发明属于医药化工领域，具体涉及环维黄杨星D及其药学上可接受的盐在制备预防或治疗缺血性脑卒中药物中的应用，包括改善因缺血所致的神经功能损伤、保护脑卒中引起的神经细胞损伤、缩小了脑梗死范围、保护脑损、减小脑水肿、抗氧化作用、改善急性全脑缺血再灌注损伤以及局灶性脑缺血再灌注损伤。
背景技术：
：维黄杨星D是一种生物碱(结构式见下图)，属甾体生物碱，可从黄杨科植物小叶黄杨及其同属植物中提取，具有降低心肌耗氧量，增强心肌收缩力，增加冠状动脉血流量，防止心律失常，缓解心绞痛等，疗效确切。目前环维黄杨星D已被《中国药典》(2015版)一部按药植物油脂和提取物收录，用环维黄杨星D制成的口服片剂已被《中国药典》(2015版)一部按成方制剂和单味制剂收载，具有行气活血，通络止痛，用于气滞血瘀所致的胸痹心痛、脉结代；冠心病、心律失常见上述证候者。国内迄今上市的环维黄杨星D制剂仅有的黄杨宁片，批准约有十家生产厂家，规格有0.5mg和1mg/片，日剂量为2-6mg/天，其主要的适应症是用于冠心病、心律失常。黄杨宁片具有口服起效慢，生物利用度低、有心脏蓄积毒性，血药浓度达峰时间长的缺点，临床多用于轻中度患者的治疗，不利于重度患者和吞咽困难的患者的治疗。CN20111017742.6公开了一种天然药物环维黄杨星D衍生物、其制备方法及其用途，药效学试验结果显示这些化合物及其衍生物能够有效治疗心脑血管疾病的作用，主要用于治疗心绞痛、心律失常、高血压或高血脂症。CN01133058.9公开了一种环维黄杨星D的可溶性无机盐，其制备及含它们的药物制剂。该发明涉及环维黄杨星D的水溶性无机盐的制备方法及其注射液在治疗冠心病和心律失常方面中的用途。CN02148452公开了一种环维黄杨星D盐制剂及其制备方法，主要是以环维黄杨星D为主药，配合盐酸或磷酸和磷酸二氢钠及甘露醇制成注射液，其中环维黄杨星D转化成盐酸盐或磷酸盐。该制剂通过静脉给药，治疗心脑血管疾病，具有行气活血，通络止痛的功效，主治胸痹心痛，冠心病、心绞痛。目前，关于环维黄杨星D的临床适应症均是治疗心绞痛、冠心病和心律失常等心脏方面疾病，开发环维黄杨星D在其他疾病的治疗效果是具有重大临床治疗意义的。技术实现要素：本发明针对现有技术不足，公开了环维黄杨星D及其药学上可接受的盐在制备预防或治疗缺血性脑卒中药物中的新应用，包括改善因缺血所致的神经功能损伤(包括运动和感觉神经)；缩小脑梗死范围，减小脑水肿；保护脑卒中引起的神经细胞损伤，改善急性全脑缺血再灌注损伤以及局灶性脑缺血再灌注损伤，可用于治疗缺血性脑卒中。本发明具体技术方案如下：本发明的目的在于公开一种环维黄杨星D及其药学上可接受的盐在制备预防或治疗缺血性脑卒中药物中的新应用。为改善环维黄杨星D的水溶性，其药学上可接受的盐优选盐酸盐、硫酸盐或磷酸盐。可采用口服或注射方式给药，优选静脉滴注或静脉注射方式给药。“脑卒中”(cerebralstroke)又称“中风”、“脑血管意外”(cerebralvascularaccident，CVA)，是一种急性脑血管疾病，是由于脑部血管突然破裂或因血管阻塞导致血液不能流入大脑而引起脑组织损伤的一组疾病，包括缺血性和出血性卒中，具有发病急，病情危重，后遗症严重，致残率高合并症多的特点。脑中风是影响人类健康的主要的疾病之一，是中老年人群的常见病和多发病。依达拉奉是一种脑保护剂(自由基清除剂)可清除自由基，抑制脂质过氧化，从而抑制脑细胞、血管内皮细胞、神经细胞的氧化损伤。盐酸川芎嗪主要用于治疗缺血性脑血管病如脑供血不全，脑血栓形成，脑栓塞及其它缺血性血管疾病如冠状动脉粥样硬化性心脏病、脉管炎等。本发明研究将环维黄杨星D与依达拉奉注射液和注射用盐酸川芎嗪进行对比研究，发现其在改善因缺血所致的神经功能损伤(包括运动和感觉神经)、缩小脑梗死范围、减小脑水肿、提高超氧化物歧化酶SOD活力、抗氧化作用、保护脑卒中引起的神经细胞损伤等方面的作用明显优于依达拉奉注射液和注射用盐酸川芎嗪，且口服效果不及静脉给药。