一些实施方案中，每日灌肠剂剂量为2mg至200mg，优选5mg至50mg。在一些实施方案中，每日灌肠剂剂量为0.04至4mg/kg，优选0.1至1mg/kg。在一些实施方案中，100ml灌肠剂制剂包含2至200mg％，优选5至50mg％。在一些其他实施方案中，60ml灌肠剂制剂包含3.3至330mg％，优选8.3至830mg％。
灌肠剂制剂可以通过本领域已知的技术制备。用于灌肠剂制剂的合适的赋形剂、稀释剂和/或载体是本领域已知的，并且包括溶剂、增溶剂、ph调节剂、稳定剂和粘度调节剂。稀释剂和/或载体的实例包括水、丙二醇和丙二醇水溶液。
在一些实施方案中，溶液灌肠剂制剂包含6-tg和一种或多种增溶剂。增溶剂的实例包括氢氧化钠和甲基-β-环糊精(me-β-cd)。在一个具体实施方案中，溶液灌肠剂制剂包含6-tg、氢氧化钠和甲基-β-环糊精。在一些实施方案中，溶液灌肠剂包含量高达0.4％w/v的甲基-β-环糊精。在一些实施方案中，甲基-β-环糊精与6-tg的比率为8:1至16:1。
在优选的实施方案中，灌肠剂制剂还包含一种或多种防腐剂。防腐剂的实例包括苯扎氯铵和乙二胺四乙酸二钠(edta)。
口服缓释制剂
本发明提供了包含6-tg的缓释口服制剂的组合物。还提供了用于治疗有需要的个体的对6-tg有响应的疾病或状况的方法，该方法包括向个体施用包含6-tg的缓释制剂的本发明的口服组合物。
本发明提供配制用于口服施用的药物组合物，其包含6-tg和药学上可接受的载体，其中该组合物被配制成在口服施用12小时后以高达1mg/小时的速率释放6-tg。
还提供了包含6-tg的药物组合物，其中该组合物为适合用于口服施用的形式，优选片剂，并且包含与6-tg混合的药学上可接受的载体，对所述药学上可接受的载体进行选择以在从口服施用后12小时延伸直至24至36小时之间的时间段内以0.2mg/小时直至1mg/小时的速率提供6-tg的缓释。
如本文所用，术语“缓释制剂”是指在延长的时间段内逐渐转化或降解或代谢、释放成其含有的前药、药物或活性组分(例如6-tg)或者提供其含有的前药、药物或活性组分(例如6-tg)的来源的制剂。
在一些实施方案中，缓释制剂以0.2mg/小时以上；例如0.2mg/小时至5mg/小时；0.2mg/小时至4mg/小时；0.2mg/小时至3mg/小时；0.2mg/小时至2.5mg/小时；0.2mg/小时至2mg/小时；或0.2mg/小时至1mg/小时的释放速率远端肠中提供6-tg的释放。优选地，6-tg基本上是在结肠中释放。在一些实施方案中，释放速率为12至24小时、12至36小时或12至48小时，或从12小时直到制剂从肠中排出。在一些实施方案中，释放速率从8或10小时起。在一些实施方案中，释放速率为0.2-0.4mg/小时；0.2-0.6mg/小时；0.25-0.4mg/小时；0.4-0.6mg/小时；0.4-0.8mg/小时；或者大约0.5mg/小时。在一些实施方案中，口服施用后大约12小时开始从缓释制剂释放6-tg。在一些实施方案中，在肠溶包衣溶出后开始6-tg缓释。在一些实施方案中，12小时后释放至少45％的6-tg。在一些实施方案中，口服施用12小时后，在结肠中释放至少45％的6-tg。在一些实施方案中，口服施用后大约10-12小时开始从缓释制剂释放6-tg。
在优选的实施方案中，缓释制剂提供了6-tg释放的近似零级动力学(即相对于缓释时间的线性递送)。适合地，缓释制剂在口服施用后大约12小时提供6-tg释放的基本上零级动力学。适合地，缓释制剂在口服施用后大约12小时提供6-tg释放的基本上零级动力学，其中基本上零级释放维持至少另外12小时，或至少另外18或24小时。将理解，该时间终点可以是制剂残留物从肠中排出的时间。在一些实施方案中，适合地，缓释制剂在口服制剂离开胃之后提供变时性释放。
适合地，本发明的缓释口服制剂被配制，以将6-tg释放或提供至远端肠，优选结肠。在例证性实施方案中，该制剂在从约12小时延伸至48小时的时间段内或其间的任何时间段内将6-tg释放或提供至远端肠。在例证性实施方案中，时间段是从12小时至18小时；或从12小时至24小时；或从12小时至36小时。
在一些实施方案中，口服制剂在远端肠(优选结肠)中提供总6-tg的至少45％的6-tg释放。在一些实施方案中，口服制剂在远端肠(优选结肠)中提供总6-tg的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的6-tg释放。在一些实施方案中，口服制剂在远端肠中并优选在结肠中提供总6-tg的至少35％的6-tg释放。
在一些实施方案中，口服制剂在施用12小时后提供大于0.2mg/小时的6-tg释放。
在一些实施方案中，口服制剂在施用12至48小时后提供总6-tg的至少45％的6-tg释放。
在一些实施方案中，口服制剂在施用12至48小时后以约0.2mg/小时的速率提供总6-tg的至少45％的6-tg释放。
适合地，包含6-tg的缓释制剂的组合物包含6-tg、聚合物和足以使6-tg能够以所需释放速率释放到远端肠或结肠中的赋形剂。在一些实施方案中，口服组合物包括膜包衣或肠溶衣以防止组合物在胃中崩解。在一些实施方案中，口服组合物包括薄膜包衣或肠溶衣以减少或基本上防止6-tg在到达结肠之前释放。
缓释制剂可以包括合适的填充剂，例如乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇、碳酸钙、淀粉、糊精、环糊精、硫酸钙脱水物(或水合物)、磷酸三钙或微晶纤维素。填充剂的具体实例是乳糖、玉米淀粉和甘露糖醇。
该制剂可以包括缓释剂，其可以选自例如蜡及其衍生物、氢化蓖麻油、氢化大豆磷脂、虫胶、海藻酸钠、壳聚糖、纤维蛋白和纤维蛋白原、琼脂、角叉菜胶、瓜尔豆胶、甲基纤维素(mc)、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素(hpc)、羟丙基甲基纤维素(hpmc)、乙酸纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、邻苯二甲酸乙酸纤维素、
该制剂可以包括增溶剂或溶出剂，并且这些可以选自例如环糊精及其衍生物(例如羟丙基-β-环糊精、甲基-β-环糊精)、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、葡萄糖、甘露糖醇、木糖醇、山梨糖醇、半乳糖、蔗糖、柠檬酸、琥珀酸、聚环氧乙烷、聚乙二醇、羟基乙酸淀粉钠、泊洛沙姆、月桂基硫酸钠、胆酸钠、皂苷、二氧化硅、油、甘油三酯；表面活性剂如cremophortm、tweentm、solutolhstm、myrjtm、磷脂和spantm；以及碱性物质如无机碱(例如氢氧化钠和磷酸钠)和有机碱(例如苯甲酸钠和泛酸钠)。增溶剂的实例包括月桂基硫酸钠、甘露糖醇和羟基乙酸淀粉钠。
片剂制剂可以包括润滑剂。润滑剂可以选自例如硬脂酸镁、硬脂酸、硬脂酸钙、硬脂酸锌、聚乙二醇、滑石、月桂基硫酸钠、月桂基硫酸镁、己二酸和石蜡。润滑剂的实例包括硬脂酸镁、滑石或胶体二氧化硅。
