一种用于预防金黄色葡萄球菌感染和破伤风的联合疫苗的制作方法

本发明属于基因工程和免疫学技术领域，更具体地，本发明涉及一种含有金黄色葡萄球菌表面蛋白A(Staphylococcus aureussurface protein A,SasA)和破伤风神经毒素C片段(C fragment of tetanus neurotoxin，TeNT-Hc)的双价免疫原组合物及其在抵御金黄色葡萄球菌和破伤风感染中的应用。

背景技术：

金黄色葡萄球菌和破伤风杆菌广泛分布于自然界，任何有开放性伤口的创伤患者都有感染这两种致病菌的可能性。金黄色葡萄球菌能够导致皮肤和软组织感染，以及致命的败血症与侵袭性并发症。破伤风由专性厌氧菌破伤风杆菌引起，其产生的神经毒素能够侵袭神经系统，造成全身性肌肉痉挛甚至窒息死亡。尽管发达国家的破伤风发病率较低，但在世界范围内，破伤风的死亡率为6-72％。另外，在医疗卫生条件有限的发展中国家，新生儿和产妇在分娩的过程中也容易遭受金黄色葡萄球菌感染和破伤风。

联合疫苗是同时防控两种或多种病原体感染的常用策略，能够简化接种方案，增加用户依从性，降低疫苗接种成本。然而，目前还未有针对金黄色葡萄球菌感染和破伤风的联合疫苗的研究报道。抗金黄色葡萄球菌感染和破伤风的联合疫苗适用于易受创伤人群，包括运动员、军人和警察，以及发展中国家育龄妇女。

金黄色葡萄球菌表面蛋白A(SasA)，为金黄色葡萄球菌的细胞壁锚定蛋白，具有2,271个氨基酸。SasA重组蛋白免疫小鼠能够保护金黄色葡萄球菌的致死攻毒。此外，SasA基因在临床菌株中普遍存在，SasA蛋白在金葡菌感染的过程中也会在体内表达。破伤风毒素分子量为150kDa，具有A、B、C三个结构域，分别为N-末端肽链内切酶结构域，转位重链结构域和C-末端受体结合重链结构(破伤风神经毒素C片段，TeNT-Hc)。已有研究表明具有神经节苷脂结合活性的重组TeNT-Hc能够替代现有的破伤风类毒素疫苗(tetanus toxoid，TT)。在安全性、生产便捷性和均一性上，TeNT-Hc都优于破伤风类毒素疫苗。

这些前期研究表明重组蛋白SasA和TeNT-Hc能够作为金黄色葡萄球菌和破伤风杆菌的候选疫苗组分。出于简化接种方案，增加用户依从性，降低疫苗接种成本，提升疫苗保护率的考虑，本领域存在着对能够同时有效预防金黄色葡萄球菌感染和破伤风的联合疫苗的需求，但是目前还没有发现具有明显协同效应的联合疫苗。联合疫苗不等于任何疫苗的随意混合，制备联合疫苗需考虑以下因素：(1)是否会影响各种抗原的免疫原应答效果；(2)不同抗原间是否存在不相容性或相互干扰；(3)不同抗原成分之间是否会发生拮抗效应；(4)疫苗其他成分(如佐剂等)与各种抗原的混合比例是否恰当。另外，联合疫苗的剂型，如液体或冻干粉剂，以及它们混合以后的持续时间，都会影响到疫苗的稳定性。

对于SasA和TeNT-Hc联合使用时是否存在拮抗作用，即在体内产生的抗体反应和保护性是否会相互干扰还犹未可知。本发明的目的就是提供一种具有明显协同效和较高免疫保护率的用于预防金黄色葡萄球菌感染和破伤风的双价联合疫苗及其制备方法。

技术实现要素：

基于上述发明目的，本发明提供了一种双价免疫原联合疫苗，其用于保护宿主抵抗由金黄色葡萄球菌和/或破伤风杆菌引起的疾病，所述疫苗包括金黄色葡萄球菌表面蛋白A和破伤风神经毒素C片段。