长春西汀具有改善脑梗塞后遗症、脑出血后遗症、脑动脉硬化症等诱发的各种症状。本发明研究将环维黄杨星D与依达拉奉注射液和长春西汀注射液进行对比研究，发现其能显著改善大鼠急性全脑缺血再灌注引起的神经功能损伤和大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤。附图说明图1为实施例6大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤实验各给药组大鼠脑梗死范围。具体实施方式在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，该实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。下述实例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例1环维黄杨星D对大鼠脑神经功能的影响1、模型制备SD大鼠(SPF级，雄性，体重298.4±10.1(276～321)g)，通过VMR台式小动物麻醉机(美国Matrx公司产品)以异氟烷气体麻醉，侧卧位固定。于外耳道与眼眦连线中点切开皮肤，逐层分离肌肉，暴露颧弓和颞骨鳞部，铰断颧弓，在手术显微镜下，于颧弓和颞骨鳞部前连接处的前下方约2mm处，用牙科钻开2mm直径小颅窗，暴露大脑中动脉，将一小块滤纸敷于中动脉处，将10μl的50％FeCl3滴于滤纸片上，30min后将滤纸片取出，并用生理盐水清洗干净，加2～3滴青霉素液(1.6×105U/mL)，以防伤口感染，逐层缝合，回笼饲养。假手术组除不滴加FeCl3外，其余操作与其它动物相同。2、分组及给药选取造模成功的动物80只，采用随机数字表法随机分为8组，每组10只。分别为模型组、受试药5个剂量组、阳性药依达拉奉注射液(扬州制药有限公司，规格20ml：30mg)组、盐酸川芎嗪注射液(合肥平光制药有限公司，每瓶80mg，白色粉末)组。受试药分为静脉输注组、口服给药组，静脉输注组给予环维黄杨星D4个剂量，分别为0.125、0.25、0.5和1mg/kg，口服给药组给予环维黄杨星D1个剂量(po)，为0.5mg/kg，依达拉奉注射液静脉输注组，剂量为6.0mg/kg，注射用盐酸川芎嗪静脉输注组，剂量为12.4mg/kg，另设10只假手术组。试药均为临用前用生理盐水稀释至所需浓度供静脉给药用。给药体积为4ml/kgBW，输注时间30min。假手术组和模型对照组给予等体积生理盐水。3、对神经功能的影响动物分别于给药前、给药后24h根据表1评分标准采用盲法进行神经功能损害程度评分，总分为16分。数据均表示为均数±标准差表示，两组间比较用student’st-test，P<0.05为差异有统计学意义，结果如表2所示。表1MCAO大鼠神经功能损害程度评分标准表2环维黄杨星D对脑缺血大鼠神经功能损害程度的影响(n＝10)注：1.括号内为与给药前的差值；2.与假手术组比较：△△△P<0.001；3.与模型对照组比较：*P<0.05；4.临床等剂量的环维黄杨星D静脉与口服比较：P>0.05.5.临床等效剂量的环维黄杨星D与依达拉奉比较：P>0.05.6.临床等效剂量的环维黄杨星D与盐酸川芎嗪比较：P>0.05.结果表明，模型组动物与假手术组动物的评分比较有明显差异。静脉给予环维黄杨星D0.125、0.25、0.5、1mg/kg，与模型对照组比较，其受损的神经功能障碍评分分别减少3.6％(P<0.05)、6.7％(P>0.05)、9.7％(P<0.05)、9.5％(P<0.05)，口服给予环维黄杨星D0.5mg/kg，其受损的神经功能障碍评分减少7.8％(P<0.01)。