一种增敏的卵巢癌治疗药物组合物及其用途的制作方法

本发明属于药物领域，具体涉及一种增敏的卵巢癌治疗药物组合物及其用途。
背景技术：
：卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，由于卵巢的胚胎发育、组织解剖及内分泌功能较复杂，早期症状不典型，导致了早期诊断困难，术前鉴别卵巢肿瘤的组织类型及良恶性也相当困难，卵巢癌患者手术中发现肿瘤局限于卵巢的仅占30％，大多数已扩散到子宫，双侧附件，大网膜及盆腔各器官，治疗困难，预后差，其5年生存率一般仅25％-30％。因此，卵巢癌具有发现晚、治疗困难，死亡率高的特点，虽然卵巢癌发病率低于子宫颈癌和子宫体癌，位居妇科肿瘤发病率的第三位，但其死亡率却为各类妇科肿瘤的首位，严重威胁了妇女的生命健康。白藜芦醇(resveratrol，Res)，化学名称为3，4，5-三羟基-1，2-二苯乙烯，又称芪三酚，是从毛叶黎芦中分离提取的非黄酮类多酚化合物，广泛存在于花生、葡萄、虎杖、桑葚等植物中，研究发现Res不仅在调节脂质代谢、抑制血小板聚集以及调节免疫等方面发挥作用，而且在抑癌、抗癌方面也有明显的治疗作用，目前研究表明，白藜芦醇主要通过诱导肿瘤细胞凋亡来实现其抑制肿瘤生长的作用。近年来人们发现白藜芦醇可通过抑制二氢神经酰胺脱氢酶活性导致胞内二氢神经酰胺水平上升，继而诱导细胞自噬，研究发现白藜芦醇可诱导卵巢癌细胞A2780发生凋亡，bcl-2蛋白的减少与bax蛋白表达增多可能是RES诱导卵巢癌细胞凋亡的机制之一，且白藜芦醇对卵巢癌细胞同样具有诱导其自噬的作用，且这种自噬在肿瘤细胞中的具体作用主要取决于细胞微环境。自噬(autophagy)是真核细胞适应营养或生长因子缺乏、低氧、内质网应激等有害刺激所发生的一种应激反应，对于维持蛋白代谢平衡和细胞内环境稳定具有重要意义，是正常细胞和病态细胞都普遍存在的一种生理机制。自噬作为目前细胞生物学的研究热点之一，其与肿瘤的关系已被广泛关注，在某些肿瘤细胞中自噬活动的低下与肿瘤的发生具有一定的关系，在肿瘤生长过程中，肿瘤细胞可以通过自噬来克服没有足够的血管导致的营养缺乏和低氧，使得癌症细胞得以生存，同时自噬对线粒体的分割可防止如细胞色素C和凋亡诱导因子等促凋亡因子的扩散而抑制细胞凋亡。此外可能细胞自噬的某个分子途径同时抑制细胞凋亡，而细胞自噬被抑制后，这种对细胞凋亡的抑制作用减弱从而细胞凋亡增加。研究发现表柔比星作用于膀胱肿瘤T24细胞时介导引起的细胞自噬抑制T24肿瘤细胞凋亡，而抑制细胞自噬则起到了化疗协同作用，自噬在正常细胞中起到保护细胞发展为恶性肿瘤细胞的作用，而在恶性肿瘤细胞中又避免了细胞因药物损伤引起的凋亡，可导致肿瘤细胞的耐药，即自噬对于肿瘤的作用具有两面性，通过自噬用于肿瘤或耐药肿瘤的治疗需要视具体情况具体分析。虽然全身性化疗的治疗方法已广泛应用于卵巢癌的治疗，但其效果仍不理想，预后差，患者5年生存率低，其中重要原因之一为化疗多药耐药，因此，需要研究开发治疗效果更好的卵巢癌治疗药物组合物，尤其是针对于耐药卵巢癌的增敏药物组合物。技术实现要素：本发明的一个目的是提供一种增敏的卵巢癌治疗药物组合物，其以白藜芦醇和自噬抑制剂为活性成分。所述自噬抑制剂为3-甲基腺嘌呤(3-MA)。所述卵巢癌为SKOV3细胞。优选的所述卵巢癌为耐药卵巢癌。本发明增敏的卵巢癌治疗药物组合物中白藜芦醇与自噬抑制剂的摩尔比为1∶100-2000，优选的为1∶200-1000，更优选的为1∶400。