本发明公开了人参果花青素在制备预防急性肾损伤药物的新用途，属于中药提取物的新生物活性的医药
技术领域：
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背景技术：
：顺铂（cisplatin,cddp）全名为顺式-1,2-二氯二氨合铂，是当前临床上最有效和最常用的抗肿瘤药物之一，广泛用于卵巢癌、前列腺癌、肺癌、鼻咽癌、恶性淋巴癌、乳腺癌、甲状腺癌及成骨肉瘤等多种实体肿瘤的治疗。然而,顺铂治疗严重的副作用往往限制了其在临床上的应用,特别是肾脏损害(肾毒性)。顺铂的疗效与用药剂量成正比，但其剂量的增加却受肾毒性的限制，尽管采取水合疗法等防护措施，临床发生率仍高达1/3左右。顺铂引起的肾毒性涉及顺铂的细胞毒作用、氧化应激、细胞凋亡及炎症反应等多种机制，如何降低顺铂的肾毒性，更好的发挥顺铂的抗肿瘤作用，提高患者的化疗质量，是目前急需解决的课题。大量文章报道肾细胞氧化应激、炎症和细胞凋亡，可能会导致肾毒性。铜离子转运蛋白(ctr1)和有机阳离子转运蛋白2(oct2)运输顺铂到肾小管近端小管，使线粒体功能障碍。生产活性氧(ros)与其他副作用共同促使细胞氧化应激，一氧化氮以及其他活性氧物种如超氧化物阴离子和过氧化氢在顺铂肾毒性中发挥了重要的作用，如果影响肾细胞产生一氧化氮和过氧化物，过氧亚硝基必须存在。过度表达的活性氧和活性氮引起氧化反应，从而导致蛋白质硝化、酶失活，促进炎症因子生成，细胞功能紊乱，细胞凋亡信号通路的激活，最终导致细胞死亡。花青素是一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，具有抗氧化、抗炎，抑菌，抗衰老、抗癌以及对肝脏，对心脑血管和视力的保护作用。人参来源于五加科植物人参(panaxginsengc.a.meyer)的干燥根及根茎，是我国传统的名贵中药材。人参果是人参的成熟果实，含有人参皂苷、黄酮、多糖、生物碱、甾醇和挥发油等多种化学成分，其中皂苷及多糖含量最多且被人们深入研究，人参大部分化学成分具都有显著的药理活性，在对肾保护作用方面均有显著影响。人参果花青素(ginsengfruitanthocyanins,gfa)是从人参果中提取的类黄酮类成分，是一种水溶性色素，具有抗氧化、抗自由基等作用。目前为止，尽管人参皂苷类成分的肾损伤保护活性屡见报道，但有关人参果中花青素类成分是否具有保护肾损伤的药理作用尚不明确。本发明从人参果花青素的抗氧化、减少炎症反应及抑制细胞凋亡等机制证明人参果花青素对apap诱导的小鼠肾损伤具有保护作用，为人参果花青素的临床应用提供一定的理论参考。技术实现要素：本发明提供了人参果花青素在制备预防顺铂（cisplatin）诱导的急性肾损伤药物中的应用。本发明所述的人参果花青素在用于上述用途时，其口服或胃肠外给药，均是安全的，在口服情况下，其可以以任何常规的形式给药，如片剂，胶囊剂，粉针剂，注射剂，丸剂，软胶囊，颗粒剂和贴剂等。本发明制备保护急性肾损伤药物是由有效成分与固体或液体的赋形剂一起构成的，这里使用的固体或液体的赋形剂在本领域是众所周知的，下面举几个例子，散剂是内服的粉末剂，它的赋形剂有乳糖，淀粉，糊精，碳酸钙，合成或天然硫酸铝，氧化镁，硬脂酸镁，碳酸氢钠，干燥酵母等；溶液剂的赋形剂有水，甘油，1，2-丙二醇，单糖浆，乙醇，乙二醇，聚乙二醇，山梨糖醇等；软膏剂的赋形剂可以使用脂油，含水羊毛脂、凡士林、甘油、蜂蜡、木蜡、液体石蜡等组合成的疏水剂或亲水剂。本发明的药物组合物可以按现有技术中已知的方法如混合、制粒、压片来制备。本发明药物组合物还可以包括各种药学使用的任何组分，如香味剂、着色剂、甜味剂等。本发明可以通过下面的实验例进一步说明。实验例.