给予依达拉奉6.0mg/kg，与模型对照组比较，神经功能损害程度评分减轻10.8％(P<0.05)，给予盐酸川芎嗪注射液治疗后神经功能损害程度评分减轻3.5％(P>0.05)。结果表明，FeCl3诱导的大脑中动脉血栓形成引起的的局灶性脑梗塞损伤模型大鼠静脉给予环维黄杨星D后，神经功能损害程度评分有不同程度改善，并有一定的剂量依赖性，静脉给药优于口服给药。治疗效果与依达拉奉相当，优于盐酸川穹嗪。实施例2环维黄杨星D对大鼠脑死范围的影响实施例1实验结束后取脑，迅速冰冻，沿冠状面切成2mm厚的切片，间隔取上述一半脑片放入2％红四氮唑(TTC，Solarbio产品)染液中，避光37℃温孵10min进行染色，采用数码相机成像系统将数字影象存储于计算机中，并用图象分析系统v4.0软件(CMIAS病理图像采集与分析系统,北京航空航天大学图象中心产品)测量梗死区和全脑面积，计算脑梗死范围(梗死区面积占全脑面积百分比)。数据均表示为均数±标准差表示，两组间比较用student’st-test，P<0.05为差异有统计学意义。结果见表3。表3环维黄杨星D对大鼠脑梗死范围的影响(n＝10)注：1.与假手术组比较：△△△P<0.001；2.与模型对照组比较：*P<0.05，**P<0.01；3.临床等剂量的环维黄杨星D静脉与口服比较：P>0.05.4.临床等效剂量的环维黄杨星D与依达拉奉比较：P>0.05.5.临床等效剂量的环维黄杨星D与盐酸川芎嗪比较：P>0.05.结果表明，模型组动物与假手术组动物比较梗塞范围明显增加。给予环维黄杨星D0.125、0.25、0.5和1.0mg/kg，与模型对照组比较，脑梗死范围分别减小17.3％(P>0.05)、28.6％(P<0.05)、35.7％(P<0.05)、36.8％(P<0.01)。口服给予环维黄杨星D0.5mg/kg脑梗死范围减小23.8％(P>0.05)；给予依达拉奉6.0mg/kg，与模型对照组比较，脑梗死范围减小38.3％(P<0.01)；给予盐酸川芎嗪12.4mg/kg，脑梗死范围减小23.2％(P>0.05)。结果表明，FeCl3诱导的大脑中动脉血栓形成引起的的局灶性脑梗塞损伤模型大鼠静脉给予环维黄杨星D后，脑梗死范围有不同程度改善，并有一定的剂量依赖性，同等剂量静脉给药优于口服给药。治疗效果与依达拉奉相当，优于盐酸川穹嗪。实施例3环维黄杨星D对大鼠脑水肿的影响实施例2中另一半脑片进行干湿重法脑含水量测试：取另一半脑片称重后，置于50℃烘箱中烤至恒重，称量其干重，计算脑含水量。按以下公式计算：脑含水量(％)＝(湿重-干重)/湿重×100％。数据均表示为均数±标准差表示，两组间比较用student’st-test，P<0.05为差异有统计学意义。结果见表4。表4环维黄杨星D对大鼠脑水肿的影响(n＝10)注：1.与假手术组比较：△△△P<0.001；2.与模型对照组比较：*P<0.05，**P<0.01；3.临床等剂量的环维黄杨星D静脉与口服比较：P>0.05.4.临床等效剂量的环维黄杨星D与依达拉奉比较：P>0.05.5.临床等效剂量的环维黄杨星D与盐酸川芎嗪比较：P>0.05.结果表明，静脉给予环维黄杨星D0.125、0.25、0.5和1.0mg/kg，与模型对照组比较，脑水肿程度分别减轻1.3％(P>0.05)、1.8％(P<0.05)、2.4％(P<0.05)、2.7％(P<0.01)，口服给予环维黄杨星D0.5mg/kg脑水肿程度减轻0.7％(P>0.05)；给予依达拉奉6.0mg/kg，与模型对照组比较，脑水肿程度减轻2.9％(P<0.01)；给予盐酸川芎嗪12.4mg/kg，与模型对照组比较，脑水肿程度减轻2.3％(P<0.01)。