在一个优选的技术方案中，所述金黄色葡萄球菌表面蛋白A和破伤风神经毒素C片段均为基因重组蛋白。

在一个更为优选的技术方案中，所述金黄色葡萄球菌表面蛋白A(SasA)为截短的蛋白，所述蛋白是根据报导的Staphylococcus Aureus MASA252株的序列(GenBank：BX571856.1)，设计引物扩增142-999bp为目的片段的序列，为全长蛋白的第28-333位氨基酸区段。其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

更为优选地，所述破伤风神经毒素C片段(TeNT-Hc)的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述根据国内破伤风梭菌C.Tetani强毒株64008株的测序结果(GeneBank序列号：AF154828)，对其核苷酸序列进行分析优化，优化序列如SEQ ID NO.3所示。

又为优选地，在所述联合疫苗中，所述金黄色葡萄球菌表面蛋白A和破伤风神经毒素C片段分别作为独立组分存在。

在一个优选的技术方案中，所述金黄色葡萄球菌表面蛋白A和破伤风神经毒素C片段的重量配比为1:1。

在一个更为优选的技术方案中，所述金黄色葡萄球菌表面蛋白A和破伤风神经毒素C片段均为氢氧化铝所吸附。

在一个再为优选的技术方案中，所述氢氧化铝与金黄色葡萄球菌表面蛋白A和破伤风神经毒素C片段的重量配比为75:1:1。

在一个又为优选的技术方案中，所述疫苗被制备为胶囊剂、冻干剂或者注射剂。

在一个优选的技术方案中，所述金黄色葡萄球菌表面蛋白A和破伤风神经毒素C片段重组蛋白分别被制备为胶囊剂，每种胶囊剂的成分为重组蛋白、N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)、丙烯酰胺(AAm)、甲叉双丙烯酰胺(Bis)，其组合比例为1：20：3000：400，之后每种胶囊再被氢氧化铝吸附。

本发明还提供了一种制备上述联合疫苗的方法，所述方法步骤为：取所述金黄色葡萄球菌表面蛋白A和破伤风神经毒素C片段混合。

本发明提供的SasA和TeNT-Hc的联合疫苗免疫在小鼠体内诱导产生的抗体反应大于单一组分。在小鼠接受免疫的第2、4和6周，联合免疫(SasA+TeNT-Hc)诱导产生的SasA IgG效价分别是SasA单组分免疫的3.083倍(p＝0.0210)、3.013倍(p＝0.0053)和3.365倍(p＝0.0077)。联合免疫(SasA+TeNT-Hc)诱导产生的TeNT-Hc IgG效价分别是TeNT-Hc单组分免疫的2.183倍(p＝0.0342)、2.594倍(p＝0.0124)和2.377倍(p＝0.0089)，表明SasA和TeNT-Hc的联合免疫诱导产生的抗体反应具有协同效应。在小鼠金黄色葡萄球菌和破伤风毒素攻毒模型中，联合疫苗也显示出更高的保护性。SasA单组分(p＝0.0467)和TeNT-Hc+SasA的联合免疫(p＝0.0001)对小鼠都具有保护性，且联合免疫的保护效果高于SasA单组分(p＝0.0417)，表明TeNT-Hc+SasA的联合免疫对金黄色葡萄球菌感染的保护具有协同作用。另外，TeNT-Hc单组分(p<0.0001)和TeNT-Hc+SasA的联合免疫(p<0.0001)对小鼠都具有保护性，且联合免疫的保护效果高于TeNT-Hc单组分，表明TeNT-Hc+SasA的联合免疫对破伤风的保护也具有协同作用。而且，本发明提供的SasA和TeNT-Hc联合疫苗经过纳米胶囊的修饰，热稳定性得到进一步的提高，保护效价也获得了显著的提高。

