本发明涉及间苯三酚类化合物及其盐的阿尔茨海默病性痴呆的预防及治疗的用途。
背景技术：
：：痴呆(dementia)为一种应与正常的衰老区别开来的病态现象，根据其原因，区分为阿尔茨海默病性痴呆(alzheimer'sdisease)、血管性痴呆(vasculardementia)、其他酒精中毒、创伤、由帕金森病的后遗症导致的痴呆。其中，阿尔茨海默病性痴呆的发病机理被认为是作为神经毒性蛋白的β-淀粉样蛋白(β-amyloidprotein)的毒性为最重要的原因。当察看因β-淀粉样蛋白而诱导神经细胞死亡的步骤时，通常所被接受的假设为如下：首先通过淀粉质源性途径(amyloidogenicpathway)从淀粉样前体蛋白(amyloidprecursorprotein，app)逐步产生β-淀粉样蛋白，像这样产生的单体形态的β-淀粉样蛋白相互聚集来形成寡聚物，像这种凝聚的形态的β-淀粉样蛋白最终诱导神经细胞死亡。因此，为了抑制因β-淀粉样蛋白而导致的神经细胞死亡，需要抑制β-淀粉样蛋白的生成，或者抑制单体β-淀粉样蛋白凝聚成寡聚物，或者从凝聚的β-淀粉样蛋白的毒性保护细胞。迄今为止，用于痴呆治疗的药物治疗已经使用了乙酰胆碱前体，或者通过用于使用阻碍乙酰胆碱的分解的药物来提高大脑的乙酰胆碱浓度的治疗方法。作为具有代表性的药物，具有他克林(tacrine)、多奈哌齐(donepezil)、利伐斯的明(rivastigmine)、加兰他敏(galantamine)等。现有的痴呆治疗剂主要仅具有乙酰胆碱酯酶抑制效果，而不具有β-淀粉样蛋白的形成或凝聚抑制功能，因而无法实现从根源上的痴呆的预防或治疗。并且，现有的痴呆治疗剂具有如下的缺点：由于现有的痴呆治疗剂为胆碱功能性药物，因此无法与其他胆碱功能性药物组合给药，存在抑制抗胆碱性药物的效果的问题，可通过作用于心血管系统，来呈现迷走神经肥大效果，并且对严重的哮喘或阻塞性肺病史的患者需要谨慎用药。因此，作为与现有的治疗药剂不同的方法，能够从根源上治疗阿尔茨海默病性痴呆的方法，即，为了克服该疾病，现实情况中最为重要的是寻求在抑制β-淀粉样蛋白的产生的同时毒性也低的药物。本发明的发明人在研究关于粗茎鳞毛蕨(dryopteriscrassirhizoma)的阿尔茨海默病性疾病的治疗及预防当中，在该存在于草药中的成分之中，发现以往完全未与阿尔茨海默病性疾病相关地提及并研究过的成分中的可抑制β-淀粉样蛋白的产生的有效成分的用途之后，并完成了本发明。现有技术文献专利文献1：韩国公开专利第10-2010-0082090号专利文献2：韩国公开专利第10-2010-0012927号技术实现要素：技术问题本发明的目的在于，提供用于预防或治疗阿尔茨海默病性痴呆的药剂学组合物。并且，本发明的目的在于，提供包括从粗茎鳞毛蕨提取有效成分，并进行分离及剂型化的用于预防或治疗阿尔茨海默病性痴呆的药剂学组合物的制备方法。技术方案为了解决本发明的技术问题，本发明提供包含间苯三酚(phloroglucinol)类化合物、其异构体或其盐的用于预防或治疗阿尔茨海默病性痴呆的药剂学组合物。并且，本发明提供包括从粗茎鳞毛蕨提取有效成分，并进行分离及剂型化的用于预防或治疗阿尔茨海默病性痴呆的药剂学组合物的制备方法。有益效果本发明的用于预防或治疗阿尔茨海默病性痴呆的药剂学组合物由于从根本上抑制β-淀粉样蛋白形成的原因，因此发挥可实现阿尔茨海默病性痴呆的根源性治疗的显著的效果。并且，本发明公开由粗茎鳞毛蕨分离并鉴定的单一物质的有关用于预防或治疗阿尔茨海默病性痴呆的最初的用途。附图说明图1为示出用于获取本发明的化合物的提取过程的一例的图。图2为示出用于获取本发明的化合物的分馏物的取得过程的一例的图。