结果表明，大鼠脑缺血后出现明显脑水肿。静脉给予环维黄杨星D后，脑水肿程度有不同程度改善，并有一定的剂量依赖性，同等剂量静脉给药优于口服给药。脑水肿的治疗效果与依达拉奉和盐酸川穹嗪相当。实施例4环维黄杨星D对大鼠氧化应激因子水平的影响实施例1实验结束后腹主动脉取血，分离血清，TBA法测定血清MDA，羟胺法测定血清SOD。数据均表示为均数±标准差表示，两组间比较用student’st-test，P<0.05为差异有统计学意义。结果见表5。表5环维黄杨星D对脑缺血大鼠氧化应激因子水平的影响(n＝10)注：1.与假手术组比较：△△P<0.01，△△△P<0.001；2.与模型对照组比较：*P<0.05，***P<0.01，***P<0.001；3.临床等剂量的环维黄杨星D静脉与口服比较：#P<0.05。4.临床等效剂量的环维黄杨星D与依达拉奉比较：P>0.05。5.临床等效剂量的环维黄杨星D与盐酸川芎嗪比较：#P<0.05。结果表明，静脉给予环维黄杨星D0.125、0.25、0.5和1.0mg/kg后，与模型对照组比较，MDA分别降低了1.7％(P>0.05)、19.4％(P<0.01)、27.2％(P<0.001)、28.1％(P<0.001)；口服给予环维黄杨星D0.5mg/kgMDA降低10.9％(P>0.05)；给予依达拉奉6.0mg/kg和盐酸川芎嗪12.4mg/kg，MDA分别降低了34.6％(P<0.001)、7.2％(P>0.05)。静脉给予环维黄杨星D0.125、0.25、0.5和1.0mg/kg后，与模型对照组比较，SOD分别增加了2.3％(P>0.05)、25.3％(P<0.05)、30.2％(P<0.05)、23.2％(P<0.05)；口服给予环维黄杨星D0.5mg/kgSOD增加了16.7％(P>.05)；给予依达拉奉6.0mg/kg和盐酸川芎嗪12.4mg/kg，SOD分别增加了34.5％(P<0.05)、19.6％(P>0.05)。结果表明，FeCl3诱导的大脑中动脉血栓形成引起的的局灶性脑梗塞损伤模型大鼠，脑缺血后血清MDA水平明显升高，SOD含量明显降低。单次静脉输注环维黄杨星D进行治疗，产生了抗氧化作用，提高超氧化物歧化酶SOD活力，减少过氧化代谢产物MDA，保护脑卒中引起的神经细胞损伤，同等剂量静脉给药方式优于口服给药。与已上市的2个阳性药比较，抗氧化作用优于盐酸川芎嗪，劣于依达拉奉。实施例5环维黄杨星D改善大鼠急性全脑缺血再灌注损伤1、动物分组将150只SD大鼠(SPF级，雄性，290-310g)按体重随机分为8组，假手术组、模型对照组、依达拉奉组(6.0mg/kg，扬州制药有限公司，规格20ml∶30mg)、长春西汀组(3.0mg/kg，河南润弘制药有限公司，规格：2ml∶20mg)、环维黄杨星D高剂量组(1.0mg/kg)、环维黄杨星D中剂量组(0.5mg/kg)、环维黄杨星D低剂量组(0.25mg/kg)和环维黄杨星D灌胃组(0.5mg/kg)。除假手术组动物数为10只外，其余各组动物均为20只。2、模型制备采用改良的Pulsinelli四动脉阻断法(four-vesselocclusion,4-VO)步骤如下：①3％水合氯醛(300mg/kg，i.p.)麻醉大鼠后，颈前及颈后除毛、暴露皮肤，俯卧位固定于手术操作台上，皮肤常规消毒。②从颈后部正中下刀，由枕骨粗隆向大鼠尾侧做一长约2cm的纵向切口，将组织逐层分离直至到显露第一颈椎两侧的翼状孔,暴露翼状孔后，离断第一颈神经，以1411高频小电刀插入横突孔将双侧椎动脉烫闭。青霉素钠溶液冲洗创面，分层缝合伤口。③更换体位，取仰卧位，固定四肢。