附图说明

图1.SasA和TeNT-Hc+SasA联合疫苗在小鼠体内诱导产生的IgG抗体水平柱状分析图；

图2.TeNT-Hc和TeNT-Hc+SasA联合疫苗在小鼠体内诱导产生的IgG抗体水平柱状分析图；

图3.SasA和TeNT-Hc+SasA联合疫苗对小鼠金黄色葡萄球菌感染模型保护性的存活曲线图；

图4.TeNT-Hc和TeNT-Hc+SasA联合疫苗在小鼠破伤风模型中的保护性的存活曲线图；

图5.TeNT-Hc+SasA及纳米胶囊联合疫苗诱导产生的SasA IgG抗体水平柱状分析图；

图6.TeNT-Hc+SasA及纳米胶囊联合疫苗诱导产生的TeNT-Hc抗体水平柱状分析图

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

实施例1.重组的金黄色葡萄球菌截短SasA蛋白的制备

有关重组的金黄色葡萄球菌截短SasA蛋白的获得参见中国专利申请CN102268444A，本发明以引用的形式将CN102268444A的公开内容并入到本发明说明书中，以下简要说明制备方法。

1.根据报导的Staphylococcus Aureus MASA252株的序列(GenBank：BX571856.1)，设计引物扩增142-999bp为目的片段的序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，为全长蛋白的第28-333位氨基酸区段。在SasA序列的两端分别加入NdeI和XhoI酶切位点，并去除终止密码子，在3’端引入编码6个组氨酸的序列。

2.将扩增得到的SasA基因用NdeI和XhoI双酶切后，连接入同样用NdeI和XhoI双酶切后的表达载体pET21a(+)上，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，37℃培养过夜。次日挑取单克隆于5mL LB(Amp+)培养基中，37℃，220rpm培养12h，提取质粒，测序正确的质粒命名为pET21a-SasA。

3.金黄色葡萄球菌截短SasA的大肠杆菌表达及Western-blot鉴定

正确连接入SasA基因的pET21a(+)载体，转化大肠杆菌感受态细胞BL₂₁(DE₃)，挑取单克隆于5mL LB(Amp+)液体培养基中，37℃，220rpm培养至OD600nm≌0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，28℃，220rpm继续培养6h。5,000g，4℃离心收集菌体，用PBS重悬后超声碎菌。12,000g，4℃离心取上清，行SDS-PAGE电泳，鉴定大小为40kDa的SasA蛋白的表达，Western-bolt结果验证该蛋白可与鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性的结合。

4.表达SasA蛋白的种子液1L，转接入30L发酵罐中，培养至OD600nm≌0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，37℃，300rpm继续培养6h。10,000g，4℃离心收集菌体，用20mMTris-HCl缓冲液(pH8.5)重悬后匀浆碎菌。20,000g，4℃离心收集上清。上清液过QFF柱进行阴离子交换，流出液用20mM NaH₂PO₄，0.5M NaCl(pH7.4)3倍稀释后进行镍柱纯化，用20mM NaH₂PO₄，0.5M NaCl，0.5M咪唑(pH7.4)进行连续梯度洗脱。经过两步纯化后，目的蛋白SasA得到了很好的纯化，纯度可达85％以上，目的蛋白最终保存在PBS缓冲液中备用于以下的免疫实验。

实施例2.重组的破伤风神经毒素C片段(TeNT-Hc)的制备

有关重组的TeNT-Hc蛋白的获得参见中国专利CN101880675B，本发明以引用的形式将CN101880675B的公开内容并入到本发明说明书中，以下简要说明制备方法。

1.根据国内破伤风梭菌C.Tetani强毒株64008株的测序结果(GeneBank序列号：AF154828)，对451Aa的Tet-Hc序列进行分析优化，优化序列如SEQ ID NO.3所示，进行全基因合成。

