一种改性葡聚糖修饰的纳米凝胶止血材料及其制备和应用的制作方法

本发明涉及一种纳米凝胶止血材料，特别涉及一种改性葡萄糖修饰的纳米凝胶止血材料及其制备和应用。

背景技术：

手术、交通事故、战争、重大自然灾害等通常都会造成大量的血液流失，而止血是抢救生命的关键。目前为止，国内常用的止血剂有止血带、止血纱布及云南白药等，它们对中、重度的止血效果有限，且止血速度较慢。

近些年来，又开发了众多局部止血剂来控制手术或外伤出血。如生物性止血材料纤维蛋白胶，化学性止血材料壳聚糖、α-氰基丙烯酸酯类组织胶等，多孔类止血材料沸石等。纤维蛋白胶作为伤口急救材料的不足之处是成本高、使用不便等。壳聚糖类止血剂本身止血作用有限，对于广泛出血的创面止血效果不理想，常需复合其他止血药如凝血因子、氯化钙等。而α-氰基丙烯酸酯类不同程度存在组织毒性、刺激性。美军在阿富汗战争以及伊拉克战争中使用了商品名为QuickClot沸石类止血粉，其止血效果及提高伤员存活率两方面都优于传统止血材料，但止血过程会产热，在大面积出血伤口上使用时会产生组织热损伤。

纳米凝胶是稳定的具有三维交联网络结构的高分子微粒，具有比表面积大、吸附能力强、反应活性高等特性。根据纳米凝胶的以上特性，将改性后的多糖与带有乙烯基的单体分散聚合后，形成高吸水性的、可快速凝胶化的纳米凝胶止血材料。纳米凝胶对血液中水分的快速吸附可导致血小板的浓缩、降低创口部位的液体体积，从而增强血液的凝集速度和凝集能力。此外，该纳米凝胶吸水膨胀后体积增大，形成高分子水凝胶层，可封堵创口而止血。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种改性葡萄糖修饰的纳米凝胶止血材料，其具有优异的吸水性、良好的生物相容性，其吸水膨胀后体积增大，形成高分子水凝胶层，可封堵创口而止血。

本发明的另一个目的是提供一种改性葡萄糖修饰的纳米凝胶止血材料的制备方法。

本发明的另一个目的是提供一种改性葡萄糖修饰的纳米凝胶止血材料制备止血药品或止血器材方面的应用。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种改性葡萄糖修饰的纳米凝胶止血材料，其由改性葡萄糖和具有乙烯基的单体聚合而成，其中，所述改性葡萄糖为甲基丙烯酸甘油酯修饰的葡萄糖。

优选地，所述改性葡萄糖修饰的纳米凝胶止血材料干燥时为粉末状，吸水后为凝胶态；其吸水率为50g/g～160g/g,凝胶化时间为5～90秒。进一步优选地，所述粉末的粒径为200-1000nm；吸水溶胀后的粒径为5000-10000nm。

优选地，所述具有乙烯基的单体为丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酰胺、乙烯基吡啶、乙酸乙烯中的一种或几种。

一种所述的改性葡萄糖修饰的纳米凝胶止血材料的制备方法，其包括：

1)凝胶制备：向含有改性葡萄糖和具有乙烯基的单体的溶液中加入引发剂、交联剂和缓冲剂，进行聚合反应后过滤并洗涤，得凝胶；

2)干燥：将步骤1)所得凝胶真空干燥到一定程度后再进行冷冻干燥；

3)粉碎：将步骤2)所得产品粉碎并筛分。

优选地，在步骤1)中，

所述引发剂包括过硫酸铵、过硫酸钾等无机过氧化物引发剂，偶氮二异庚腈、偶氮二异丁酸二甲酯等偶氮类引发剂；

所述交联剂包括亚甲基二丙烯酰胺、三氯化铝、二乙烯基苯、二异氰酸酯；

所述引发剂促进剂包括四甲基乙二胺。

优选地，在步骤1)中，所述溶液还包括分散剂，所述分散剂包括吐温-80、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙烯醇中的一种或多种的混合物。