人参果花青素对顺铂致小鼠肾损伤的保护作用1材料与方法1.1动物:雄性icr小鼠，spf级，5~6周，体重26~28g，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，合格证号：scxk（吉）2011-0004，自由饮水，适应性饲养一周后随机分为4组后进行实验。1.2材料仪器:人参果花青素，本实验室自备；顺铂（99.0%），来自上海思域化工科技有限公司；苏木素-伊红染液（h&e）、hoechst33258染色液，上海碧云天生物技术有限公司；pas染色液，北京雷根生物技术有限公司；肌酐（cre）、尿素氮（bun）、超氧化物歧化酶（sod）、过氧化氢酶（cat）、丙二醛（mda）及谷胱甘肽（gsh）试剂盒，购于南京建成生物工程有限公司；肿瘤坏死因子（tnf-α）和白介素1β（il-1β）elisa试剂盒，均购自美国r&d公司；兔来源单克隆抗鼠bcl-2、bax、inos、cox-2、cyp2e1、4-hne和ho-1，购于美国cellsignalingtechnology公司；免疫组化试剂盒（sv0002）、免疫荧光试剂盒（sa1074），购于博士德生物技术有限公司；hoechst33258染色试剂盒（c0003），碧云天。pl303电子天平，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；显微镜leicadm500和leicadm2500荧光显微镜，德国徕卡；德国spectrostarnano全波长扫描式酶标仪，德国bmglabtech公司；高速冷冻离心机，北京昊特斯科技有限公司。1.3方法1.3.1药物配制：称取gfa，加cmc-na混悬至所需浓度（200mg/kg、400mg/kg）；称取cddp溶于热的生理盐水至所需浓度。1.3.2动物分组及处理：icr小鼠适应性饲养一周后随机分为4组，即空白对照组（normal）、模型组（cddp）、gfa低剂量组（200mg/kg,cddp+gfa）、gfa高剂量组（400mg/kg,cddp+gfa），每组8只，gfa采用灌胃方式给药，空白对照组和模型组以等量生理盐水灌胃，一天一次，连续给药7天。末次给药后，禁食不禁水12小时后模型组按25mg/kg腹腔注射cddp，造模12小时后禁食不禁水，断颈处死。眼球取血，血液室温凝结1h后以3000rpm/10min离心，留取上清供血清指标bun、cre、tnf-α和il-1β检测。取肾脏组织溶于生理盐水中制成肾匀浆用于检测sod、cat、gsh和mda水平，取相同部位的肾组织固定于10%甲醛中，用于肾组织切片观察病理变化。1.3.3计算免疫器官指数：称取小鼠体质量和肾脏质量，计算脏器指数。肾脏指数=肾脏质量/小鼠体质量1.3.4血清学指标：依照南京建成生物有限技术公司提供的试剂盒说明书，肌氨酸氧化酶法和脲酶法试剂盒测定血清中cre和bun水平，采用elisa法测定血清中炎症因子tnf-α和il-1β的水平。1.3.5氧化应激指标：取冻存的肝组织，制备组织匀浆，取上清液，采用二硫代对硝基苯法、钼酸铵法和硫代巴比妥法试剂盒测定gsh、cat和mda的含量，及sod含量测定均按照试剂盒说明书进行操作。1.3.6染色：将肾组织固定于10%甲醛中，石蜡包埋切片，将切片放入二甲苯中脱蜡30min，再放入无水乙醇中30min，依次放入95%、70%、50%乙醇中3min水化，最后放入蒸馏水中5min，加入苏木素，1min后流水冲洗反蓝，返蓝后依次放入50%、70%、95%乙醇中各3min，滴加伊红，1min后放入无水乙醇，5min后放入二甲苯中保持30min，滴加树脂，盖玻片封片，光镜下观察肾组织切片的病理变化。1.3.7染色:每组随机取4张常规石蜡切片，切片厚度5常规，石蜡切片脱蜡和水化（与h&e相同），pas染液进行染色，脱水和透明，最后中性树胶封片封存。光学显微镜下观察肾脏组织变化。