本发明的缓释制剂可以通过本领域已知的任何合适的方法制备，包括在最新版的controlleddrugdelivery(控制药物递送)(drugsandthepharmaceuticalsciences；vol.29；marceldekker,inc)和最新版的modified-releasedrugdeliverytechnology(缓释药物递送技术)(drugsandthepharmaceuticalsciences；vol.126；marceldekker,inc)中记载的那些方法。
缓释口服制剂可以为任何合适的形式，例如片剂、胶囊剂、微丸剂、颗粒剂、膜剂和混悬液。缓释口服制剂的实例是片剂。
片剂制剂可以通过任何合适的压片方法制备，但是直接压片在可能时是特别有利和经济的，因为它涉及比其他工艺更少的加工步骤。也可以使用任何合适的技术来制备颗粒剂和微丸剂，包括湿法制粒、干法制粒和辊压。也可以使用合适的缓释剂对片剂、胶囊剂、微丸剂和颗粒剂进行包衣。在示例性实施方案中，使用湿法制粒或直接压片。适合地，使用湿法制粒技术。
本发明组合物中6-tg的缓释可以用包括崩解剂(disaggregatingagent)的制剂实现，该解聚剂在与生物流体接触时促进制剂的崩解。
6-tg也可与一种或多种聚合物混合，以提供形成颗粒(小或大)的基质或涂覆在惰性颗粒上的基质。聚合物选自亲水性、疏水性或塑性聚合物。亲水性聚合物是水溶性的并且与水接触水合时随着它们溶解并溶胀形成水凝胶；疏水性聚合物不溶解，但由于基质释放可溶性组分可能受到侵蚀；塑性聚合物形成不溶的基质或骨架基质，但不会侵蚀。当暴露于胃、小肠和结肠中的流体时，亲水性聚合物水合并形成充当药物释放屏障的水凝胶；疏水性聚合物通过扩散通过孔以及通过侵蚀释放药物。塑性基质中的药物释放受到液体渗透速率的控制，并且因通道形成剂(除6-tg之外加入的可溶性组分)的存在而加速。
通过增加聚合物与6-tg的比率并且通过增加基质的疏水性能降低6-tg释放的速率。适合地，6-tg释放速率降低以便在口服施用后实现在远端肠(优选结肠)中的释放。
一些聚合物的行为是ph依赖性的，并且这种性质可以用于实现期望的释放曲线。当聚合物含有酸性或碱性部分并且这些部分影响离子化状态时，聚合物将尤其是ph依赖性的。离子化能将聚合物从疏水性的转变为亲水性的，并伴随着释放特性的转变。
可以通过添加包衣来控制6-tg向例如胃肠(gi)道中的释放。包衣通常是对在例如gi道中遇到的条件相对稳定的聚合物或聚合物的共混物。在许多情况下，包衣包括至少一种亲水性聚合物，其在与肠道中的流体接触时会溶胀以形成水凝胶屏障，该水凝胶屏障是均匀的，并且对于可能对基质发生的变化是稳定的。水凝胶还用于减缓溶解的6-tg的释放。表面包衣的性质可以是ph依赖性的，取决于聚合物组分中酸性或碱性部分的存在。
要避免的缓释制剂的特定特征是在剂型与溶出流体接触后立即发生药物突释的潜能。在膜包衣或基质中使用亲水性聚合物(其中亲水性聚合物在水合后快速形成水凝胶)能显著降低突释现象的发生率。
缓释制剂包括其中一种或多种药物-聚合物基质提供芯的整体片剂剂型，并且任选的表面膜包衣能提供对药物释放的额外控制。这与立即释放(ir)制剂不同，所述ir制剂设计用于迅速崩解、迅速溶解并释放丸剂剂量的药物。
具体地，基质可以包含亲水性聚合物和疏水性聚合物中的任一种或两种以实现适当的释放曲线。此外，一种或多种聚合物可能在水合后以可以另外依赖于ph的方式而溶胀，以形成粘稠和凝胶状的水凝胶并因此提供药物释放的屏障。水凝胶的组成决定了它的性质，该性质因此能被操控以实现适当的药物释放动力学。
膜包衣提供了扩散释放机制，其中渗透性经常直接与导致聚合物溶胀的水合和水凝胶动力学的建立(installation)有关。
可使用多层片剂来提供缓释曲线或基本上零级释放动力学。不同的层也可以具有不同的释放曲线。
在下面的描述中提供的基质和膜包衣的至少一种组合可用于跨过在转运通过gi道的过程中遇到的不同环境中实现所需的释放曲线。适合地，该制剂在远端肠(优选结肠)中提供释放曲线。更适合地，该制剂在结肠中提供释放曲线。在一些实施方案中，释放速率在远端肠中为大约0.2mg/小时直至1mg/小时。
微粒系统通常由直径为0.05-2.00mm的球形颗粒组成，该球形颗粒被进一步包装到胶囊或片剂中。微粒剂量系统可为缓释制剂提供以下益处：(1)对胃排空的依赖性更小，导致胃转运时间的个体内/间差异性更小(小于2mm的尺寸能够连续离开胃，甚至是在幽门关闭时)；(2)颗粒分布更好，避免了局部刺激的可能性；(3)缓释制剂的药物安全性得到改善，如果受损更不易出现性能障碍。此外，可以混合具有不同释放曲线的颗粒以优化在不同肠区域的暴露。
用于形成药物-聚合物基质的聚合物如下：
(1)丙烯酸和甲基丙烯酸聚合物，包括甲基丙烯酸羟丙酯(hpma)和甲基丙烯酸羟乙酯(hema)，以及n-异丙基丙烯酰胺；
(2)聚环氧乙烷(peo，也称为聚乙二醇(peg))和聚环氧丙烷(ppo)，以及peo和ppo的嵌段共聚物(也称为
(3)纤维素醚包括羟丙基甲基纤维素(hpmc)、羟丙基纤维素(hpc)、羟乙基纤维素(hec)；
(4)聚丙交酯(pla)、聚乙交酯(pga)、各种比例的聚丙交酯和聚乙交酯的共聚物(plga)；
(5)聚(蔗糖丙烯酸酯)；
(6)聚赖氨酸、聚乙烯胺、聚乙基亚胺(pei)、聚谷氨酸、聚乙烯醇(pva)；乙烯和乙酸乙烯酯的共聚物(peva)；
(7)聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯及其共聚物(例如
(8)聚乙烯吡咯烷酮(例如
(9)天然来源的聚合物，包括非离子型、氨基、羧基化和硫酸化的多糖，任选地通过部分水解和/或改性剂(如羧酸盐或长链脂肪酸(c8-c16))缀合进行化学改性，包括瓜尔胶；阿拉伯树胶、黄蓍胶、角叉菜胶(ι和λ)、linn胶、海藻酸盐、硬葡聚糖、葡聚糖、几丁质和壳聚糖、果胶和半乳甘露聚糖，包括槐豆胶。
此外，经常发现聚合物共混物特别可用于为缓释制剂提供适当的释放曲线，例如混合具有亲水性和疏水性的聚合物，这样的聚合物共混物包括：
(1)甲基丙烯酸甲酯聚合物与淀粉或纤维素聚合物；
(2)聚丙烯酸-普朗尼克-聚丙烯酸嵌段共聚物；
(3)使用选自壳聚糖、聚赖氨酸、聚烯丙胺或聚乙烯胺的阳离子聚合物与选自
(4)疏水性纤维素聚合物(如乙基纤维素)通常与亲水性聚合物(如hpmc、nacmc、海藻酸钠、黄原胶或
(5)亲水性溶胀聚合物如hpmc与ph依赖性聚合物(如
(6)聚合物共混物可以通过共价键交联，或者特别是对于天然来源的聚合物，通过加入多价阳离子(包括硼酸盐、钙、镁、锌)交联；
(7)天然胶经常用于聚合物共混物中，特别是角叉菜胶与纤维素醚、黄原胶与槐豆胶。
在一些实施方案中，缓释口服制剂是片剂。示例性片剂包含形成药物-聚合物基质的6-tg和一种或多种聚合物粘合剂。在一些实施方案中，本发明提供包含6-tg的药物组合物，其中该组合物是片剂，并且包含与6-tg混合的选择用于提供6-tg的缓释的药学上可接受的载体。在一些实施方案中，药学上可接受的载体是聚合物粘合剂，例如羟丙基甲基纤维素。
在一些实施方案中，用于形成6-tg-聚合物基质的聚合物包括羟丙基甲基纤维素；或各种分子量和比例的丙烯酸和酯或甲基丙烯酸和酯的共聚物(例如