2.破伤风毒素亚单位疫苗Hc表达载体构建

将优化合成后的Tet-Hc基因用EcoRI和XhoI双酶切后，连接入同样用EcoRI和XhoI双酶切后的表达载体pET32a(+)上，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，37℃培养过夜。次日挑取单克隆于5mLLB(Amp+)培养基中，37℃，220rpm培养12h，提取质粒，EcoRI和XhoI双酶切鉴定目的基因的插入，并送测序。测序正确的质粒命名为pET32a-Tet-Hc。

3.破伤风毒素重组亚单位疫苗Hc的大肠杆菌表达及Western-blot鉴定

正确连接入Tet-Hc基因的pET32a(+)载体，转化大肠杆菌感受态细胞BL₂₁(DE₃)，挑取单克隆于5mLLB(Amp+)液体培养基中，37℃，220rpm培养至OD600nm≌0.6时，加入终浓度为0.2mM的IPTG，28℃，220rpm继续培养6h。5,000g，4℃离心收集菌体，用PBS重悬后超声碎菌。12,000g，4℃离心取上清，行SDS-PAGE电泳，鉴定大小为50KD的Hc蛋白的表达。Western-blot结果证实该蛋白可与鼠抗破伤风单克隆抗体发生特异性的结合。

4.破伤风毒素亚单位疫苗Hc的大肠杆菌发酵及纯化

表达Hc蛋白的种子液1L，转接入30L发酵罐中，培养至OD600nm≌0.6时，加入终浓度为0.2mM的IPTG，28℃，300rpm继续培养6h。10,000g，4℃离心收集菌体，用20mMTris-HCl缓冲液(pH8.5)重悬后匀浆碎菌。20,000g，4℃离心收集上清。上清液过QFF柱进行阴离子交换，用20mMTris-HCl缓冲液(pH8.5)平衡后，用含0-0.5MNaCl的Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱。含有目的蛋白的洗脱液加入终浓度为0.5M的(NH₄)₂SO₄后，过苯基疏水柱进行下一步纯化。目的蛋白用含浓度0.5-0M的(NH₄)₂SO₄的Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱。含有目的蛋白的洗脱液用脱盐柱置换缓冲液为20mMNaAc(pH4.0)后，过SP柱进行阳离子交换，目的蛋白用含0-0.5MNaCl的20mMNaAc(pH4.0)缓冲液进行梯度洗脱。经过三步纯化后，无标签的目的蛋白Hc得到了很好的纯化，纯度可达95％以上，得率在300mg/L以上，目的蛋白最终保存在PBS缓冲液中备用于以下的免疫实验。

实施例3.SasA和TeNT-Hc联合疫苗的免疫源性研究

用0.75mg氢氧化铝佐剂分别吸附以下抗原：10μgrSasA，10μgTeNT-Hc，10μgrSasA+10μgTeNT-Hc。未吸附抗原的0.75mg氢氧化铝佐剂用作阴性对照。在第0、2和4周，上述四组抗原分别采用腹腔注射方式免疫雌性BALB/c小鼠(年龄6-8周)，每组10只。在第2、4和6周尾静脉抽取血样并提取血清。

通过酶联免疫吸附测定(ELISA)分析抗原特异性的IgG的血清抗体效价。2μg/ml的rSasA或TeNT-Hc 4℃过夜包被96孔酶联板，包被缓冲液为50mM碳酸盐缓冲液(pH9.6)。用含有2％(w/v)牛血清白蛋白的PBS在37℃温育封闭1小时。将梯度稀释的血清加入酶联板，37℃温育1小时，随后用PBST(含有0.05％Tween 20的PBS)清洗3次。加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体，37℃温育1小时，PBST清洗3次。加入TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺二盐酸盐)底物黑暗中温育10分钟。2M硫酸终止显色反应，并在酶标仪中读取450nm处的光吸收值(A₄₅₀)。抗体阳性反应设定为A₄₅₀大于未免疫血清平均值的两倍。ELISA抗体滴度表示为显示阳性反应的最高血清稀释度。统计分析采用双侧非配对t检验。