优选地，在步骤2)中，所得凝胶先真空干燥脱除30％～90％的水后，再进行冷冻干燥。

优选地，在步骤1)中，所述具有乙烯基的单体为丙烯酸，所述丙烯酸用氢氧化钠中和，中和度为50％～90％。

一种所述的改性多糖修饰的纳米凝胶止血材料在制备止血药品或止血器材方面的应用，其中，所述止血药品或止血器材用于静脉出血、动脉出血、体表出血和脏器出血。

优选地，所述止血药品包括止血粉、止血敷料；所述止血器材包括止血纱布、止血棉团、止血棉签、止血注射器。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的改性葡萄糖修饰的纳米凝胶止血材料，由改性多糖和具有乙烯基的单体聚合而成，其结构为三维网状纳米级微粒，纳米微粒的比表面积大，反应速度快，因此该纳米凝胶止血材料接触血液后，可迅速溶胀，将血液中的水分吸收至三维网状结构的内部，浓缩血小板及血细胞的同时，将液态的血液变成凝胶状的血块膜，封堵在伤口处，达到迅速止血的目的。四种创伤模型的止血结果都表明，该纳米凝胶与市售止血剂血盾及传统止血材料纱布相比，可以显著缩短止血时间，减少出血量，同时不会造成热损伤。

进一步地，该纳米凝胶止血材料具有优异的吸水性，可快速凝胶化，干燥时为粉末态，吸湿后为凝胶态；可有效降低出血量、缩短出血时间；其具有良好的生物相容性，不会造成热损伤；在体内可部分降解；快速止血后，形成的凝胶膜易于去除。

本发明提供的改性多糖修饰的纳米凝胶止血材料的制备方法，其原料廉价易得，反应条件温和，反应操作简单，后处理方便。

本发明提供的改性多糖修饰的纳米凝胶止血材料在制备止血药品或止血器材方面的应用，所获得的止血药品或止血器材使用方便，操作简单。

附图说明

图1为改性多糖基修饰的纳米凝胶止血材料结构示意图。

图2为改性多糖基修饰的纳米凝胶止血材料体外凝血及凝血放热实验结果；其中，a)为0.1g改性多糖基修饰的纳米凝胶止血材料的凝血结果；b)为0.1g血盾的凝血结果；c)为1.0g血盾的凝血结果；d)为空白对照；e)显示血盾凝血放热至55℃；f)显示改性多糖基修饰的纳米凝胶止血材料凝血不放热，维持室温。

图3为改性多糖基修饰的纳米凝胶止血材料体内外降解实验结果；其中，a)显示不同配比的改性多糖基修饰的纳米凝胶止血材料在体外实验中均发生一定程度的降解；b)为将改性多糖基修饰的纳米凝胶止血材料包埋于皮下；c)为改性多糖基修饰的纳米凝胶止血材料在皮下8天后降解情况；d)为改性多糖基修饰的纳米凝胶止血材料在皮下16天后降解情况，显示已经降解完全。

图4为改性多糖基修饰的纳米凝胶止血材料对兔耳缘静脉及耳动脉的止血效果图；a)显示耳缘静脉损伤给药后的失血量；b)显示耳缘静脉损伤给药后的止血时间；c)显示耳动脉损伤给药后的失血量；d)显示耳动脉损伤给药后的止血时间。

图5为改性多糖基修饰的纳米凝胶止血材料对兔肝脏出血的止血效果图。其中，a)显示肝脏出血给药后的止血时间；b)～e)显示肝脏出血给药后的止血效果，b)为空白对照，c)为医用纱布，d)为改性多糖基修饰的纳米凝胶止血材料，e)为血盾。