在一些实施方案中，片剂包含6-tg；羟丙基甲基纤维素和至少一种另外的药学上可接受的载体或赋形剂。可以选择所述另外的药学上可接受的载体或赋形剂以改变6-tg的释放速率，并且可以包括粘合剂，例如但不限于二糖如乳糖；多糖如淀粉和纤维素衍生物，例如玉米淀粉、淀粉糊；和糖醇如甘露糖醇。
在一些实施方案中，片剂包含约1mg、5mg、10mg、20mg、25mg、30mg、40mg或50mg的6-tg。
在一些实施方案中，片剂包含约20mg的6-tg。在一些实施方案中，片剂重约100mg或200mg。
可商购获得不同粘度的羟丙基甲基纤维素(hpmc)。羟丙基甲基纤维素的示例性粘度为约100,000cps；80,000至120,000cps；以及约15cps。粘度为约100,000cps的合适的hpmc是hpmck100m。粘度为约15cps的合适的hpmc是hmpck15m。
在一些实施方案中，hpmc是hpmc(粘度为80,000至120,000cps)，尤其是hpmck100m。
在一些实施方案中，hpmc(粘度为约15cps)是hpmck15m。
在一些实施方案中，片剂中6-tg化合物与hpmc的比率为1:1至8:1，例如约1:1至4:1；约2:1至4:1；约2:1至8:1或约4:1至约8:1。在一些实施方案中，6-tg与hpmc(粘度为约15cps)的比率为约1:3。
在一些实施方案中，6-tg的存在量为片剂的10至30％w/w、尤其是片芯的15至25％w/w、更尤其是片剂的约20％w/w。
在一些实施方案中，6-tg的存在量为片剂的5至15％w/w，尤其是片剂的约10％w/w。
在一些实施方案中，hpmc的存在量为片剂的2.5至30％w/w，例如片剂的2.5至20％；片剂的5至20％w/w；片剂的10至20％w/w；或片剂的5至10％w/w。在一些实施方案中，hpmc的粘度为80,000至120,000cps。在一些实施方案中，hpmc(粘度为80,000至120,000cps)的存在量为片剂的2.5至20％w/w。
在一些实施方案中，hpmc(粘度为约15cps)的存在量为片芯的10至40％w/w、例如片芯的大约30％w/w。
在一些实施方案中，片剂还包含一种或多种药学上可接受的赋形剂，如粘合剂和/或润滑剂。合适的粘合剂包括二糖如乳糖；多糖如淀粉和纤维素衍生物，例如玉米淀粉、淀粉糊；和糖醇如甘露糖醇。
在一些实施方案中，粘合剂的存在量为片剂的40至80％w/w，尤其是片剂的约45至78％w/w。
合适的润滑剂包括脂肪，如硬脂酸镁；滑石；或二氧化硅，例如火成二氧化硅。
在一些实施方案中，润滑剂的存在量为片剂的1至5％w/w，尤其是片剂的约1至4％w/w，尤其是片剂的约1至2.5％w/w。
在一些实施方案中，片剂还包括溶出或崩解赋形剂。在一些实施方案中，溶出或崩解赋形剂是例如羟基乙酸淀粉钠或月桂基硫酸钠。
在一些实施方案中，片剂是根据制剂1(t008)、制剂2(t012)、制剂3(t025)或制剂4(t038)的制剂。在一些实施方案中，片剂是制剂9(t052)的片剂。在一些实施方案中，片剂是制剂12(ec-tg052)的片剂。
肠溶包衣
任选地，任何片剂制剂可以包括肠溶包衣。肠溶包衣通过阻止在胃中释放以及通过减少或基本上防止片剂在到达远端肠之前释放6-tg来控制6-tg的释放。合适的肠溶包衣包括纤维素包衣，如邻苯二甲酸乙酸纤维素聚合物或邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素聚合物或者丙烯酸及其酯或甲基丙烯酸或其酯的共聚物，如以商标
肠溶包衣还可以包含润滑剂。肠溶包衣还可以包含增塑剂。肠溶包衣还可以包含抗粘剂。
肠溶包衣可以使用本领域已知的常规技术施加至片剂。例如，可以使用如例如在以下书籍第46章中描述的浸渍包衣或锅包衣技术来施加包衣：remington:thescienceandpracticeofpharmacy(雷明顿：药剂学科学与实践),loydv.allen,jr(ed),thepharmaceuticalpress,london,22ndedition,september2012。
根据本文提供的描述可制备本发明范围内的缓释制剂。
剂量水平
在具体实施方案中，最佳治疗方案以及因此本发明的方法包括施用以下日总剂量的6-tg：约0.1mg/kg、0.2mg/kg或0.3mg/kg体重至约2.5mg/kg体重，例如0.1mg/kg体重至2.5mg/kg体重。适合地，6-tg的日总剂量为0.1、0.2或0.3mg/kg体重至2.0mg/kg体重；0.1、0.2或0.3mg/kg体重至1.5mg/kg体重；或0.1、0.2或0.3mg/kg体重至1mg/kg体重。更适合地，6-tg的日总剂量为0.3、0.4或0.5mg/kg体重至1.0mg/kg体重，甚至更适合地，6-tg的日总剂量为约0.3、0.4或0.5mg/kg体重至约0.8mg/kg体重。适合地，该剂量作为每日一次的剂量施用。
本领域技术人员将理解，以上剂量尽管作为日剂量描述，但可以不每天施用。例如，可以每2、3、4、5、6或7天(或其他)施用日剂量为0.1mg/kg/体重至1mg/kg/体重的6-tg。在一个例证性实施方案中，接受日剂量为1mg/kg/体重的6-tg的60千克个体(例如成人)(即日剂量为60mg)可以接受60mg/天，或者可以替代为每2天接受120mg，或每3天接受180mg等等。在另一个例证性实施方案中，20千克的个体(例如儿童)可以接受相同日剂量的6-tg(1mg/kg/体重)，相当于20mg/天或40mg/2天或60mg/3天等等。
因此，在某些实施方案中，包含6-tg的本发明组合物包含0.3mg/kg体重至2.5mg/kg体重之间的6-tg。适合地，该组合物包含0.4mg/kg体重至1mg/kg体重之间的6-tg，更适合地，该组合物包含0.5mg/kg体重至1.0mg/kg体重之间的6-tg，甚至更适合地，该组合物包含0.5mg/kg体重至0.8mg/kg体重之间的6-tg。
本发明组合物中6-tg的精确剂量可取决于多种因素，如预期的施用方式、待治疗的疾病或状况、疾病或状况的进展或阶段和/或待治疗的个体，包括个体的年龄、性别、身高和/或体重。预期精确剂量可以由本领域的从业人员确定。在确定剂量时，从业人员可以评价疾病或状况的严重程度、或疾病或状况的症状的严重程度、个体的临床病史和对先前治疗的响应性，包括疾病或状况的任何先前复发史。预期不需要过多的实验就可以容易地确定剂量。
实施例
动物实验和治疗
所有的动物实验都得到了昆士兰大学动物伦理委员会的批准。c57bl/6野生型(wt)小鼠购自西澳大利亚动物资源管理局(animalresourceauthority，westernaustralia)，hprt-/-、winnie和raw在内部无病原体动物设施中饲养。雄性和/或雌性小鼠每天胃内强饲溶媒对照或硫嘌呤药物(6-tg或6-mp)持续14至28天之间的时间段。6-tg或6-mp也直肠内施用于winnie小鼠。将6-tg(mw167，来自sigma-aldrich)制备成在水中的混悬液并在施用前充分混合。将6-mp(mw170，6-mp一水合物，来自sigma-aldrich)溶于水中。溶媒对照为水。