1.3.8染色：取肾组织石蜡切片，脱蜡水化（与h&e相同）后，从蒸馏水中取出切片，用pbs缓冲液清洗两次，每次3min，滴加hoechst33258染色剂，5min后用pbs洗两次，每次3min，擦干后滴加抗荧光封片液，盖上载玻片，荧光显微镜下观察组织。显微镜下随机选取3个高倍视野，计算阳性肾细胞数和肝细胞总数。肾细胞凋亡率=阳性肾细胞数/肾细胞总数。1.3.9免疫组织化学染色：取肾组织石蜡切片，脱蜡水化（与h&e相同）后，从蒸馏水中取出切片，加入内源性过氧化物酶37℃烘箱中保存30min，用蒸馏水洗3次，每次3min，放入抗原修复液中微波修复8min，恢复室温后滴加5%bsa封闭液，保留10min后擦掉封闭液加入抗体inos（1:200）、cox-2（1:200）、bax(1:200)和bcl-2(1:200)，4℃孵育过夜。次日，恢复室温后pbs冲洗三次，每次5min，擦干切片；滴加聚合hrp标记抗兔igg置37℃烘箱保存1h，之后用pbs洗三次，每次5min；滴加dab1min，加入苏木素1min后流水返蓝，重复h&e染色返蓝后过程，显微镜下观察组织。1.3.10免疫荧光染色：取肾组织石蜡切片，脱蜡水化（与h&e相同）后，从蒸馏水中取出切片，放入抗原修复液中微波修复8min，恢复室温后滴加血清封闭液，室温放置20min，擦干后加入4-hne(1:100)、ho-1(1:100)和cyp2e1(1:200)，4℃孵育过夜。次日，恢复室温后pbs冲洗三次，每次5min，擦干切片，滴加生物素化羊抗兔igg置37℃烘箱保存30min，之后用pbs洗三次，每次5min，ho-1和4-hne切片滴加cy3（试剂盒内置），cyp2e1滴加dylight488，置37℃烘箱保存30min，之后用pbs洗三次，每次5min；滴加dab1min，之后用pbs洗三次，每次5min，擦干后用抗荧光猝灭pvb封片液封片，37℃烘箱保存30min，荧光显微镜下观察。1.3.11分析：免疫印迹分析，肾组织细胞溶解在ripa缓冲液中，每个泳道上样50µg等量的蛋白质到12%sds-page上，所要的蛋白跑出后转移到pvdf膜。用tbs与0.1%的tween-20混合液（tbst）配制成5%脱脂牛奶封闭pvdf膜10min，然后用tbst洗三次，每次10min，加入抗体bax(1:100)和bcl-2(1:100)4℃过夜。次日恢复室温后用tbst洗三次，每次10min，加入ⅱ抗摇床孵育1.5h。用发射极耦合原理（ecl）检测蛋白信号，条带强度用计算机软件quantityone检测。1.4统计学方法采用spss18.0软件，单因素方差分析法（anova）进行统计分析，组间比较各项数据以mean±s.d.表示；ridit分析用于组织学检查比较；采用graphpadprism6.0软件进行方差分析，p<0.05有统计学意义。2结果2.1实验动物整体水平的变化与正常对照组小鼠相比，顺铂模型组小鼠毛色稀疏，摄食量和饮水量均减少，体重明显减轻（p<0.05），肾指数显著升高（p<0.05）；解剖后空白组小鼠肾脏颜色鲜艳色泽清晰，与空白组比较模型组肾组织肿大且颜色较浅；gfa给药组小鼠状态明显好转，体重下降得到缓解，且肾组织较模型组比较形态好转，可以明显改善顺铂所致的肾指数下降（p<0.05），结果如下表。表1gfa对顺铂致肾损伤小鼠体重、脏器指数的影响组别剂量体重肾指数(group)(mg/kg)(bodyweight)(kidneyindex)normal—32.59±1.441.52±0.12cddp—28.54±2.06*1.71±0.17*cddp+gfa20029.72±1.23#1.56±0.13#cddp+gfa40030.99±2.02#1.53±0.11#注：与正常对照组相比*p<0.05；与模型组相比#p<0.05（n=8）2.2gfa对小鼠血清bun和cre影响本研究发现顺铂模型组小鼠血清bun及cre水平明显高于空白对照组（p<0.05）。