图6为改性多糖基修饰的纳米凝胶止血材料对兔股动脉损伤止血效果图。其中，a)～e)显示了采用改性多糖基修饰的纳米凝胶止血材料进行止血的过程和效果图；f)～j)显示了采用血盾进行止血的过程和效果图。

图7为本发明止血材料的止血原理示意图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明提供的改性葡萄糖修饰的纳米凝胶止血材料，其具有优异的吸水性、良好的生物相容性，其吸水膨胀后体积增大，形成高分子水凝胶层，可封堵创口而止血。

本发明提供的改性葡萄糖修饰的纳米凝胶止血材料，由改性葡萄糖和具有乙烯基的单体聚合而成；其中，改性葡萄糖为甲基丙烯酸甘油酯修饰的葡萄糖。结构参见图1。本发明提供的改性多糖修饰的纳米凝胶止血材料，由改性多糖和具有乙烯基的单体聚合而成，其结构为三维网状纳米级微粒，纳米微粒的比表面积大，反应速度快，因此该纳米凝胶止血材料接触血液后，可迅速溶胀，将血液中的水分吸收至三维网状结构的内部，浓缩血小板及血细胞的同时，将液态的血液变成凝胶状的血块膜，封堵在伤口处，达到迅速止血的目的。止血原理参见图7。

在一种实现方式中，所述改性多糖修饰的纳米凝胶止血材料为粉末状，吸水后为凝胶态；其吸水率为50g/g～160g/g，凝胶化时间为5～90秒。作为更具体的实现方式，所述粉末的粒径为200-1000nm；吸水溶胀后的粒径为5000-10000nm。

在一种实现方式中，所述具有乙烯基的单体为丙烯酸、丙烯酰胺、乙烯基吡啶、乙酸乙烯中的一种或几种。

作为更具体的实现方式，所述的具有乙烯基的单体为丙烯酸，所述丙烯酸用碱中和，中和度为50％～90％。

本发明的改性多糖修饰的纳米凝胶止血材料在制备止血药品或止血器材方面的应用，其中，所述止血药品或止血器材用于静脉出血、动脉出血、体表出血和脏器出血。

其中，所述止血药品包括止血粉、止血敷料；所述止血器材包括止血纱布、止血棉团、止血棉签、止血注射器。

其中，所述止血粉既可以是单独的改性葡聚糖修饰的纳米凝胶止血材料，也可以是可药用辅料与改性葡聚糖修饰的纳米凝胶止血材料的混合物；所述止血纱布可以是包覆有止血粉的纱布或纱布袋；所述止血棉团或止血棉签包括沾附有止血粉的药用棉。

其中，在用于止血时，可以向出血处直接撒止血粉止血，或者撒止血粉后纱布按压止血，或者血粉包埋于纱布后按压止血，还可以将止血粉置于注射器内被注射于腔道止血。

实施例1

1)冰浴下用3mol/L NaOH中和1.20g丙烯酸，至中和度为50％-90％，倒入三口烧瓶。将1.20g甲基丙烯酸甘油酯修饰的葡聚糖溶解于30mL蒸馏水中，滴入0.05-0.2g吐温-80或其他分散剂的一种，混匀后氮气保护下滴入三口烧瓶。依次向三口瓶中滴入10mL 0.48mg/mL过硫酸铵溶液、0.48mg/mL亚甲基二丙烯酰胺溶液、5mL 0.03mg/mL四甲基乙二胺溶液。65℃下氮气保护5h.将得到的凝胶过滤，蒸馏水洗涤三次，得凝胶；