长期施用在饮用水中的葡聚糖硫酸钠(dss)(36-50kda；mpbiochemicals)[0.5％(w/v)，持续4个5天周期，然后休息7天或9天]。组织学结肠炎评分
如c.k.heazlewoodetal.,plosmedicine5,e54(2008)中所述，在对小鼠基因型和治疗设盲的情况下对自发性结肠炎和dss诱导的结肠炎进行组织学评估。对于winnie和raw小鼠，这是基于炎症浸润的程度、中性粒细胞的数量、杯状细胞缺失、隐窝结构、脓肿和长度、组织损伤；对于dss诱导的结肠炎，组织学分数是基于组织损伤和炎症的程度和范围。
腹泻分数
在实验持续期间每天由知情的多个记分员对自发性结肠炎和dss诱导的结肠炎进行腹泻评分。在winnie和wtdss实验中，腹泻评分与直肠出血分数结合(综合腹泻分数(combineddiarrhoeascore))。腹泻分数的范围为0到3分，0分为没有腹泻，3分为明显的腹泻；直肠出血的范围为0到3分，0分为没有出血，3分为明显的直肠出血。对于hprt-/-小鼠的dss诱导的结肠炎，使用综合疾病活动指数(dai)分数，并且这包括腹泻、直肠出血和体重减轻百分比子分数(0分为<1％减轻；1分＝1-5％减轻；2分＝5-15％减轻；3分为>15％减轻)。
facs分析
在剔除点处，收集免疫器官并将其转移到冰冷的培养基中，并通过用注射器的柱塞压入到40μm无菌细胞过滤器(bdfalcon)中，对它们进行收集并分开得到单细胞悬浮液。在染色之前，将细胞与1:200的抗-cd16/cd32(来自ebioscience的fc阻断剂)在冰上预孵育5-10分钟。在洗涤并除去含有fc阻断剂的上清液后，将细胞重悬浮于包含以下抗体的混合物(cocktailmix)中：cd11c、mhcii、cd11b、cd3e、cd4、cd69、cd8和cd19(bd-pharmingen，澳大利亚)。使用7aad以排除碎片和坏死细胞，并在percp-cy5-5通道中读取。在lsrii(bdbiosciences)上进行流式细胞术分析，并使用flowjo软件对数据进行分析。
6-tgn测量
对于使用细菌(大肠杆菌pc1101、粪肠球菌atcc19433和多形拟杆菌amc0002)的体外实验，通过将细胞内6-tgn转化为tgr，按照6-tg核糖苷(6-tgr)测量在3×洗涤细菌沉淀中的6-tgn。这是通过在37℃下酸性磷酸酶(sigma)孵育细胞超声物30分钟而实现的。通过使用altimahpc18柱的hplc-uv来测量tgr。在小鼠样品中，使用改良的dervieux方法(dervieuxt.等人,clinicalchemistry,2074-2084(2005))来通过lc-ms/ms(与api3200串联质谱仪偶联的shimadzulc20hplc系统)测量tgn。在组织均质化后，加入35％高氯酸和dtt100mg/ml，并将样品在4℃下以3500g离心60s。将上清液分成两份等体积的等分试样；将这些等分试样中的一个在100℃下煮沸60分钟。通过从煮沸样品(其中所有的6-tgn被还原为6-tg)中减去未煮沸样品中6-tg的量来进行6-tgn的定量。
细胞培养
从atcc获得hela、hct116、ht29、hepg2和raw细胞，并在补充有glutamax(lifetechnologies)、10％胎牛血清和20μg/ml青霉素/链霉素的dmem中生长。以前已经描述了稳定表达lc3-gfp的hela细胞(kabeyay等人,theembojournal,2000,19(2),5720-5728；birminghamcl等人,j.biol.chem.,2006,281(16),111374-11383)。在用胰蛋白酶解离后，从耳打孔样品产生从wt和hprt-/-小鼠分离的原代成纤维细胞，并在补充有glutamax和含抗生素的20％胎牛血清的dmem中培养并传代多至4次以确保它们是无混杂的。
本体(bulk)自噬检测/蛋白质印迹
为了测量自噬诱导，将细胞系在70％融合下铺板并在加入或不加入10μg/ml的e64d–胃酶抑素a(sigma)的情况下用6-tg10、50和100μm处理指定的时间或用dmso0.1％模拟处理。处理后，用tnn(tris-hcl，nacl，np40)裂解缓冲液处理细胞。均衡蛋白质的量并在4-12％nupagebistris凝胶(invitrogen)上进行sds-page电泳后进行蛋白质印迹以证明lc3脂化。转移至pvdf膜(invitrogen)后，使用兔抗lc3一抗(sigma)、小鼠抗肌动蛋白(sigma)和适当的荧光二抗(li-corbiosciences)进行检测并在licor荧光成像系统上成像。
抗菌自噬检测
如poppe,d.等人,j.immunol.176,640-651(2006)中所述进行hela细胞的鼠伤寒沙门氏菌(s.typhimurium)感染和庆大霉素保护试验。简单地说，将hela细胞在感染前24小时以每孔1x105个细胞的密度铺板在含有18mm玻璃盖玻片的12孔板中，于dmem中。在感染前将细胞用tg处理或用dmso模拟处理16小时。携带dsred2表达质粒的肠道沙门氏菌鼠伤寒血清型sl1344(s.entericaserovartyphimuriumsl1344)在含有100μg/ml羧苄青霉素的luria-bertani肉汤中在37℃、通气条件下生长过夜，并在luria-bertani羧苄青霉素肉汤中在1/33的稀释度下继代培养另外3小时。将该培养物在不含抗生素的dmem10％血清中进一步稀释以产生100的感染复数(moi)并将其加入到helalc3-gfp细胞中。使感染进行20分钟，并将细胞在含有100μg/ml硫酸庆大霉素的完全培养基中洗涤一次，然后在新鲜的高浓度的庆霉素培养基中孵育另外40分钟。将细胞在pbs中洗涤两次之后进行甲醇固定/透化、用hoechst33342(invitrogen)进行核复染并用prolonggold(invitrogen)进行装载(mounting)。用60x镜头(olympus)在宽视野的荧光照明下观察载玻片进行计数。在随机选择的视野中评估每个细胞lc3-gfp-阳性细菌的比例，每种条件计数至少90个细胞。只有当完全和紧密相符的lc3-gfp“胶囊”可见时，才将细菌评分为在自噬体内。
细菌复制检测
通过使用含有xen33的生物发光鼠伤寒沙门氏菌(perkin-elmer)进行hela细胞中的庆大霉素保护复制检测。如上在96孔板中使hela细胞感染，40分钟后用pbs洗涤细胞两次，然后将含有20μg/ml庆大霉素的培养基加入孔中。在12小时时读板。
统计与分析
对非参数数据使用mann-whitney，这些数据被绘制为箱须图，具有中位数、四分位数和范围。对于时间和剂量相关的实验，通过双因素anova并用bonferroni检验后校正来评估显著性。结果显著性用*显示以表示相比于wttg0mg/kg的检验，用#显示以表示相比于hprt-/-、winnie和rawtg0mg/kg的检验。统计：*或#或&：p<0.05，**或##或&&：p<0.01，***或###或&&&：p<0.001*。
实施例1
高剂量6-tg在14天内改善溃疡性结肠炎winnie模型的自发性结肠炎