图3为示出被鉴定为单一物质的化合物1的1h-nmr的图。图4为示出被鉴定为单一物质的化合物1的13c-nmr的图。图5为示出化合物1的结构的图。图6为示出被鉴定为单一物质的化合物2的1h-nmr的图。图7为示出被鉴定为单一物质的化合物2的13c-nmr的图。图8为示出化合物2的结构的图。图9为示出本发明的化合物3的1h-nmr的图。图10为示出本发明的化合物3的13c-nmr的图。图11为示出本发明的化合物3的结构的图。图12为用于确认化合物1及2的是否有细胞毒性的图。图13为用于确认化合物3的是否有细胞毒性。图14为利用蛋白质印迹法示出化合物1至3的β-淀粉样蛋白形成抑制与否的图。图15为利用图表来对化合物1至3的β-淀粉样蛋白的形成抑制与否进行比较。图16为利用蛋白质印迹法示出化合物1对β-分泌酶的影响的图。图17为利用图表示出化合物1对β-分泌酶的影响的图。图18为利用蛋白质印迹法示出化合物2对β-分泌酶的影响的图。图19为利用图表示出化合物2为β-分泌酶的影响的图。图20为利用蛋白质印迹法示出化合物3对β-分泌酶的影响的图。图21为利用图表示出化合物3对β-分泌酶的影响的图。具体实施方式以下，对本发明进行进一步详细的说明。本发明涉及包含间苯三酚(phloroglucinol)类化合物，其的异构体或其盐的用于预防或治疗阿尔茨海默病性痴呆的药剂学组合物。本说明书中所定义的间苯三酚类化合物具有如以下化学式1的基本结构。<化学式1>所述化学式1中的第2及第4位置可被烷基或酰基取代。优选地，本发明的间苯三酚类化合物为选自由丁酰间苯三酚(butyrylphloroglucinol)、2-丙酰基-4-甲基间苯三酚(2-propionyl-4-methylphloroglucinol)及2-丁酰-4-甲基间苯三酚(2-butyryl-4-methylphloroglucinol)组成的组中的一种以上。本发明一实施例中的丁酰间苯三酚、2-丙酰基-4-甲基间苯三酚及2-丁酰-4-甲基间苯三酚具有在有效浓度中未呈现出细胞毒性的同时还抑制β-淀粉样蛋白的形成的显著效果(参照图12至图21)。尤其，化合物3在实验例1的100ug/ml的浓度中呈现出了毒性，但在未呈现毒性的20ug/ml中使sappβ的量减少且几乎接近完全的程度，并且可意识到有效地使β-分泌酶的量减少。通常，当有效成分等的给药量高时，在不仅考虑细胞毒性，还考虑药物代谢导致的患者的副作用增强的这一点的情况时，在低剂量下呈现出显著效果的方面上，对阿尔茨海默的治疗药物而言具有很高的价值。本发明的药剂学组合物可包含选自由丁酰间苯三酚、2-丙酰基-4-甲基间苯三酚及2-丁酰-4-甲基间苯三酚，其的异构体或其盐组成的组中的一种以上的药效物质。并且，本发明的药剂学组合物即使单独包含丁酰间苯三酚，2-丙酰基-4-甲基间苯三酚及2-丁酰-4-甲基间苯三酚，其的异构体或其盐中的一种药效物质，也可呈现阿尔茨海默病性痴呆的预防或治疗的效果。具体地，本发明的药剂学组合物中的药效物质即使仅包含丁酰间苯三酚，其的异构体或其盐，也可呈现阿尔茨海默病性痴呆的预防或治疗的效果。并且，具体地，本发明的药剂学组合物中的药效物质仅包含2-丙酰基-4-甲基间苯三酚，其的异构体或其盐，也可呈现阿尔茨海默病性痴呆的预防或治疗的效果。并且，具体地，本发明的药剂学组合物中的药效物质仅包含2-丁酰-4-甲基间苯三酚，其的异构体或其盐，也可呈现阿尔茨海默病性痴呆的预防或治疗的效果。包含在本发明的药剂学组合物中的间苯三酚类化合物的盐可以为与无机酸、有机酸、无机碱或有机碱形成的生理学上可接受的盐。