在第2、4和6周，联合免疫(SasA+TeNT-Hc)诱导产生的SasA IgG效价分别是SasA单组分免疫的3.083倍(p＝0.0210)、3.013倍(p＝0.0053)和3.365倍(p＝0.0077)(图1)。联合免疫(SasA+TeNT-Hc)诱导产生的TeNT-Hc IgG效价分别是TeNT-Hc单组分免疫的2.183倍(p＝0.0342)、2.594倍(p＝0.0124)和2.377倍(p＝0.0089)(图2)。结果表明SasA和TeNT-Hc的联合免疫诱导产生的抗体反应具有协同效应。

实施例4.在小鼠金黄色葡萄球菌感染模型中TeNT-Hc+SasA联合疫苗的保护性研究

过夜培养金黄色葡萄球菌菌株USA300，1:100稀释于TSB培养液，37℃培养至对数中期。在初次免疫后6周，腹腔攻毒3次免疫的小鼠，攻毒剂量为3×10⁹CFU的USA300。在5天的时间内观测小鼠存活情况，采用log rank Mantel-Cox检验分析存活曲线。结果为对照组小鼠全部死亡，SasA单组分(p＝0.0467)和TeNT-Hc+SasA的联合免疫(p＝0.0001)对小鼠都具有保护性，且联合免疫的保护效果高于SasA单组分(p＝0.0417)(图3)。结果表明TeNT-Hc+SasA的联合免疫对金黄色葡萄球菌感染的保护具有协同作用。

实施例5.在小鼠破伤风模型中TeNT-Hc+SasA联合疫苗的保护性研究

在初次免疫后6周，皮下注射2×10³LD₅₀的破伤风神经毒素攻毒3次免疫的小鼠。在5天的时间内观测小鼠存活情况，采用log rank Mantel-Cox检验分析存活曲线。结果为对照组小鼠全部死亡，TeNT-Hc单组分(p<0.0001)和TeNT-Hc+SasA的联合免疫(p<0.0001)对小鼠都具有保护性(图4)，且联合免疫的保护效果高于TeNT-Hc单组分，但因为小鼠生存率均高于90％，统计上无差异。结果表明TeNT-Hc+SasA的联合免疫对破伤风的保护具有协同作用。

实施例6.SasA和TeNT-Hc纳米胶囊联合疫苗的热稳定性研究

实施例5已经证实SasA和TeNT-Hc的重组亚单位联合疫苗对金黄色葡萄球菌感染和破伤风具有良好的保护作用，所述联合疫苗可被制备为溶液注射剂、冻干剂等进行使用。但是给予这些药剂形式的传统疫苗的热稳定性不佳，若缺少冷链，疫苗的抗原性和有效性会受到极大影响。本发明尝试将纳米胶囊用于疫苗的制备，能够提高疫苗在常温条件下的稳定性，从而有潜力降低疫苗的运输和保存成本。

SasA和TeNT-Hc纳米胶囊分别称为n(SasA)和n(TeNT-Hc)，制备方法如下：

SasA或TeNT-Hc重组蛋白稀释于50mM硼酸盐缓冲液(pH 8.5)，与N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)在室温共温育2小时(每种重组蛋白与NAS摩尔比为1：20)。随后加入丙烯酰胺(AAm)、甲叉双丙烯酰胺(Bis)(每种重组蛋白与AAm、Bis的摩尔比为1：3000：400)，再加入适量过硫酸铵和四甲基乙二胺引发自由基聚合反应，室温反应1小时后透析换液至PBS缓冲液。