winnie小鼠发展出类似溃疡性结肠炎的自发性结肠炎，其到4周龄时出现。启动因素是由于muc2的d3结构域中的单核苷酸多态性导致的杯状细胞粘蛋白产生中的缺陷，其导致粘蛋白分泌细胞中的蛋白质错误折叠和内质网(er)应激，导致th17优势结肠炎(th17predominantcolitis)。
每天对幼年winnie和野生型c57bl/6(wt)对照小鼠强饲溶媒对照或浓度为0.5、1或2.5mg/kg的6-tg长达14天。图2a显示6-tg1-2.5mg/kg以剂量依赖性方式改善自发性结肠炎。在winnie小鼠的远端结肠(dc)中，结肠炎及其治疗改善[图2a和2(b)]都更明显。这证明了6-tg在自发性结肠炎的winnie小鼠模型中的起效速度和功效。
实施例2
在28天内施用临床相关低剂量的6-tg(但6-mp不)改善winnie的自发性结肠炎以及wt小鼠的慢性dss诱导的结肠炎
每天对winnie小鼠强饲6-tg(0.5mg/kg/d)或6-mp(2.5mg/kg/d)，持续28天。6-tg倾向于减少外周血白细胞[p＝0.09，图3a]，但6-mp则无该倾向。就综合腹泻(综合腹泻和直肠出血)分数而言，在28天内用6-tg治疗的winnie小鼠得到改善，但用6-mp治疗则没有得到改善[图3b]，但是结肠体重/长度比没有变化。6-tg改善了pc和dc二者的设盲组织学结肠炎分数[图3c]。
低剂量6-tg还改善了慢性结肠炎，其在c57bl/6wt中通过施用在饮用水中的0.5％dss诱导4个周期。从第25天起每天对这些小鼠强饲6-tg0.5mg/kg总共持续28天(最后2个工作-休息dss周期)。6-tg治疗与dss治疗和未治疗的wt小鼠的外周血白细胞减少相关[图3d]。6-tg显著改善了综合腹泻分数[图3e]和结肠重量[图3f]。6-tg还改善了dss结肠炎，如总结肠炎分数[图3g]以及免疫和上皮损伤子分数所证明的。
虽然治疗改善了综合腹泻分数[图3g]，但疾病活动指数(dai)-体重减轻％、腹泻和直肠出血分数的综合分数-没有显著改变，因为6-tg治疗不论有无dss，与幼年c57bl/6wt小鼠的预期体重增加的减少相关。结肠重量/长度比也没有得到改善。
结果证明就改善wt小鼠的由dss诱导的结肠炎的起效速度和功效而言，6-tg在小鼠模型中比6-mp更快地起作用。
实施例3
6-tg具有独立于t淋巴细胞的治疗作用
t淋巴细胞和b淋巴细胞对于winnie小鼠发生自发性结肠炎不是必需的。winniexrag-/-(raw)小鼠是缺乏t淋巴细胞和b淋巴细胞的winnie小鼠。raw小鼠自发发展出具有比winnie更近端的疾病的结肠炎表型[eri,rdetal；mucosal.immunol.4,354-364(2011)]。
在使用winnie和raw小鼠品系的实验中，长达14天的6-tg2.5mg/kg施用改善了结肠重量/长度比，改善了设盲组织学pc和dc结肠炎分数[图4a]，并在raw和winnie小鼠中均恢复了杯状细胞的形态[图4b]。6-tg治疗还与raw小鼠和winnie对照的pc和dc中的炎症减少(改善的ifn-γ、il-1b)和muc2表达增加相关。
这些数据表明，6-tg不仅可以通过适应性t淋巴细胞介导的免疫应答而且还可以通过先天免疫来改善结肠炎，因为淋巴细胞对于结肠炎或6-tg治疗不是必不可少的。
实施例4
低剂量6-tg改善hprt-/-小鼠的慢性dss诱导的结肠炎
hprt-/-小鼠允许0.5％dss(诱导肠炎症)或任意饮水，并且从第28天至第52天通过口服强饲施用0.5mg/kg的6-tg。根据疾病活动指数(dai)评估肠炎症的临床结果。
结果在图5a-5g中显示，并且证明了在其中用dss诱导结肠炎的hprt-/-小鼠中疾病活动快速且可察觉地降低。
6-tg的作用需要6-tg代谢为6-tgtp。因为6-tg的代谢需要次黄嘌呤(鸟嘌呤)磷酸核糖基转移酶(hprt)酶，所以假设6-tg不改善hprt-/-小鼠的慢性dss结肠炎。出乎意料的是，在hprt-/-小鼠的dss诱导的结肠炎中，6-tg治疗与所有结果测量值的改善相关：体重分数、包括腹泻、体重变化和直肠出血分数的疾病活动指数(dai)、结肠重量/长度比[图5a-5c]、不同结肠段的结肠重量和组织学结肠炎分数[图5d]。代表性的h&e组织学显示具有完整杯状细胞的更正常的上皮细胞[图5e]。因为免疫抑制与全身性6-tgtp的产生有关，所以6-tg治疗与hprt-/-小鼠的免疫抑制不相关[图5e]。此外，hprt-/-小鼠的mln细胞计数预期被与结肠炎相关的dss增加，但不被6-tg抑制[图5f]。图5g显示在未处理的或dss暴露的hprt-/-小鼠中，mln中的cd3e+cd4+、cd11b+和cd11c+mhcii+子集数目不因6-tg施用而降低。
这些数据表明，6-tg在改善hprt-/-小鼠的慢性dss结肠炎中的治疗作用不需要宿主产生6-tgtp并且与全身免疫抑制不相关。
进一步注意到，微生物组被6-tg略微改变以产生较少的致结肠炎的微生物组。
实施例5
直肠内6-tg在14天内改善自发性结肠炎
winnie小鼠每天用直肠内6-tg1mg/kg或6-mp1mg/kg治疗。在直肠内处理14天后白细胞计数没有显著差异，6-tg的平均白细胞计数(sd)为8.7(1.4)，6-mp的平均白细胞计数(sd)为12.3(1.5)，对照的平均白细胞计数(sd)为11.0(1.5)。与6-mp和溶媒对照治疗相比，6-tg-治疗的小鼠从第11天起具有统计学显著改善的综合腹泻分数[参见图6a]和结肠重量/长度比[图6b]。远端结肠的设盲组织学评分证实采用6-tg在远端结肠的显著改善，但采用6-mp则无这种显著改善(参见图6c，p<0.01)。中段结肠或近端结肠中的结肠炎没有改善，表明对结肠炎的有益作用是局部的[图6c]。
实施例6
细菌将6-tg但将较少的6-mp转化为硫鸟嘌呤核苷酸(6-tgn)
在hprt-/-小鼠中已显示6-tg在完全不存在全身性免疫抑制的情况下改善了结肠炎，研究宿主的微生物代谢是否可以产生6-tgtp。
使用代表性肠细菌大肠杆菌、粪肠球菌和多形拟杆菌在体外研究6-tg的细菌代谢。在将所有三种细菌菌株的对数期培养物与1mm6-tg孵育120分钟后，在细菌沉淀中发现6-tgn(6-tgmp、6-tgdp和6-tgtp)[图6d]。相比之下，当培养物与1mm6-mp孵育时，在这段时间内6-tgn的产生最少。当来源于hprt-/-的粪便浆与5或10μm6-tg孵育6h时[图6f]，通过lc-ms/ms(图6e)也检测到6-tgn。这些数据表明实验室和肠细菌能够将6-tg代谢成活性6-tgn代谢物。
当每天对wt和hprt-/-小鼠强饲6-tg5mg/kg持续10天时，在这两种品种的粪便和wt的肝脏中发现6-tgn，但在hprt-/-小鼠的肝脏中未发现6-tgn[图6g]。因此，6-tg在hprt-/-小鼠中的治疗作用可能来自于细菌hprt转化6-tg为6-tgtp，其中细菌局部产生6-tgtp可以足以改善结肠炎。
实施例7
6-tg以6-tgn依赖性方式增强体外自噬