作为所述无机酸，可举例有盐酸、溴酸、硫酸及磷酸，作为有机酸可举例有柠檬酸(citricacid)、乙酸、乳酸、酒石酸(tartariacacid)、马来酸、富马酸(fumaricacid)、甲酸、丙酸(propionicacid)、草酸、三氟乙酸、苯甲酸、葡萄糖酸、甲磺酸、乙醇酸、琥珀酸、4-甲苯磺酸、半乳糖醛酸、扑酸、谷氨酸或天冬氨酸等，但不限定于此。本发明中所使用的阿尔茨海默病性痴呆(alzheimer'sdisease)是指由阿尔茨海默疾病引起的痴呆，即，因在脑组织中形成并沉积β-淀粉样蛋白而引起的痴呆，只要是由β-淀粉样蛋白的形成及沉淀所引起的痴呆，则包括在本申请的发明要求保护的范围之内。包含本发明的间苯三酚类化合物的阿尔茨海默病性痴呆的预防或治疗用药剂学组合物可适用于包括人类的动物之中。包含于本发明的药剂学组合物中的间苯三酚类化合物可通过化学合成法来制备或通过从粗茎鳞毛蕨(dryopteriscrassirhizoma)提取来取得。在本发明的一实施例中，从粗茎鳞毛蕨分离出了包含于本发明的药剂学组合物中的间苯三酚类化合物。粗茎鳞毛蕨(dryopteriscrassirhizoma)为属于叉蕨科(aspidiaceae)的多年生草。在通过提取方法来取得包含于本发明的药剂学组合物中的间苯三酚类化合物的情况下，该提取方法可以为冷浸提取法、温浸提取法、热提取法、超声波提取法等，并且可利用常规的提取设备、超声波粉碎提取设备或分馏器。包含于本发明的药剂学组合物中的间苯三酚类化合物的分离可利用选自由丙醇、异丙醇及甲醇组成的组中的一种以上的溶剂来提取并实现。其中，优选地，选自由异丙醇或丁醇组成的组中的一种以上的溶剂为宜。优选地，利用于所述提取的溶剂为50％(v/v)至99％(v/v)的稀释水。通过将粗茎鳞毛蕨利用选自由丙醇、异丙醇及甲醇组成的组中的一种以上的溶剂来进行提取的提取物在进行提取之后，去除粗茎鳞毛蕨的残渣，利用滤纸来过滤之后，将滤液利用真空旋转浓缩仪或真空干燥仪来进行浓缩之后，可室温保管。所述提取物还可进行利用选自由己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、丁醇、水组成的组中的一种以上的溶剂来同时或依次进行分馏的过程。优选地，所述分馏溶剂为丁醇，更优选地，以30％(v/v)至99％(v/v)的丁醇稀释水为宜。所述分馏物可利用真空旋转浓缩仪或真空干燥仪进行浓缩之后，在室温下保管。利用所述选自由己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、丁醇、水组成的组中的一种以上的溶剂来同时或依次进行分馏的过程来取得的分馏物可通过离子交换树脂层析法、硅胶层析法或中压液相层析法(mplc)来进行分离。在所述层析法中所使用的溶剂不做限定，但优选地，可举例为甲醇、乙腈、乙腈及氯甲烷。本发明的间苯三酚类化合物在阿尔茨海默病性痴呆的预防或治疗方面上提供卓越的用途。本发明的一实施例中测定了间苯三酚类化合物的β-淀粉样蛋白形成抑制效果，结果发现通过以浓度依赖性方式抑制sappβ可从根本上抑制β-淀粉样蛋白的形成(参照图14及图15)。并且，本发明的一实施例中测定了间苯三酚类化合物的β-淀粉样蛋白形成抑制效果，结果发现了通过以浓度依赖性方式抑制β-分泌酶可从根本上抑制β-淀粉样蛋白的形成(参照图16至图21)。即，与现今市售中的他克林(tacrine)、多奈哌齐(donepezil)、利伐斯的明(rivastigmine)、加兰他敏(galantamine)等的利用乙酰胆碱的代谢来单纯地抑制阿尔茨海默病性痴呆的进展的药物不同，包含本发明的间苯三酚类化合物，其的异构体或其盐的药剂学组合物可抑制作为阿尔茨海默病性痴呆的根本性问题的β-淀粉样蛋白的产生本身。