本发明增敏的卵巢癌治疗药物组合物中白藜芦醇与自噬抑制剂的含量为药物组合物总重量的1％-99％，优选的为5％-50％，更优选的为8％-15％，本发明的增敏的卵巢癌治疗药物组合物包含白藜芦醇、自噬抑制剂及药学上可接受的辅料，经本领域常规方法制备成适宜的剂型。进一步的本发明的增敏的卵巢癌治疗药物组合物可以为口服制剂、局部制剂或注射剂，所述口服制剂的剂型包括但不限于：片剂、胶囊剂、颗粒剂、溶液剂等，所述局部制剂的剂型包括但不限于乳剂、乳膏剂、凝胶剂、栓剂等，所述注射剂的剂型包括但不限于：注射液、粉针剂等。本发明的另一个目的是提供自噬抑制剂在制备白藜芦醇治疗和预防卵巢癌的增敏药物组合物中的用途。优选的，所述自噬抑制剂为3-甲基腺嘌呤(3-MA)。优选的，所述卵巢癌为SKOV3细胞。更有选的，所述卵巢癌为耐药卵巢癌。所述的白藜芦醇治疗和预防卵巢癌的增敏药物组合物中白藜芦醇与自噬抑制剂的摩尔比为1∶100-2000，优选的为1∶200-1000，更优选的为1∶400。所述的白藜芦醇治疗和预防卵巢癌的增敏药物组合物包含白藜芦醇、自噬抑制剂及药学上可接受的辅料，经本领域的常规方法制备成适宜的剂型。进一步的所述的白藜芦醇治疗和预防卵巢癌的增敏药物组合物可以为口服制剂、局部制剂或注射剂，所述口服制剂的剂型包括但不限于：片剂、胶囊剂、颗粒剂、溶液剂等，所述局部制剂的剂型包括但不限于乳剂、乳膏剂、凝胶剂、栓剂等，所述注射剂的剂型包括但不限于：注射液、粉针剂等。本发明的有益效果：本发明的增敏的卵巢癌治疗药物组合物可显著的提高卵巢癌细胞、耐药卵巢癌细胞对于白藜芦醇的敏感性，减少和防止化疗过程中的耐药，增强白藜芦醇对卵巢癌和耐药卵巢癌的治疗效果，为卵巢癌和耐药卵巢癌的预防和治疗提供了新的方向和方法。附图说明：图1显示了Res、3-MA、Z-VAD-FMK处理SKOV3细胞后LC3II和Beclin-1蛋白的表达图2显示了Res、3-MA、Z-VAD-FMK处理SKOV3细胞后LC3II和Beclin-1蛋白mRNA表达具体实施方式还可进一步通过实施例来理解本发明，其中所述实施例说明了一些制备或使用方法。然而，要理解的是，这些实施例不限制本发明。现在已知的或进一步开发的本发明的变化被认为落入本文中描述的和以下要求保护的本发明范围之内。实施例1自噬抑制剂对白藜芦醇治疗和预防卵巢癌的增敏作用1.1主要材料及试剂人卵巢浆液性乳头状囊腺癌SKOV3细胞株，由哈尔滨医科大学附属第三医院肿瘤研究所提供；Res溶于二甲基亚砜(DMSO)配成100mmol/L的原溶液，-20℃避光保存；RPMI-1640培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；兔抗人Beclinl、LC3-IIIgG多克隆抗体(Santa公司)；CCK-8试剂购自日本同仁化学研究所；3-MA、MDC染料(美国Sigma公司)；Z-VAD-FMK20μM，-20℃保存(美国Sigma公司)；AnnexinV/PI凋亡检测试剂盒购自上海联科生物有限公司；2×TaqMasterMix(上海莱枫生物技术有限公司)；RNaseFreewater(北京中杉金桥科技有限公司)；M-MuLVReverseTranscriptase(北京中杉金桥科技有限公司)。1.2实验方法1.2.1细胞培养SKOV3细胞常规培养于RPMI-1640培养液中，内含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，37℃、5％CO2培养箱内培养，每2-3天传代1次，取对数生长期细胞进行实验。