从颈部前面的正中线下刀，从甲状软骨至胸骨上窝切一条长为2cm的纵行切口，将双侧的颈总动脉充分游离并暴露，一根长丝线牵引双侧颈总动脉，打活结，不拉紧，调整缝线长度，至于颈部肌肉深面，分层缝合伤口。将大鼠置入单笼，用烤灯照射，直至清醒。④手术结束后在实施缺血再灌注之前对术后大鼠行分笼饲养，自由饮食，使其适应24h。在缺血再灌注实施前12h以内严格的禁食，不禁饮。乙醚麻醉后的大鼠仰卧位固定于手术操作台上。于原切口处拆除缝线，再次暴露双侧颈总动脉，将牵引的丝线剪断为两根，用以单独牵引。用微型动脉夹夹闭双侧颈总动脉。若模型制作成功，则会在阻断大鼠双侧颈总动脉后30s内立即出现角膜反射消失，双侧瞳孔散大，翻正反射消失，呼吸加深加快、眼球苍白，对外周的非伤害性刺激均无反应等症状。夹闭30min后松开微型动脉夹，恢复血液供应。青霉素钠溶液冲洗创面，缝合皮肤。⑤手术后将大鼠放在电热毯上保持体温利于术后苏醒。假手术组大鼠，只分离头颈部皮肤和肌肉，不电凝双侧椎动脉，也不夹闭双侧颈总动脉，其余操作相同。3、动物给药除环维黄杨星D灌胃组动物采用灌胃给药外，其余各组动物均采用尾静脉注射给药。大鼠苏醒后进行行为学评分和给药。环维黄杨星D高、中、低剂量组分别经尾静脉注射浓度为0.25mg/ml、0.125mg/ml、0.0625mg/ml环维黄杨星D溶液，环维黄杨星D灌胃组灌胃给予浓度为0.125mg/ml环维黄杨星D溶液，依达拉奉组大鼠经尾静脉注射依达拉奉注射液(1.5mg/ml)，长春西汀组动物经尾静脉注射含长春西汀0.75mg/ml溶液，静脉和灌胃给药体积为4.0ml/kg，假手术组和模型对照组大鼠经尾静脉注射等体积的生理盐水。每天给药后2小时进行行为学评分，连续5天，第5天行为学评分结束后立即尾静脉注射2％伊文思蓝溶液，给药体积为4.0ml/kg，2小时后3％水合氯醛麻醉大鼠，心脏灌流后断头取脑。4、神经功能评分按照大鼠25分评分法(表6)，采用盲法进行神经功能评分，总分为25分。5、大鼠脑血管通透性测定：①伊文思蓝标准曲线制作：准确称取伊文思蓝固体10.0mg，加入生理盐水-丙酮混合液(3:7V/V)溶解，定容至0.5ml，配制成20mg/ml伊文思蓝溶液，再取20mg/ml伊文思蓝溶液分别稀释至20、10、5、2.5、1.25(μg/ml)。以生理盐水-丙酮混合液做空白对照在620nm处测定吸光度。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，作图求得回归方程。②伊文思蓝定量测定：取脑、称重，用生理盐水-丙酮混合液(3:7V/V)制成10％(W/V)匀浆液，密封放置过夜后，以2500rpm离心15min，取上清液，以生理盐水-丙酮混合液做空白对照在620nm处测定吸光度。根据标准曲线求出各动物脑组织伊文思蓝含量。6、统计学处理应用SPSS20.0软件进行统计分析。计量资料用均数±标准差(Mean±SD)表示，采用单因素方差分析进行组间比较，两组之间比较采用t检验，P<0.05有显著意义。7、实验结果表6全脑缺血大鼠神经功能评分标准症状和体征脑卒中指数/分毛蓬乱竖起1动作缓慢或动作减少1触耳反应加强1头翘起或躬身体3眼睛睁开不闭或闭了不睁3眼睑下垂1后肢向外向后伸展3原地转圈3抽搐或阵挛3四肢无力6总分25注：轻中度脑缺血＜10分；重度脑缺血≥10分。表7各组大鼠神经功能评分(Mean±SD)注：与假手术组比：ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；与模型对照组相比：*P＜0.05，**P＜0.01。D1、D2、D3、D4和D5分别表示1-5天。表8各组大鼠脑组织伊文思蓝含量(Mean±SD)注：与假手术组比：ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；与模型组相比：*P＜0.05，**P＜0.01。