将等比例混合的SasA+TeNT-Hc和n(SasA)+n(TeNT-Hc)在37℃条件下保存7天，之后用氢氧化铝佐剂吸附。在第0和2周，上述2组抗原分别采用腹腔注射方式免疫雌性BALB/c小鼠(年龄6-8周)，每组10只。在第4周尾静脉抽取血样并提取血清。如之前所述通过酶联免疫吸附测定(ELISA)分析抗原特异性IgG的血清抗体效价。纳米胶囊联合疫苗n(SasA)+n(TeNT-Hc)诱导产生的SasAIgG效价和TeNT-Hc效价分别是SasA+TeNT-Hc免疫的27.86倍(p<0.001)(图5，图5中1为SasA+TeNT-Hc，2为n(SasA)+n(TeNT-Hc))和32.00倍(p<0.001)(图6，图6中1为SasA+TeNT-Hc，2为n(SasA)+n(TeNT-Hc))。结果表明纳米胶囊修饰显著提高了SasA和TeNT-Hc联合疫苗的热稳定性。

纳米胶囊是一种对生物大分子进行纳米材料修饰的技术，能够在重组蛋白表面聚合出高分子保护层。实施例6的实验结果证实本发明提供的SasA和TeNT-Hc纳米胶囊联合疫苗具有较强的稳定性，能够进一步提高TeNT-Hc+SasA联合疫苗的保护效价。

序 列 表

<110> 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所

<120> 一种用于预防金黄色葡萄球菌感染和破伤风的联合疫苗

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 882

<212> DNA

<213> Staphylococcus aureus

<400> 1

atgagtcata gtttagtgag tcaagataat caaagcatta gtaaaaaaat aacgggatac 60

ggactgaaaa ctacagcggt tattggtggt gcattcacag taaacatgtt gcatgaccag 120

caagcttttg cggcttctga tgcaccttta acatctgaat taaacacgca aagtgaaacc 180

gtaggcaatc aaaactcaac gacaatcgaa gcatcaacat caacaaccga ttctactagc 240

gtaacgaaaa atagcagttc ggaacaaaca tcaaatagtg acacagtctc aagtgaaaag 300

tctgaaaatg tcacttcgac aactaatagt acaagcaatc aacaagaaaa attgacatct 360

acatctgaat caacatcccc aaagaatact acatcaagtt ctgatactaa atctgtaaca 420

tcaatttcaa gtacagacca acaaactaat acatcaacaa atcaaagtac tgcatcaaat 480

actacttcac aaagcacaac gccagcttca gccaatttaa acaaaactag tacaacgtca 540

accagcacag cacctatcaa acttcgaact ttcagtcgat tagctatgtc aacttttgca 600

tcagctgcaa cgacaagtgc agtaaccgct aatacgatta cggttaataa agataacctc 660

aaacaatata tgacaacgtc aggtaatgct acttatgatc aaagtaccgg tattgtgacg 720

ttaacgcagg atgcatacag ccaaaaaggt gctattacat taggaacacg tattgactct 780

aataaaagtt ttcatttttc tggaaaagta aatttaggta ataaatacga aggtaatgga 840

aatggtggag atggtatcct cgagcaccac caccaccacc ac 882

<210> 2

<211> 294

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 2

Met Ser His Ser Leu Val Ser Gln Asp Asn Gln Ser Ile Ser Lys Lys

1 5 10 15

Ile Thr Gly Tyr Gly Leu Lys Thr Thr Ala Val Ile Gly Gly Ala Phe

20 25 30

Thr Val Asn Met Leu His Asp Gln Gln Ala Phe Ala Ala Ser Asp Ala

35 40 45

Pro Leu Thr Ser Glu Leu Asn Thr Gln Ser Glu Thr Val Gly Asn Gln

50 55 60

Asn Ser Thr Thr Ile Glu Ala Ser Thr Ser Thr Thr Asp Ser Thr Ser

65 70 75 80

Val Thr Lys Asn Ser Ser Ser Glu Gln Thr Ser Asn Ser Asp Thr Val

85 90 95

Ser Ser Glu Lys Ser Glu Asn Val Thr Ser Thr Thr Asn Ser Thr Ser

100 105 110

Asn Gln Gln Glu Lys Leu Thr Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ser Pro Lys