2)步骤1)所得凝胶真空干燥30％-90％后再冷冻干燥。

3)步骤2)所得产品粉碎筛分后得改性多糖修饰的纳米凝胶止血材料。

实施例2

丙烯酸用量为2.40g，过硫酸铵溶液浓度为1.80mg/mL、亚甲基二丙烯酰胺溶液浓度为4.32mg/mL，其它条件同实施例1。

实施例3

丙烯酸用量为3.60g，过硫酸铵溶液浓度为4.80mg/mL、亚甲基二丙烯酰胺溶液浓度为3.84mg/mL，其它条件同实施例1。

实施例4

丙烯酸用量为4.80g，过硫酸铵溶液浓度为3.00mg/mL、亚甲基二丙烯酰胺溶液浓度为4.80mg/mL，其它条件同实施例1。

实施例5

丙烯酸用量为6.00g，过硫酸铵溶液浓度为3.60mg/mL、亚甲基二丙烯酰胺溶液浓度为5.76mg/mL，其它条件同实施例1。

不同合成配比制备纳米凝胶条件参见下表1：

表1不同合成配比制备纳米凝胶

将本发明方法制得的改性葡萄糖修饰的纳米凝胶止血材料进行创伤模型实验及止血效果，具体如下：

一、改性多糖修饰的纳米凝胶止血材料体外凝血及凝血放热实验

采用实施例1所制备的改性多糖修饰的纳米凝胶止血材料，并选用血盾作为对照药品，其实验步骤为：

取兔耳动脉血液，立即置于含有枸橼酸钠(109mmol/L)的抗凝管中，备用。分别取2mL血液于4个塑料离心管中，37℃水浴加热。每管加入0.2mL氯化钙溶液(25mmol/L),同时分别加入0.1g纳米凝胶、0.1g血盾、1.0g血盾，最后一组为空白对照。凝血时间为加入样品至血液凝固的时间(倒置离心管，血液呈凝固态，无血液流下)。测定凝血温度方法类似，分别取3mL血液于2个试管中，室温下，将温度计插入血液中，加入0.2mL氯化钙溶液后分别加入2.0g纳米凝胶和血盾，记录凝血过程温度最高值。

所述结果展示在图2中，其中，a)为0.1g改性多糖基修饰的纳米凝胶止血材料的凝血结果；b)为0.1g血盾的凝血结果；c)为1.0g血盾的凝血结果；d)为空白对照；e)显示血盾凝血放热至55℃；f)显示改性多糖基修饰的纳米凝胶止血材料凝血不放热，维持室温。根据图2可以发现，采用0.1g改性多糖基修饰的纳米凝胶止血材料进行凝血时血液完全凝固；采用0.1g血盾时，血液没有完全凝固；采用1g血盾时，血液基本完全凝固。

结果表明，本发明提供的改性多糖修饰的纳米凝胶止血材料，凝血效果超过了10倍其用量的血盾的凝血效果，体外凝血效果非常显著；其凝血时维持室温，未发现放热现象，而血盾则发生了明显的放热现象，导致凝血处温度升高。

二、改性多糖修饰的纳米凝胶止血材料体内外降解实验

实验步骤：

1、体外降解实验：

将五组不同合成条件的纳米凝胶分别精密称重(w₁)，在蒸馏水中充分溶胀后，于37℃的磷酸盐缓冲盐溶液中透析，分别于第4,8,12,16，20，24和32天取出并真空干燥，并精密称重(w₂)。通过以下公式计算降解率。每组样品重复三次，取平均值并计算标准偏差。

降解率(％)＝(w1-w2)/w1×100％

2、体内降解实验：

取三只健康的新西兰兔，背部皮肤脱毛后，剪开皮肤约2cm,在其皮下包埋0.1g纳米凝胶，缝合，碘伏消毒。分别于8天和16天后拆线，观察纳米凝胶体内降解情况。

实验结果展示在图3中，其中，a)显示不同配比的改性多糖基修饰的纳米凝胶止血材料在体外实验中均发生一定程度的降解；b)为将改性多糖基修饰的纳米凝胶止血材料包埋于皮下；c)为改性多糖基修饰的纳米凝胶止血材料在皮下8天后降解情况；d)为改性多糖基修饰的纳米凝胶止血材料在皮下16天后降解情况，显示已经降解完全。