基于在用6-tg治疗的dsshprt-/-小鼠的结肠炎的改善以及上皮健康的增加、在hprt-/-小鼠中缺乏结肠外抗炎作用以及在winnie小鼠中对直肠内6-tg的快速响应，研究了6-tg或6-tgtp对细菌-上皮相互作用的影响。上皮细胞依靠自噬来对肠腔细菌作出响应并维持稳态，并且肠中的抗菌自噬受损已被假设为是ibd的一个促成因素。
通过监测lc3i向lc3ii的转化来研究6-tg对本体自噬的影响。在有或没有胃酶抑素a和e64d(pe)的情况下将hela细胞与溶媒对照或6-tg10和100μm孵育16小时以检查自噬潮。6-tg处理增加lc3ii与lc3i的比率[图7a]，表明自噬体积聚增加。用阻断自噬体成熟以及将lc3ii循环回lc3i的pe治疗进一步增强了该作用，表明6-tg的作用是由于自噬潮的增加引起的而不是由于抑制成熟引起的。在人肠上皮细胞系(ht29、hct116)和肝细胞(hepg2)[图7b]中以及还在鼠raw巨噬细胞样细胞[图7c]中也观察到这种作用。为了确定6-tg治疗对细胞内细菌处理是否有影响，研究了已知对抗菌自噬的作用敏感的沙门氏菌细胞内复制模型。用溶媒对照或6-tg预处理hela细胞并用生物发光鼠伤寒沙门氏菌(sl1344)感染并通过测量发光来监测复制。用50或100μm6-tg处理显著降低细菌的细胞内复制[图7d]。在表达lc3-gfp的hela细胞中在用6-tg50μm处理或不处理的情况下，通过荧光显微镜法进一步定量细胞的自噬体包封。该剂量的6-tg与对照相比显著增加lc3与细胞内细菌的共定位，与增加的抗菌自噬一致[图7e]。
为了区分6-tg或6-tgtp的效应，将自wt和hprt-/-小鼠分离的原代成纤维细胞与溶媒对照或6-tg50μm孵育16小时。在成纤维细胞中观察到最少的lc3-i，但在6-tg处理的wt来源的成纤维细胞中lc3-ii与β-肌动蛋白的比率显著增加，与诱导自噬一致，但是在缺乏hprt时没有作用[图7f]，尽管可以通过mtor抑制剂torin1在hprt-/-成纤维细胞中诱导自噬。这些数据一起表明6-tg处理上皮细胞以6-tgtp依赖性方式诱导自噬，并且很可能通过诱导抗菌自噬来改善细胞内细菌生长的限制。
6-tg改善结肠炎的作用是快速的，作用快速程度是出乎意料的。在winnie小鼠中口服和直肠内tg治疗的药效学效应少于两周，如通过用6-tg1或2.5mg/kg/天改善的结肠组织学(图2a-2c)、用低剂量6-tg治疗的wt和hprt-/-小鼠的dss诱导的结肠炎的快速症状改善(图2a-2c、图5a-5b)以及采用直肠内tg的winnie小鼠的快速症状和组织学改善(图6a-6g)所显示的。
药代动力学差异不能很好地解释6-tg但不是6-mp在鼠结肠炎实验中的药效动力学效应的快速性。硫唑嘌呤在ibd中的静脉内负荷量不影响其治疗作用起效的时间。在口服mp治疗约4周时，外周血中的6-tgn达到稳态，这在其药效学作用之前是良好的。6-tg更快速地影响6-tgn-稳态，这很可能是因为6-tg向活性药物的转化过程不受impdh的速率限制。
不受理论的束缚，据信在小鼠模型中强饲6-tg的药效学效应的快速性是由于到达小鼠模型中发炎的远端肠的6-tg增强粘膜屏障功能以及增强先天免疫功能的局部作用。这得到采用直肠内6-tg结肠炎的快速局部改善的支持。据报道，小鼠的胃-肛门转运时间峰值为小于7小时，并在粪便中证明了强饲的6-tg[图(6c)]。在体外，6-tg也改善了细菌的本体自噬处理(图7)。6-tg在上皮细胞系和巨噬细胞系以及原代成纤维细胞中都相对快速地诱导自噬潮，并且通过增加抗细菌自噬增加了细胞内细菌复制的限制(图7a-7f)。该效应是由于6-tgn(或相关的代谢物)引起的，因为这种效应是hprt依赖性的(图7f)。这些数据，即6-tg-增强的杀菌功能、6-tg对白细胞亚群的作用以及用6-tg对raw鼠结肠炎的改善与最近的报道一致，所述最近的报道显示rac1抑制可以促进固有免疫力(参见parikhk,zhoul,somasundaramr等人.suppressionofp21racsignalingandincreasedinnateimmunitymediateremissionincrohn'sdisease.scitranslmed2014；6:233-53)。与采用6-tgn的循环效应器淋巴细胞的负荷量相比，经由通过粘膜或微生物hprt局部转化6-tg至细胞内粘膜硫代gtp(thiogtp)而增强的上皮屏障和先天免疫功能，可以更快速地诱导ibd的缓解。这对克罗恩病和溃疡性结肠炎的治疗可能都具有临床相关性。
6-tg作用在图12和图13中总结。参照图13，进入门脉循环的6-tg在首过循环时被肠粘膜和肝脏代谢为具有骨髓抑制作用的6-tgn，导致活化的循环t淋巴细胞和b淋巴细胞减少以及髓细胞数量减少。参照图14，到达结肠腔的6-tg对粘膜细菌具有轻微的生物学作用，并且被微生物群代谢为尤其是6-tgn，因此证明了微生物组将前药转化为活性药物治疗。粘膜相关细菌在ibd的炎症部位增加，并且粘膜屏障完整性降低，促进了细菌易位增加。因此，6-tgn可以经由肠粘膜局部代谢6-tg或者经由细菌的6-tgn和负荷6-tgn的细菌的自噬在发炎的远端肠粘膜积聚。6-tgn增加的自噬将导致细菌处理的快速改善、免疫激活减少、肠炎症减少和潜在改善的分泌功能以及粘液层的恢复。与6-mp或硫唑嘌呤不同，宿主或细菌将6-tg转化成活性药物的速率不受impdh限制。将6-tg局部递送到ibd的肠炎症部位相对于目前的口服免疫调节疗法具有临床显著优势。具体地说，6-tg的局部递送可以允许更快速的ibd治疗作用，而不需要循环cd4+t淋巴细胞或肝脏转化为活性药物，这也将避免不想要的对肝脏或造血作用的不良作用。
实施例8
6-tg组合物的制备
试剂
milliq纯化水、甲醇(hplc级)、丙-2-醇(异丙醇)、丙二醇(pg)、氢氧化钠(naoh)、苯扎氯铵(bkc)、乙二胺四乙酸二钠(edta)、盐酸(hcl)、正磷酸二氢钾(kh2po4)、和磷酸三钠(na3po4.12h2o)、玉米淀粉、滑石、喷雾干燥乳糖、硬脂酸镁、甘露糖醇、羟基乙酸淀粉钠和甲基-β-环糊精(me-β-cd)很容易从商业来源获得。
6-tg可从sigmaaldrich或uniwisehangzhou商购获得。
羟丙基甲基纤维素hpmck100mtm和hpmck15mtm的粘度分别为约约100,000cps和约15cps。它们可从例如sigmaaldirch或colorcon商购获得。
aerosiltm(火成二氧化硅)可从evonikindustries获得。
除非在本文中描述，否则使用本领域公知的标准程序来制备标准溶液。
10％丙二醇溶液(pg溶液)通过称量10g丙二醇(pg)到100ml容量瓶中来制备，并使用milliq水补足体积。
ph7.5的缓冲液通过将75ml的0.1nhcl加入到20ml的0.2m磷酸三钠缓冲液中来制备。使用2nhcl和/或2nnaoh将ph调节至7.5。
0.02mkh2po4通过将2.72gmkh2po4溶解于900mlmilliq水中来制备。将ph调节至3.5，体积补足至1000ml。使用0.22μm过滤器过滤该溶液。
色谱设备和条件
设备：agilenthplc系统
hplcagilent1260infinity系统控制器
hewlettpackard1100系列自动采样器和进样器