因此，本发明的药剂学组合物可直接适用于阿尔茨海默病性痴呆的预防及治疗中。本发明的药剂学组合物的给药量可通过考虑给药方法、服用者的年龄、性别、患者的严重程度、状态、体内的活性成分的吸收度、灭活速率及并用药物来确定，当以一日有效成分为基准时，能够以0.1mg/kg(体重)至500mg/kg(体重)给药，优选地，能够以0.1mg/kg(体重)至400mg/kg(体重)给药，或者更优选地，能够以1mg/kg(体重)至300mg/kg(体重)给药，所述给药可分为一次或数次来进行给药，但不限定于此。本发明的药剂学组合物可通过包含惰性载体、稀释剂或两者均包含剂型化的方式进行剂型化。作为所述惰性载体或稀释剂的例，具有乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、玉米淀粉、金合欢橡胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、酒石酸、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁及矿物油、糊精、碳酸钙、丙二醇、液体石蜡、生理盐水等，但不限定于此。并且，本发明的药剂学组合物还可包含常规的填充剂、增量剂、粘合剂、崩解剂、抗凝血剂、润滑剂、润湿剂、ph调节剂、营养素、维生素、电解质、海藻酸及其盐、果胶酸及其盐、保护胶体、甘油、香料、乳化剂或防腐剂等。其他可使用的适当的润滑剂及额外的赋形剂叙述在以下文献中。[handbookofpharmaceuticalexcipients,7thedition,americanpharmaceuticalassociation；thetheoryandpracticeofindustrialpharmacy,3thedition,lachman,leon,1976；pharmaceuticaldosageforms:tabletsvolume1～3edition,lieberman,heberta.,外,1989；modernpharmaceutics,banker,gilbertandrhodes,christophert,1979；以及remington'spharmaceuticalsciences,15thedition,1975]包含所述例举的载体、稀释剂的添加剂，本发明的药剂学组合物可剂型化为口服或非口服制剂。用于口服给药的制剂中包含片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、悬浮剂、糖浆剂等。用于非口服给药的形态为霜剂、洗剂、软膏剂、液体剂、凝胶剂、泥敷剂、贴剂、气雾剂、流浸膏剂、酏剂、浸剂、香囊、注射剂等。在此情况下，所述用于预防或治疗阿尔茨海默病性痴呆的药剂学组合物内的间苯三酚类化合物的含量可以为0.001重量％至99.9重量％、0.1重量％至99重量％或1重量％至50重量％，但不限定于此，根据组合物的使用方式及使用方法，所述化合物的含量能够以优选地含量来适当调节使用。并且，除了所述有效成分之外，本发明的用于预防或治疗阿尔茨海默病性痴呆的药剂学组合物可额外地包含公知的具有痴呆治疗效果的本发明所属
技术领域：