1.2.2细胞分组与加药处理实验细胞分为4组：对照组(Control)、白藜芦醇组(Res)、3-MA组、3-MA+Res组。对照组加入等体积的DMEM，各组细胞于处理24h后行相关检测。1.2.3CCK8法检测药物对细胞存活率的影响将对数生长期的细胞以2×104个/孔细胞接种于96孔板，于5%CO2，37℃，饱和湿度下培养，次日镜下观察细胞贴壁后弃去各培养孔内原培养液。以加药为时间起点，24h后加入CCK-8，进行细胞活性检测。弃去含药培养液，PBS洗涤1次，测定时每孔加入10μl的CCK-8溶液，将培养板在培养箱内(37℃和5％CO2浓度)孵育4小时；然后将96孔培养板中液体转移至另一个96孔板；上机，使用酶标仪测定在490nm处的吸光度。细胞增殖抑制率通过以下公式计算得出：细胞存活率＝(实验组OD-空白组OD)/(对照组OD-空白组OD)。2.结果具体结果参见下表：浓度细胞存活率协同指数(CI)对照组-100％Res12.5μmol/L73±1.43％25μmol/L45±2.11％50μmol/L27±2.79％3-MA5mmoL/L95±3.29％10mmoL/L86±3.73％20mmoL/L71±3.18％Res+3-MA12.5μmol/L+10mmoL/L51±2.42％0.826Res+3-MA25μmol/L+10mmoL/L15±2.34％0.319Res+3-MA50μmol/L+10mmoL/L13±3.21％0.634从上表数据可以看出，Res和3-MA应用产生了极佳的协同，并且联合应用组较等剂量单味药组具有明显的统计学差异，更进一步地我们采用本领域最为认可的Chou-talalay协同作用指数(CombinationIndex；CI)评价不同比例组合的协同效果，具体计算方法参见非专利文献ChouTC.等DrugcombinationstudiesandtheirsynergyquantificationusingtheChou-Talalaymethod[J].CancerRes，2010，70(2)；440-446.当CI＞1.1时，认为两者产生了拮抗作用，当CI在0.9-1.1之间说明两者仅是相加作用，当CI＜0.9时说明两者产生了协同作用，并且数值越低协同作用越明显。本发明发现当Res和3-MA的摩尔比在1∶400时协同效果最佳。还需要说明的是，为了证明Res和3-MA的协同作用，我们在3AO人粘液性卵巢癌细胞系以及TYK人未分化卵巢癌细胞系上进行了相同测试；结果证实Res和3-MA在两种细胞系上均取得了明显的协同作用，并且摩尔比在1∶400时协同效果最佳。实施例2自噬抑制剂对白藜芦醇治疗和预防卵巢癌的增敏作用的机制研究1.1SKOV3细胞常规培养于RPMI-1640培养液中，内含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，37℃、5％CO2培养箱内培养，每2-3天传代1次，取对数生长期细胞进行实验。1.2细胞分组与加药处理实验细胞分为4组：对照组(Control)、白藜芦醇组(Res)、3-MA组、3-MA+Res组、Z-VAD-FMK+Res组。对照组加入等体积的DMEM；Res组加入实验浓度25μmol/L的Res处理细胞；3-MA组使用10mmoL/L的3-MA处理细胞，3-MA+Res组先用10mmoL/L的3-MA处理细胞，1h后加入25μmol/L的Res；Z-VAD-FMK+Res组先用20μMZ-VAD-FMK处理细胞，30min后加入25μmol/L的Res，各组细胞于处理24h后行相关检测。