115 120 125

Asn Thr Thr Ser Ser Ser Asp Thr Lys Ser Val Thr Ser Ile Ser Ser

130 135 140

Thr Asp Gln Gln Thr Asn Thr Ser Thr Asn Gln Ser Thr Ala Ser Asn

145 150 155 160

Thr Thr Ser Gln Ser Thr Thr Pro Ala Ser Ala Asn Leu Asn Lys Thr

165 170 175

Ser Thr Thr Ser Thr Ser Thr Ala Prp Ile Lys Leu Arg Thr Phe Ser

180 185 190

Arg Leu Ala Met Ser Thr Phe Ala Ser Ala Ala Thr Thr Ser Ala Val

195 200 205

Thr Ala Asn Thr Ile Thr Val Asn Lys Asp Asn Leu Lys Gln Tyr Met

210 215 220

Thr Thr Ser Gly Asn Ala Thr Tyr Asp Gln Ser Thr Gly Ile Val Thr

225 230 235 240

Leu Thr Gln Asp Ala Tyr Ser Gln Lys Gly Ala Ile Thr Leu Gly Thr

245 250 255

Arg Ile Asp Ser Asn Lys Ser Phe His Phe Ser Gly Lys Val Asn Leu

260 265 270

Gly Asn Lys Tyr Glu Gly Asn Gly Asn Gly Gly Asp Gly Ile Leu Glu

275 280 285

His His His His His His

290

<210> 3

<211> 1353

<212> DNA

<213> Clostridium tetani

<400> 3

aaaaaccttg attgttgggt cgacaacgaa gaagacatcg atgttatcct gaaaaagtct 60

accattctga acttggacat caacaacgat attatctccg acatctctgg tttcaactcc 120

tctgttatca catatccaga tgctcaattg gtgccgggca tcaacggcaa agctatccac 180

ctggttaaca acgaatcttc tgaagttatc gtgcacaagg ccatggacat cgaatacaac 240

gacatgttca acaacttcac cgttagcttc tggctgcgcg ttccgaaagt ttctgcttcc 300

cacctggaac agtacgacac taacgagtac tccatcatca gctctatgaa gaaatactcc 360

ctgtccatcg gctctggttg gtctgtttcc ctgaagggta acaacctgat ctggactctg 420

aaagactccg cgggcgaagt tcgtcagatc actttccgcg acctgtctga caagttcaac 480

gcgtacctgg ctaacaaatg ggttttcatc actatcacta acgatcgtct gtcttctgct 540

aacctgtaca tcaacggcgt tctgatgggc tccgctgaaa tcactggtct gggcgctatc 600

cgtgaggaca acaacatcac tcttaagctg gaccgttgca acaacaacaa ccagtacgta 660

tccatcgaca agttccgtat cttctgcaaa gcactgaacc cgaaagagat cgaaaaactg 720

tataccagct acctgtctat caccttcctg cgtgacttct ggggtaaccc gctgcgttac 780

gacaccgaat attacctgat cccggtagct tacagctcta aagacgttca gctgaaaaac 840

atcactgact acatgtacct gaccaacgcg ccgtcctaca ctaacggtaa actgaacatc 900

tactaccgac gtctgtacag cggcctgaaa ttcatcatca aacgctacac tccgaacaac 960

gaaatcgatt ctttcgttcg ctctggtgac ttcatcaaac tgtacgtttc ttacaacaac 1020

aacgaacaca tcgttggtta cccgaaagac ggtaacgctt tcaacaacct ggacagaatc 1080

ctaagagtag gttacaacgc tccgggtatc ccgctgtaca aaaaaatgga agctgttaaa 1140

ctgcgtgacc tgaaaaccta ctctgttcag ctgaaactgt acgacgacaa agatgcttct 1200

ctgggtctgg ttggcaccca caacggtcag atcggtaacg acccgaaccg tgacatcctg 1260