表9各组大鼠死亡情况与假手术组相比，模型对照组大鼠神经功能评分、脑组织伊文思蓝含量均有极显著升高(P<0.01)。与模型对照组相比，依达拉奉(6.0mg/kg)组大鼠给药第3天神经功能评分显著降低(P<0.05)，第4、5天神经功能评分极显著降低(P<0.01)，脑组织伊文思蓝含量显著降低(P<0.05)；长春西汀组(3.0mg/kg)大鼠神经功能评分和脑组织伊文思蓝含量没有显著降低(P>0.05)。与模型对照组相比，给药第4天环维黄杨星D高剂量组大鼠神经功能评分极显著降低(P<0.01)；给药第5天环维黄杨星D低、中和高剂量组和环维黄杨星D灌胃组大鼠神经功能评分显著或极显著降低(P<0.05,P<0.01)。给药第5天，与模型对照组相比，环维黄杨星D各剂量组大鼠脑组织伊文思蓝含量降低，但没有统计学意义(P>0.05)。动物死亡情况：假手术组和模型对照组死亡动物总数为0只；依达拉奉组死亡动物总数为1只；长春西汀组死亡动物总数为1只；环维黄杨星D高剂量组死亡动物总数为1只；环维黄杨星D中剂量组死亡动物总数为1只；环维黄杨星D低剂量组死亡动物总数为0只；环维黄杨星D灌胃组死亡动物总数为1只。实验动物死亡情况见表9。8、结论0.25-1.0mg/kg剂量环维黄杨星D能显著改善大鼠急性全脑缺血再灌注神经功能损伤，但对大鼠脑血管通透性无明显改善作用。实施例6环维黄杨星D改善大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤1、制备模型动物取SD大鼠(SPF级，250-270g，雄性)136只，采用颈内动脉线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型：大鼠用3％水合三氯乙醛麻醉(300mg/kg，i.p.)，仰卧手术台上，剪除颈部毛发，用碘伏消毒，从正中切开皮肤，分离组织，暴露右侧颈总动脉，向外牵引二腹肌及胸锁乳突肌，由颈总动脉分叉处向头端依次游离，结扎并剪断颈外动脉的分支：枕骨下动脉和甲状腺上动脉。在颈外动脉远端结扎，切断颈外动脉使其主干游离备用。然后分离颈内动脉，用丝线在颈总动脉根部打一松扣，夹闭颈总动脉和颈内动脉。将渔线(长50mm，直径0.26mm)经颈外动脉主干切口，缓慢向颈内动脉入颅方向推进，当渔线进入颈内动脉后松开颈内动脉上的动脉夹。以颈总动脉分叉处为标记，推进18mm左右时感到阻力，即达到了较细的大脑前动脉内，阻断了中动脉的所有血供来源，扎紧颈外动脉根部固定渔线，解开颈总动脉松扣，缝合皮肤。缺血2小时后，缓慢抽出渔线，完成MCAO导致局灶性脑缺血-再灌注模型。假手术组大鼠麻醉后，仅暴露颈内外动脉分叉，不闭塞中动脉。渔线的制备：将一长50mm，直径0.26mm的渔线的一端用记号笔标记，在距离此标记端18mm处用记号笔再做一标记，置于生理盐水中备用。2、分组及给药将136只大鼠按体重随机分为8组，假手术组、模型对照组、依达拉奉组(6.0mg/kg，扬州制药有限公司，规格：20ml∶30mg)、长春西汀组(3.0mg/kg，河南润弘制药有限公司，规格：2ml∶20mg)、环维黄杨星D高剂量组(1.0mg/kg)、环维黄杨星D中剂量组(0.5mg/kg，)、环维黄杨星D低剂量组(0.25mg/kg)和环维黄杨星D灌胃组(0.5mg/kg)。除假手术组动物数为10只外，其余各组动物均为18只。除环维黄杨星D灌胃组动物采用灌胃给药外，其余各组动物均采用尾静脉注射给药。脑缺血再灌注后进行动物神经功能评分和给药。挑选神经功能评分＞8分的模型动物用于后续实验。