1.3Westernblotting检测LC3I、II和Beclin-1的表达按实验分组收集SKOV3细胞，冷PBS洗涤3次，弃上清，3500r/min，离心5min，加入100μL蛋白裂解液(RIPA∶PI＝10∶1)，涡旋，13000r/min离心30min，收集上清即为细胞裂解液，进行Bradford比色法测定蛋白质浓度，取相同质量的细胞裂解液(体积*蛋白质浓度)并加等体积的电泳加样缓冲液，沸水浴15min。上样，10％的SDS凝胶电泳，转膜至硝酸纤维素膜上，室温封闭1h，一抗(LC3β1∶2000、Beclin-11∶3000)4℃孵育过夜，二抗(稀释浓度1∶3000)室温孵育1h，最后显影，用灰度分析软件QuantityOne软件对实验结果进行灰度扫描。1.4半定量逆转录PCR检测LC3β和Beclin-1的mRNA的表达分别将四组培养瓶中存活的细胞分别置于六个孔板中，采用TRIzol一步法分别提取总RNA，检测RNA的完整性，使用RevertAid逆转录试剂盒合成cDNA，半定量PCR反应体积25μL。引物序列为：LC3β上游引物为5’-GGCCTTCTTCCTGTTGGTGA-3’，下游引物为5’-TCTCCTGGGAGGCATAGACC-3’，退火温度59℃，产物长122bp；Beclin-1上游引物为5’-CAGTGTTCCCGTGGAATGGA-3’，下游引物为5’-CAGTCCAGGAAAGCCACCAT-3’，退火温度为60℃，产物长243bp。分别对四组细胞进行半定量RT-PCR反应来测定目的基因的表达量。1.5MDC染色检测自噬细胞阳性百分率各组细胞加入5mmol/L的MDC，调整MDC终浓度为0.05mmol/L，再放入孵箱37℃、5％CO2孵育60min，然后4％多聚甲醛混合培养15min，PBS洗涤2次，置于荧光显微镜下观察，用流式细胞仪以488nm激发波长，各组均测定10000个细胞的MDC染色的荧光强度，计数自噬细胞阳性百分率。1.6AnnexinV/P染色检测凋亡细胞阳性百分率各组细胞PBS冲洗2次，按照AnnexinV/PI凋亡检测试剂盒说明书，室温避光作用15min，上流式细胞仪488nm激发波长检测DNA含量，各组均测10000个细胞，以DNA含量低于G1期的亚二倍体为凋亡细胞，计算凋亡细胞百分率。1.7统计学方法采用SPSS17.0统计软件，数据用x±s(s为标准差)表示，采用单因素分析，两组之间比较采用Student’s-ttest，多个样本均数间比较采用方差分析，P＜0.05作为显著性检验水准。2结果2.1Res、3-MA及Z-VAD-FMK对LC3II和Beclin-1表达影响Westernblotting显示Res组与对照组比较LC3II和Beclin-1蛋白表达明显上升(P＜0.01)，Res+3-MA组与Res组比较LC3II和Beclin-1蛋白表达逐渐下降，差异具有统计学意义(P＜0.01)，Res+Z-VAD-FMK组与Res组比较LC3II和Beclin-1蛋白表达升高，差异具有统计学意义(P＜0.01)。(具体结果参见表1)表1Res、3-MA处理SKOV3细胞后LC3II和Beclin-1蛋白的相对定量注：*P与至白组比较，P＞0.01，差异具有统计学意义，#P与Res组比较，P＞0.01，差异具有统计学意义。