atcgcttcta actggtactt caaccacctg aaagacaaaa ccctgacctg cgactggtac 1320

ttcgttccga ccgatgaagg ttggaccaac gac 1353

<210> 4

<211> 451

<212> PRT

<213> Clostridium tetani

<400> 4

Lys Asn Leu Asp Cys Trp Val Asp Asn Glu Glu Asp Ile Asp Val Ile

1 5 10 15

Leu Lys Lys Ser Thr Ile Leu Asn Leu Asp Ile Asn Asn Asp Ile Ile

20 25 30

Ser Asp Ile Ser Gly Phe Asn Ser Ser Val Ile Thr Tyr Pro Asp Ala

35 40 45

Gln Leu Val Pro Gly Ile Asn Gly Lys Ala Ile His Leu Val Asn Asn

50 55 60

Glu Ser Ser Glu Val Ile Val His Lys Ala Met Asp Ile Glu Tyr Asn

65 70 75 80

Asp Met Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys

85 90 95

Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gln Tyr Asp Thr Asn Glu Tyr Ser Ile

100 105 110

Ile Ser Ser Met Lys Lys Tyr Ser Leu Ser Ile Gly Ser Gly Trp Ser

115 120 125

Val Ser Leu Lys Gly Asn Asn Leu Ile Trp Thr Leu Lys Asp Ser Ala

130 135 140

Gly Glu Val Arg Gln Ile Thr Phe Arg Asp Leu Ser Asp Lys Phe Asn

145 150 155 160

Ala Tyr Leu Ala Asn Lys Trp Val Phe Ile Thr Ile Thr Asn Asp Arg

165 170 175

Leu Ser Ser Ala Asn Leu Tyr Ile Asn Gly Val Leu Met Gly Ser Ala

180 185 190

Glu Ile Thr Gly Leu Gly Ala Ile Arg Glu Asp Asn Asn Ile Thr Leu

195 200 205

Lys Leu Asp Arg Cys Asn Asn Asn Asn Gln Tyr Val Ser Ile Asp Lys

210 215 220

Phe Arg Ile Phe Cys Lys Ala Leu Asn Pro Lys Glu Ile Glu Lys Leu

225 230 235 240

Tyr Thr Ser Tyr Leu Ser Ile Thr Phe Leu Arg Asp Phe Trp Gly Asn

245 250 255

Pro Leu Arg Tyr Asp Thr Glu Tyr Tyr Leu Ile Pro Val Ala Tyr Ser

260 265 270

Ser Lys Asp Val Gln Leu Lys Asn Ile Thr Asp Tyr Met Tyr Leu Thr

275 280 285

Asn Ala Pro Ser Tyr Thr Asn Gly Lys Leu Asn Ile Tyr Tyr Arg Arg

290 295 300

Leu Tyr Ser Gly Leu Lys Phe Ile Ile Lys Arg Tyr Thr Pro Asn Asn

305 310 315 320

Glu Ile Asp Ser Phe Val Arg Ser Gly Asp Phe Ile Lys Leu Tyr Val

325 330 335

Ser Tyr Asn Asn Asn Glu His Ile Val Gly Tyr Pro Lys Asp Gly Asn

340 345 350

Ala Phe Asn Asn Leu Asp Arg Ile Leu Arg Val Gly Tyr Asn Ala Pro

355 360 365

Gly Ile Pro Leu Tyr Lys Lys Met Glu Ala Val Lys Leu Arg Asp Leu

370 375 380

Lys Thr Tyr Ser Val Gln Leu Lys Leu Tyr Asp Asp Lys Asp Ala Ser

385 390 395 400

Leu Gly Leu Val Gly Thr His Asn Gly Gln Ile Gly Asn Asp Pro Asn

405 410 415

Arg Asp Ile Leu Ile Ala Ser Asn Trp Tyr Phe Asn His Leu Lys Asp

420 425 430

Lys Thr Leu Thr Cys Asp Trp Tyr Phe Val Pro Thr Asp Glu Gly Trp

435 440 445

Thr Asn Asp

450