：所周知的物质。可举例有他克林(tacrine)、多奈哌齐(donepezil)、利伐斯的明(rivastigmine)、加兰他敏(galantamine)等物质，但不限定于此。以下，为了具体说明本发明，例举实施例来进行详细的说明。然而，以下实施例仅用于例示本发明，本发明的发明要求保护范围并不限定于以下实施例。实施例1.粗茎鳞毛蕨提取物及分馏提取物的制备1.粗茎鳞毛蕨的甲醇或异丙醇提取物的制备向6kg的去除了杂质的粗茎鳞毛蕨中添加90％的甲醇，在常温下浸渍24小时之后，利用滤纸过滤之后，利用真空旋转浓缩仪(eyela)来对滤液进行了浓缩。将此过程重复三次，并取得了325g的褐色的结晶性粉状提取物。并且，向6kg的去除了杂质的粗茎鳞毛蕨中添加90％的异丙醇，经过与所述工序相同的工序，取得了390g的褐色的结晶性粉状提取物。2.粗茎鳞毛蕨的分馏提取物的制备利用极性之差，将经浓缩的所述粗茎鳞毛蕨的甲醇或异丙醇提取物分别分馏为互不相混的两种溶剂。依次分馏己烷层、二氯甲烷层、乙酸乙酯层、丁醇层、水层并进行了浓缩，将此过程重复了三次。在4℃温度条件下保管浓缩液，直至使用为止。提取物分别取得了己烷层16g、二氯甲烷层3g、乙酸乙酯层54g、丁醇层80g、水层140g。实施例2.化合物1至3的分离纯化将所述所分馏的丁醇层提取物(80g)一次性地适用于mci柱层析。作为流动相，使用了30％～100％的甲醇，共取得了六个馏分(s1～s6)。其中，基于薄层层析法(tlc)、高效液相层析法(hplc)的结果，利用中压液相层析(mplc)方法分离了第五馏分(s5，3.5g)。流动相以二氯甲烷(methylenechloride，mc)：甲醇(meoh)：水(water)(10:1:1)开始，并以二氯甲烷：甲醇：水＝10:2:1、10:3:1、10:4:1、10:5:1进行。其结果，共出来15个馏分，并通过薄层层析法、高效液相层析法方法添加到了10个馏分中。其中，通过高效液相层析法(溶剂条件：40～50％的乙腈(acn))，第一馏分(255mg)取得了作为纯的单一物质的化合物1(10mg)、化合物2(5.5mg)及化合物3(15mg)。实施例3.化合物1的结构鉴定化合物1被分离为鲜红色粉末。证实了1hnmr为两个质子δh5.81(2h，s，h-4，h-6)由13cnmr的1、3、5取代的芳香质子。并且，通过两个亚甲基质子2.97(2h，t，j＝7.4hz，h-2′)，1.60(2h，m，h-3′)与甲基质子0.92(3h，t，j＝7.4hz，me-4′)的相关关系，推断出了丁酰基。13cnmr确认了δc205.55(c-1′)、164.90(c-5)、164.66(c-1，3)、104.26(c-2)、95.10(c-4，6)、45.48(c-2′)、18.19(c-3′)、14.33(c-4′)。基于核磁共振(nmr)的结果，确认了间苯三酚的母核，与参考文献相比，化合物1被确认并鉴定为丁酰间苯三酚(butyrylphloroglucinol)。实施例4.化合物2的结构鉴定化合物2被分离为鲜红色粉末。证实了1hnmr为一个质子δh5.92(s，h-6)由13cnmr的1、3、5取代的芳香质子。并且，通过亚甲基质子3.09(2h，q，h-2′)与甲基质子(3h，t，j＝7.4hz，me-3′)的相关关系，推断出了丙酰基，并确认了一个甲基质子1.94(3h，s，me-1")。13cnmr确认了δc208.70(c-1′)、163.46(c-5)、162.30(c-3)、159.99(c-1)、103.65(c-4)、102.09(c-2)、93.33(c-6)、36.61(c-2′)、7.93(c-3′)、5.91(c-1")。基于核磁共振(nmr)的结果，确认了间苯三酚的母核，与参考文献相比，化合物2被确认并鉴定为2-丙酰基-4-甲基间苯三酚(2-propionyl-4-methylphloroglucinol)。实施例5.化合物3的结构鉴定化合物3被分离为鲜红色粉末。1hnmr为一个质子δh6.01(s，h-6)由13cnmr的1、3、5取代的芳香质子。