2.2RT-PCR检测LC3-II、Beclin-1转录mRNA的表达情况(参见表2)显示Res组与对照组比较LC3II和Beclin-1mRNA表达明显上升(P＜0.01)，Res+3-MA组与Res组比较LC3II和Beclin-1mRNA表达逐渐下降，差异具有统计学意义(P＜0.01)，Res+Z-VAD-FMK组与Res组比较LC3II和Beclin-1mRNA表达升高，差异具有统计学意义(P＜0.01)。表2Res、3-MA处理SKOV3细胞后LC3II和Beclin-1蛋白mRNA的相对定量注：*P与空白组比较，P＞0.01，差异具有统计学意义，#P与Res组比较，P＞0.01，差异具有统计学意义。2.3各组自噬细胞阳性百分率、凋亡细胞百分率MDC可被SKOV3细胞吸收并选择性聚集于自噬泡(AV)中，阳性自噬细胞即为含AV的细胞。在对照组细胞中，仅见到很少的MDC阳性细胞，而在Res处理组，MDC阳性细胞数明显增加，Res+3-MA组中MDC阳性细胞AV数则明显减少，Res+Z-VAD-FMK组总AV数量较Res组增加。Res组自噬细胞百分率与对照组、Res+3-MA组和Res+Z-VAD-FMK组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。对照组与Res组比较，P＝0.0052，Res组与Res+3-MA比较，P＝0.0035，Res组与Res+Z-VAD-FMK比较，P＝0.0042，差异均具有统计学意义。(参见表3)表3各组中自噬细胞和凋亡细胞百分率(x±s，n＝3)注：*P与空白组比较，P＞0.01，差异具有统计学意义，#P与Res组比较，P＞0.01，差异具有统计学意义。Beclin-1是第一个确定的哺乳动物的自噬基因产物，主要通过与ClassIII/磷酸肌醇3激酶(P13K)形成复合体来控制自噬体的形成，调节其它的自噬蛋白定位到前自噬体膜上.其对于自噬体的形成是必不可少的。LC3在自噬过程中被修饰成LC3-II后定位在自噬泡膜上，其含量多少与自噬泡数量的多少成正比，是哺乳动物自噬的标志蛋白。本发明通过Westernblotting检测Res组和Res+3-MA组中LC3II和Beclin-1蛋白表达发现3-MA抑制细胞自噬后LC3II和Beclin-1蛋白较未抑制细胞自噬的Res组明显降低，LC3II和Beclin-1蛋白表达说明Res作用SKOV3细胞中存在细胞自噬，3-MA有效的抑制了细胞自噬，达到促进肿瘤细胞凋亡的目的。自噬表现为自噬体和自噬溶酶体的形成、高电子密度的膜状自噬小泡形成、鞘磷脂螺旋状、多泡体和细胞器被吞噬等现象。自噬细胞形态学上最主要的特征是细胞内出现大量的双层或多层膜的细胞质囊泡结构。本发明通过MDC特异性染色观察Res+3-MA组细胞自噬泡较Res组明显减少，自噬细胞阳性百分率降低，再一次证明Res作用SKOV3细胞时存在细胞自噬，3-MA有效的抑制了细胞自噬。而同时AnnexinV/P染色发现Res+3-MA组细胞自噬被抑制后凋亡细胞百分率却较Res组明显上升，提示Res作用于卵巢癌SKOV3细胞时自噬和凋亡同时存在，且抑制自噬后凋亡增加，说明Res作用于卵巢癌SKOV3细胞是细胞自噬抑制了细胞凋亡。本发明发现，白藜芦醇在诱导细胞凋亡同时可以引起细胞自噬增加，细胞自噬抑制细胞凋亡，使用自噬抑制剂抑制肿瘤细胞自噬后，细胞凋亡明显增加，希望本实验为抗肿瘤药从细胞毒药物向新型抗肿瘤药物发展以及不同机制共同抗癌提供线索和思路，同时可以为降低卵巢癌化疗耐药提供新的方法。当前第1页1 2 3