结果显表明，本发明提供的改性多糖修饰的纳米凝胶止血材料，其在体外和体内均可以发生降解。

三、改性多糖修饰的纳米凝胶止血材料对静脉和表浅动脉损伤的止血实验

实验步骤：

取16只健康新西兰兔，分为4组，在耳缘静脉周围处去毛，用2％戊巴比妥钠35mg/kg耳缘静脉注射将其麻醉。用75％医用酒精消毒后，每只兔分别于距离耳尖7cm处隔断耳缘静脉，自由出血5s，5s后分别撒0.05g受试药物(纳米凝胶)、阳性对照药(血盾)、阴性对照药(医用纱布)，并使用50g的砝码作为外力进行伤口处的按压，每隔5s观察伤口的出血状况，并用脱脂棉吸附所出血液，记录吸附前后脱脂棉的重量，以此计算出血量。记录从切断耳缘静脉至不再出血的时间为止血时间，每组重复4次。耳动脉实验分组及实验方法与耳缘静脉类似，将耳缘静脉改为耳动脉，给药量改为0.1g。

实验结果展示在图4中，a)显示耳缘静脉损伤给药后的失血量；b)显示耳缘静脉损伤给药后的止血时间；c)显示耳动脉损伤给药后的失血量；d)显示耳动脉损伤给药后的止血时间。

结果表明，在兔耳缘静脉损伤和兔耳动脉损伤损伤的止血实验中，本发明提供的改性多糖修饰的纳米凝胶止血材料与纱布和血盾相比，其具有更快的凝血速度，且兔子的失血量更小，因此，其对静脉损伤和表浅动脉损伤引起的出血，具有更好的止血效果。

四、改性多糖修饰的纳米凝胶止血材料对脏器出血的止血实验

实验步骤：

分组同上，将兔子固定于实验台，无菌条件下解剖开动物腹腔暴露肝脏，用无菌手术刀在肝脏表面以“#”进行2cm*2cm面积的划伤，深0.5cm(伤口部位一般在距肝脏边缘4cm左右处)，擦干净表面血液后，分别撒上0.1g受试药物、阴性对照药、阳性对照药，因肝脏脆性较强，不加砝码，记录止血时间。因肝脏出血后部分血液流入腹腔内，无法准确记录出血量，可通过观察估计出血量。每组重复4次。

实验结果展示在图5中，其中，a)显示肝脏出血给药后的止血时间，其显示改性多糖修饰的纳米凝胶止血材料的止血速度最快；b)～e)显示肝脏出血给药后的止血效果，b)为空白对照，c)为医用纱布，d)为改性多糖基修饰的纳米凝胶止血材料，e)为血盾，b)～e)显示，采用改性多糖基修饰的纳米凝胶止血材料时肝脏失血量最小。

结果表明，本发明提供的改性多糖修饰的纳米凝胶止血材料与纱布和血盾相比，其具有更快的凝血速度，且脏器失血量更小，因此，其对脏器出血，具有更好的止血效果。

五、改性多糖修饰的纳米凝胶止血材料对动脉出血的止血实验

实验步骤：

分组同上，无菌条件下钝性分离股动脉，轻轻用医用胶带固定，然后将股动脉切断，至股动脉喷血5s,再分别给1.0g纳米凝胶和血盾，医用纱布和无处理的空白对照均无法止血，兔子失血过多死亡。记录血盾及纳米凝胶组的出血量和出血时间。每组重复4次。

实验结果展示在图6中，其中，a)～e)显示了采用改性多糖基修饰的纳米凝胶止血材料进行止血的过程和效果图；f)～j)显示了采用血盾进行止血的过程和效果图。比较e)和j)可以发现，采用改性多糖基修饰的纳米凝胶止血材料进行止血时动脉血管的出血量明显比较少。结果表明，本发明提供的改性多糖修饰的纳米凝胶止血材料与纱布和血盾相比，动脉出血量更小，因此，其对动脉出血，具有更显著的止血效果。