亚甲基质子2.97(2h，t，j＝7.4hz，h-2′)通过与其他亚甲基质子1.60(2h，m，h-3′)及甲基质子0.92(3h，t，j＝7.4hz，me-4’的相关关系，推断出了丁酰基，并确认了一个甲基质子1.84(3h，s，me-1")。13cnmr确认了δc206.52(c-1′)、163.68(c-5)、163.03(c-3)、161.24(c-1)、103.23(c-4)、102.69(c-2)、95.74(c-6)、41.97(c-2′)、19.44(c-3′)、13.57(c-4′)、7.84(c-1")。基于核磁共振(nmr)的结果，确认了间苯三酚的母核，与参考文献相比，化合物3被确认并鉴定为2-丁酰-4-甲基间苯三酚(2-butyryl-4-methylphloroglucinol)。实验例1.经分离及鉴定的化合物的毒性确认为了检测通过实施例1至实施例5来进行了分离及鉴定的化合物1至化合物3的细胞毒性，进行了mtt细胞毒性试验(mtt-basedcytotoxicityassay)。将化合物1～化合物3处理的appwt-cho细胞培养24小时之后，放入5mg/ml浓度的mtt溶液培养了4小时。除去培养基，并放入二甲基亚砜(dmso)溶解30分钟之后，利用emax精密酶标仪(emaxprecisionmicroplatereader)(美谷分子仪器公司(moleculardevices)，加州(ca)，美国(usa))在540nm测定了吸光度。在化合物1与化合物2中未在100ug/ml的浓度中呈现出毒性，但化合物3的情况下在30ug/ml以上的浓度中呈现出了毒性(参照图12及图13)。实验例2.间苯三酚类化合物的β-淀粉样蛋白形成抑制效果为了测定化合物1至化合物3的β淀粉样生成抑制能，利用在cho细胞中过表达淀粉样前体蛋白(app)的appwt-cho细胞株，通过蛋白质印迹试验方法来测定了有β-分泌酶切割并向细胞外分泌的sappβ蛋白的量。当淀粉样前体蛋白前体蛋白一次性地由β-分泌酶切割时，sappβ向细胞外分泌，并附着于膜上的蛋白质再次被γ-分泌酶切割并形成β-淀粉样蛋白。因此，β-分泌酶与sappβ的量与β-淀粉样蛋白的产生量成正比，因此通过蛋白质印迹法来测定了两个蛋白质。其结果为如下：在sappβ蛋白质的量的情况下，化合物1(butyrylphloroglucinol)在10ug/ml的浓度下，与对照相相比，使之减少了约20％，在20ug/ml下使之约减少70％，化合物2(2-propionyl-4-methylphloroglucinol)与对照相相比，在20ug/ml下使sappβ的量减少了40％，在100ug/ml下减少了约80％。化合物3(2-butyryl-4-methylphloroglucinol)与对照相相比，在10ug/ml下使sappβ的量减少了约40％，在20ug/ml使之减少了约80％。并且，化合物1(butyrylphloroglucinol)与对照相相比，使β-分泌酶蛋白质的量在10ug/ml下减少了10％，在20ug/ml下使之减少了约30％，化合物2(2-propionyl-4-methylphloroglucinol)与对照相相比，在20ug/ml下，使β-分泌酶的量减少了约40％，在100ug/ml下使之减少了约60％，化合物3(2-butyryl-4-methylphloroglucinol)与对照相相比，在10ug/ml下，使β-分泌酶的量减少了约20％，在20ug/ml下使之减少了约30％。从结果上而言，化合物1至化合物3均呈现出了β-淀粉样蛋白生成抑制效能(图14至图21)。当前第1页12当前第1页12