环维黄杨星D高、中、低剂量组分别经尾静脉注射浓度为0.25mg/ml、0.125mg/ml和0.0625mg/ml环维黄杨星D溶液，灌胃组灌胃给予浓度为0.125mg/ml环维黄杨星D溶液，依达拉奉组大鼠经尾静脉注射依达拉奉注射液(1.5mg/ml)，长春西汀组动物经尾静脉注射含长春西汀0.75mg/ml溶液，静脉和灌胃给药体积为4.0ml/kg，假手术组和模型对照组大鼠经尾静脉注射等体积的生理盐水。每天给药后2小时进行神经功能评分，连续5天，第5天处死大鼠、取脑，检测大脑梗死率及脑含水量。3、神经功能损害程度评分按照大鼠神经功能损害程度评分标准(见表1)，采用盲法进行神经功能损害程度评分，总分为16分。结果如表10所示。4、脑梗死率测定取脑、迅速冰冻，沿冠状面切成2mm厚的切片，将脑片放入2％TTC染液中，避光37℃温孵10min进行染色，采用数码相机成像。随后分离苍白区(梗塞区)和非苍白区(正常区)，按下列公式计算脑梗死率：脑梗死率＝苍白区重量/(苍白区重量+非苍白区重量)×100％。结果如表11所示。5、脑含水量测定脑片称重后，置于50℃烘箱中干燥至恒重，称其干重，计算脑含水量，并按下式计算脑含水量百分比：脑含水量百分比＝(湿重-干重)/湿重×100％。结果如表11所示。6、统计学处理应用SPSS17.0软件进行统计分析。计量资料用均数±标准差(Mean±SD)表示，采用单因素方差分析进行组间比较，两组之间比较采用t检验，P<0.05有显著意义。7、实验结果表10各组大鼠神经功能损害程度评分(Mean±SD)注：与假手术组比：△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型对照组相比：*P＜0.05，**P＜0.01。D1、D2、D3、D4和D5分别表示1-5天。表11各组大鼠脑梗死率和脑含水量(Mean±SD)注：与假手术组比：△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型对照组相比：*P＜0.05，**P＜0.01。表12各组死亡大鼠数与假手术组相比，模型对照组大鼠神经功能评分、脑梗死率和脑含水量均有极显著升高(P<0.01)。与模型对照组相比，依达拉奉(6.0mg/kg)组大鼠给药第4天和第5天神经功能评分极显著降低(P<0.01)，脑梗死率和脑含水量显著降低(P<0.05)；长春西汀组(3.0mg/kg)大鼠脑含水量显著降低(P<0.05)，但神经功能评分和脑梗死率没有显著降低(P>0.05)。与模型对照组相比，给药第4天和第5天环维黄杨星D高剂量和中剂量组大鼠神经功能评分极显著降低(P<0.01)、低剂量组显著降低(P<0.05)；环维黄杨星D灌胃组第5天大鼠神经功能评分显著降低(P<0.05)，但第4天神经功能评分无显著性降低(P>0.05)。给药第5天，与模型对照组相比，环维黄杨星D高剂量组大鼠脑梗死率显著降低(P<0.05)，脑含水量极显著降低(P<0.01)；环维黄杨星D中剂量组大鼠脑梗死率和脑含水量均显著下降(P<0.05)；环维黄杨星D低剂量组脑梗死率显著降低(P<0.05)，脑含水量极显著降低(P<0.01)；环维黄杨星D灌胃组大鼠脑含水量显著降低(P<0.05)，但脑梗死率没有显著降低(P>0.05)。动物死亡情况：假手术组死亡动物总数为0只；模型对照组死亡动物总数为6只；依达拉奉组死亡动物总数为8只；长春西汀组死亡动物总数为5只；环维黄杨星D高剂量组死亡动物总数为4只；环维黄杨星D中剂量组死亡动物总数为3只；环维黄杨星D低剂量组死亡动物总数为6只；环维黄杨星D灌胃组死亡动物总数为4只。详见表12。8、结论0.25-1.0mg/kg剂量的环维黄杨星D静脉给药能显著改善大鼠局灶性脑缺血再灌注(I/R)损伤。当前第1页1 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