hewlettpackard1100系列泵
hewlettpackard1100系列uv检测器
柱：phenomenexsynergi4μhydro-rp，80a，250x3.00mm
流动相：在0.02mkh2po4(ph调节至3.5)中的10％甲醇
流速：0.8ml/min
进样体积：20μl
uv检测器波长：341nm
保留时间：大约4.7±0.1min。
6-tg灌肠剂制剂
标准曲线的制作和测定方法
储备液：准确称量10mg6-tg和68mg甲基-β-环糊精(me-β-cd)并溶于2nnaoh溶液中。将该溶液搅拌过夜以获得干燥的粉末。将50mlpg溶液加入到该干燥的粉末中，并使用2nhcl和0.1nnaoh将ph调节至7.6。
标准储备液1：量取5ml储备液(相当于1mg6-tg)置于10ml容量瓶中，并使用0.1nnaoh补足体积以获得100μg/ml溶液。
标准储备液2：量取2.5ml标准储备液1置于25ml容量瓶中，并使用ph7.5缓冲液补足体积，得到10μg/ml溶液。
储备液的连续稀释：量取1、2、4、6和8ml储备液3，并使用ph7.5缓冲液补足至10ml以获得1、2、4、6和8μg/ml溶液。将标准溶液(1-10μg/ml)进样到hplc以获得标准曲线。
在1-10μg/ml范围内在ph7.5中制作的标准曲线呈线性曲线，方程为y＝125.08x-90.49，回归系数(r2)值为0.9967。
对20mg/100ml6-tg溶液和混悬液的药物测定方法：
量取5ml的6-tg溶液/混悬液(相当于1mg6-tg)置于10ml容量瓶中，使用0.1nnaoh补足体积，并超声处理10分钟。量取1ml溶液并使用ph7.5缓冲液补足至10ml以获得10μg/ml溶液，使用0.22μm过滤器过滤该溶液并进样至hplc以测定药物浓度。
对80mg/100ml6-tg溶液和混悬液的药物测定方法：
量取1.25ml的6-tg溶液/混悬液(相当于1mg6-tg)置于5ml容量瓶中，使用0.1nnaoh补足体积，并超声处理10分钟。量取0.5ml溶液并使用ph7.5缓冲液补足至10ml以获得10μg/ml溶液，使用0.22μm过滤器过滤该溶液并进样至hplc以测定药物浓度。
6-tg溶液灌肠剂的制备
6-tg具有较差的水溶性，仅能自由地溶于碱性氢氧化物的稀溶液中。使用环糊精的常规制剂方法导致具有6-tg沉淀的浑浊溶液。为了克服这个问题，将甲基-β-cd和6-tg溶解在2nnaoh溶液中以获得澄清溶液。然后将该溶液在50℃下蒸发过夜以形成干粉形式的甲基-β-cd和6-tg的复合物。重构这种粉末得到澄清溶液。
6-tg溶液
制备两种强度的灌肠剂溶液–20mg/100ml和80mg/100ml。
表1.6-tg20mg100ml溶液的配制
表2.6-tg80mg/100ml溶液的配制
6-tg溶液的制备方法
使用如上所述的甲基-β-环糊精(me-β-cd)作为增溶剂的络合技术制备6-tg溶液。制备这两种强度的6-tg溶液的方法如下：
a)在250ml玻璃烧杯中称量6-tg和me-β-cd。
b)将足量的2nnaoh加入到步骤a的混合物中以获得澄清溶液。记录所需的2nnaoh的重量。
c)将从步骤b获得的溶液在50℃下搅拌过夜，得到干粉络合物。
d)将90mlpg溶液加入到该干络合物中以得到澄清溶液。将bkc和edta加入到该溶液中并使用naoh/hcl将ph调节至7.7。
e)在100ml容量瓶中使用pg溶液将体积补足至100ml。
6-tg灌肠剂混悬液
制备两种强度的灌肠剂混悬液–20mg/100ml和80mg/100ml。
表3.6-tg20mg/100ml混悬液的配制
表4.6-tg80mg/100ml混悬液的配制
制备方法
制备这两种强度的6-tg灌肠剂混悬液的方法如下：
a)将6-tg精确称重并加入到含有90mlpg溶液的250ml玻璃烧杯中。
b)在搅拌下将bkc和edta加入到步骤a的混合物中。
c)使用naoh/hcl将ph调节至7.7，并将混悬液搅拌过夜。
d)在100ml容量瓶中使用pg溶液将体积补足至100ml。
分析6-tg灌肠剂溶液和混悬液的物理外观、ph、可重悬性和测定(按照上文标准曲线的制作和测定方法所述的方法)。将6-tg溶液和混悬液(20mg/100ml和80mg/100ml)置于40℃/75％rh条件下进行加速稳定性研究。如下在表5中列出了6-tg溶液和混悬液(20mg/100ml和80mg/100ml)的稳定性数据：
表5.6-tg溶液和混悬液的稳定性数据
稳定性数据显示，在加速条件下6个月结束时，与这两种强度(20mg/100ml和80mg/100ml)的溶液相比，混悬液显示出良好的收率。
6-tg缓释片剂
标准曲线的制作和测定方法
uv分析：
储备液：将6-tg(20mg)转移至10ml容量瓶并溶解于4ml2nnaoh溶液中。使用ph7.5缓冲液补足体积。
标准储备液1：量取2.5ml储备液置于10ml容量瓶中，并使用ph7.5缓冲液补足体积以获得500μg/ml溶液。
标准储备液2：量取1ml储备液置于10ml容量瓶中，并使用ph7.5缓冲液补足体积以获得50μg/ml溶液。
标准储备液3：量取5ml储备液置于25ml容量瓶中，并使用ph7.5缓冲液补足体积以获得10μg/ml溶液。
标准储备液3的连续稀释：量取1、2、3、4、6和8ml的标准储备液3并使用ph7.5缓冲液补足至10ml以获得1、2、3、4、6和8μg/ml溶液。在uv-vis光谱仪上分析标准溶液(1-8μg/ml)以获得标准曲线。
在1-8μg/ml范围内在ph7.5中制备的标准曲线呈线性曲线，方程为y＝0.1182x-0.0063，回归系数(r2)值为0.9997。
hplc分析：
储备液：将准确称重量的tg(20mg)转移到10ml容量瓶中并溶解在4ml2nnaoh溶液中。用ph7.5缓冲液补足体积。
标准储备液1：量取2.5ml储备液置于10ml容量瓶中，并使用ph7.5缓冲液补足体积以获得500μg/ml溶液。
标准储备液2：量取2.5ml储备液置于25ml容量瓶中，并使用ph7.5缓冲液补足体积以获得50μg/ml溶液。
标准储备液3：量取10ml储备液置于50ml容量瓶中，并使用ph7.5缓冲液补足体积以获得10μg/ml溶液。
标准储备液3的连续稀释：量取1、2、3、4、6、8和10ml的标准储备液3并使用ph7.5缓冲液补足至10ml以获得1、2、3、4、6、8和10μg/ml的溶液。通过hplc分析标准溶液(1-10μg/ml)以获得标准曲线。
在0-10μg/ml范围内在ph7.5下制作的标准曲线呈线性曲线，方程为y＝166.04x-56.27，回归系数(r2)值为0.9968。
片剂通过直接压片(dc)或湿法制粒(wg)来制备。直接压片技术包括混合活性成分和赋形剂，然后冲压成片剂。湿法制粒是使用液体粘合剂以使药物和赋形剂的粉末混合物轻微聚结以产生面粉团样物质的工艺。将该物质通过筛网过筛以获得颗粒。将这些颗粒干燥并再次通过具有比对湿物料使用的筛子更小的尺寸的筛子以形成尺寸均匀的颗粒。将润滑剂混合物加入到干燥的颗粒中，并冲压该混合物以获得片剂。
商购获得的6-tg片剂可作为20mg片剂(thiosixtm)和40mg(lanvistm、tabloidtm)获得。这些片剂被认为是“立即释放的”，并且在口服3至4小时内在胃中释放全部的6-tg。
使用湿法制粒技术(制剂1和3-11)或直接压片技术(制剂2)制备包含20mg6-tg的缓释片剂。使用具有8mm凸式冲头(制剂1-4)或6.5mm凸式冲头(制剂5-11)的manestye2单冲压片机冲压片剂。
制剂1(t008)
使用湿法制粒技术制备制剂1。
a)将成分1-3过40#筛。
b)将丙-2-醇和水的混合物逐滴加入到步骤a的混合物中以获得均匀一致的面粉团。
c)将来自步骤b的面粉团通过20#筛并在60℃下干燥15分钟。
d)水分含量应当在0.5-1％之间。
e)将干燥的颗粒通过40#筛。
f)将成分4通过40#筛过筛并加入到步骤e的颗粒中。
制剂2(t012)
使用直接压片技术制备制剂2。
a)将成分1-3过40#筛。
b)将筛过的混合物在塑料袋中充分混合10分钟。
c)将成分4和5通过40#筛过筛并加入到步骤b的混合物中。
d)将混合物在塑料袋中充分混合5分钟。
制剂3(t025)
通过湿法制粒技术制备制剂3。
a)将成分1-4过40#筛。
b)将丙-2-醇和水的混合物逐滴加入到步骤a的混合物中以获得均匀一致的面粉团。
c)将来自步骤b的面粉团通过20#筛并在60℃下干燥15分钟。
d)水分含量应当在0.5-1％之间。
e)将干燥的颗粒通过40#筛。
f)将成分5通过40#筛过筛并加入到步骤e的产物中。
制剂4(t038)
使用湿法制粒技术制备制剂4。
a)将成分1、2、4、5、6过40#筛。
b)将丙-2-醇和水的混合物逐滴加入到步骤a的混合物中以获得均匀一致的面粉团。(6.83ml丙-2-醇和16.33ml水)
c)将来自步骤b的面粉团通过20#筛并在60℃下干燥15分钟。
d)理想地，水分含量应当在0.5-1之间。
e)将干燥的颗粒通过40#筛。
f)将成分3、7、8通过40#筛过筛并加入到步骤e的混合物中。
制剂5(t047)
制剂6(t048)
制剂7(t049)
制剂8(t050)
制剂9(t052)
制剂10(t053)
制剂11(t054)
通过与上文对制剂1、3和4所述的湿法制粒方法类似的湿法制粒方法来制备制剂5至11。
制剂12(ec-tg052)
通过向片剂施加聚合物肠溶包衣来制备制剂9(t052)片剂的肠溶包衣形式。将含有20mg6-tg的片剂(t052)(每片重100mg)浸渍于4％w/veudragits100(evoniklaboratories)在丙-2-醇/丙酮的1:1混合物中的溶液中。然后将包衣片剂在空气中干燥。再重复浸渍和干燥过程两次以得到包含20mg6-tg的肠溶包衣片剂(ec-tg052)。
片剂的特性描述
硬度
使用erwekatbh20装置测量片剂硬度。
崩解试验
使用erwekazt124装置进行6-tg片剂的崩解研究。
脆碎度
使用erwekatar220装置进行脆碎度研究。对10个片剂称重并将其置于100rpm下的脆碎度鼓中。测试后，收集片剂并观察其是否有任何物理损伤。再次称重片剂并确定脆碎度％。
溶出研究
使用varianvk7000装置(usp通则章节<711>溶出，usp溶出装置2-桨)进行药物释放研究。在模拟实际的生理条件的胃和肠环境中进行溶出研究。使用usp-ii装置(桨)以50rpm进行释放速率。将片剂在37℃下浸没在750ml的0.1nhcl中。
操作1小时后，将已经在37℃下平衡的200ml磷酸三钠缓冲液加入到该容器中。必要时，使用2nnaoh或2nhcl将ph调节至7.5。添加缓冲液并调节ph的操作在5分钟内完成。溶出装置继续另外48小时。在固定时间间隔(在0.1nhcl中1小时后，将ph调节至7.5后1、2、4、8、24和48小时)下取出5ml等分试样进行分析。每次取出等分试样后(除了0.1nhcl等分试样外)，调整等体积的新鲜ph7.5缓冲溶液。通过uv光谱法和hplc分析每个样品。结果以图的方式总结在图8a和图8b中。
药物测定方法
使用研钵和研杵将5个片剂粉碎成粉末。称重相当于5个片剂的平均重量的粉末并转移至200ml容量瓶中。将大约150ml的0.5nnaoh加入到容量瓶中，并对其进行超声处理20分钟。
使用0.5nnaoh补足体积。将少量的等分试样过滤。取出0.5ml的滤过的等分试样置于10ml容量瓶中并补足体积至ph7.5，并通过uv光谱仪和hplc进行分析。
根据美国药典，6-tg片剂含有的6-硫鸟嘌呤的量应当不少于标示量的93.0％且不超过标示量的107.0％。
结果
6-tg释放速率
片剂制剂1至11在ph7.5下的释放速率以图的形式总结在图10中。
制剂1至11的累积释放速率百分比总结在下表6中。图9显示制剂5至11的片剂在ph7.5下在48小时内6-tg的累积释放百分比的图示。
表6：制剂1至11的累积释放速率
制剂9(t052)的片剂在48小时内的累积释放百分比以图的形式总结在图11中(实线)。图11还显示制剂9的肠溶包衣形式在48小时内的估计累积释放百分比(虚线)。
通过实验确定制剂12(ec-tg052)的肠溶包衣片剂的累积释放百分比。将片剂ec-tg052在胃模拟液中孵育1小时。然后将流体缓冲至ph7以模拟肠液。在42小时内测量从片剂释放的6-tg。出于比较，测定片剂的未包衣形式(制剂9，t052/u-tg052)的累积释放百分比。将ec-tg052的释放曲线与未包衣形式(u-tg052)的释放曲线进行比较，结果以图的形式总结在图12中。图12显示肠溶包衣片剂基本上抑制6-tg在模拟胃液中的释放。
将制剂1至4的6-tg片剂置于40℃/75％rh条件下持续1、2、3和6个月的时间进行加速稳定性研究。分析6-tg片剂的物理外观、重量均匀度、硬度、脆碎度、崩解研究、药物释放和测定。
6-tg片剂制剂1至11的稳定性数据总结在表7中：
表7：6-tg片剂的稳定性数据
图8a和图8b显示制剂1至4(t008、t012、t025和t038)的片剂在初始阶段以及在6个月的加速老化条件之后的累积释放数据。
这些数据表明，在加速条件下6个月结束时，所有片剂的物理参数与时间零点相比显示出很小的变化。然而，制剂2的6-tg片剂的数据与制剂1、3和4的6-tg片剂相比显示更大的相对于时间零点的偏差。制剂2的片剂的更低的测定可以归因于其制备方法(即直接压片)，这可能导致在混合期间药物粉末的低效混合或与壁的粘附。在湿法制粒方法中，活性组分(6-tg)由于在溶剂的存在下与赋形剂高效混合而形成均匀的混合物。因此，可以得出结论，通过湿法制粒方法制备的6-tg片剂(即制剂1、3和4)能够以受控方式释放6-tg并且到24小时结束时达到约80％的6-tg含量的释放，导致在结肠区域中有效的药物利用度。
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在本说明书通篇中，目的在于描述本发明的优选实施方案，而不是将本发明限制于任何一个实施方案或特征的特定集合。因此，本领域技术人员将理解，根据本公开，可以在示例的特定实施方案中进行各种修改和变化而不偏离本发明的范围。所有这些修改和变化都预期包括在随附权利要求书的范围内。在不偏离本发明的范围的情况下，许多修改对于本领域技术人员而言将是显然的。