然而，与顺铂模型组比较，低、高浓度gfa给药组小鼠血清bun及cre水平均显著降低（p<0.05），且低、高浓度gfa给药组与空白对照组血清bun、cre值接近。肾脏受损时给药组与模型组相比血清中bun、cre水平的降低说明人参果花青素具有较好的保护肾脏受损的作用。表2gfa对顺铂致肾损伤小鼠血清中bun和cre水平影响组别剂量尿素氮bun肌酐cre(group)(mg/kg)(mmol·l-1)(μmol·l-1)normal—6.26±0.9534.45±4.89cddp—21.36±3.49*53.69±9.08*cddp+gfa20011.76±2.6938.76±8.65#cddp+gfa4009.29±1.37#36.91±6.81#注：与正常对照组相比*p<0.05；与模型组相比#p<0.05（n=8）2.3gfa对顺铂肾损伤小鼠肾组织脂质过氧化影响与空白组比较，肾损伤模型组小鼠肝组织匀浆中的sod、gsh和cat水平明显低于空白组（p<0.05），给药组显著地抑制了sod、gsh和cat水平的降低。mda水平显示组织的脂质过氧化产物的多少，直接说明细胞受损程度；与空白组比较模型组的mda含量明显高于空白组（p<0.05），gfa低、高给药明显抑制了肾组织中mda水平的升高。以上数据说明gfa能够提高肾组织抗氧化能力以及减缓cddp对肾细胞产生的脂质过氧化作用，结果如下表。表3gfa对小鼠肾组织中sod、gsh、cat和mda水平影响组别剂量超氧化物歧化酶还原型谷胱甘肽过氧化氢酶丙二醛(group)(mg/kg)sod(u/mg·prot)gsh(μmol/g·prot)cat(u/mg·prot)mda(nmol/mg·prot)normal—62.43±8.614.30±0.147.35±0.722.42±0.33cddp—42.19±7.27*3.47±0.12*6.14±0.70*4.09±0.27*cddp+gfa20050.81±4.49#3.99±0.12#7.17±0.59#3.14±0.41#cddp+gfa40051.03±5.60#4.72±0.13#7.23±0.54#2.66±0.40#注：与正常对照组相比*p<0.05；与模型组相比#p<0.05（n=8）2.4gfa对小鼠肾组织细胞因子的影响tnf-α表达可以杀死癌细胞，il-1β被认为是细胞免疫应答过程中的关键调节因子，但二者在正常细胞中的升高，会使细胞产生炎性反应。如表4所示，与空白组比，顺铂模型组小鼠血清中tnf-α和il-1β的水平显著升高（p<0.05）；与模型组相比，gfa给药组显著降低血清中tnf-α和il-1β的水平（p<0.05）。表明gfa能够通过抑制炎症反应而发挥肾保护作用。表4gfa对顺铂致肾损伤小鼠血清中tnf-鼠和il-1鼠水平的影响组别剂量tnf-αil-1β(group)(mg/kg)(pg/mg·prot)（pg/mg·prot）normal—227.35±13.752303.47±91.60cddp—350.41±23.07*3108.24±248.76*cddp+gfa200266.15±16.42#2634.38±63.11#cddp+gfa400238.81±24.60#2395.16±142.71#注：与正常对照组相比*p<0.05；与模型组相比#p<0.05（n=8）2.5gfa对肾组织h&e和pas染色的影响h&e染色结果显示空白对照组肾组织中，肾小球及其周围肾小管结构正常且清晰，细胞外基质分布均匀，无病变现象；而顺铂模型组肾小管明显损伤，上皮细胞变性，局部细胞坏死；皮质肾小管各段显示退行性变化，具体表现为刷状缘微绒毛融合，线粒体空泡化，内质网扩张伴脱颗粒及空泡增多。gfa低剂量组与cddp组比较，肾小管上皮细胞坏死程度减轻，细胞核固缩和消失现象减少；gfa高剂量组肾小球囊腔内结构清晰，肾小管上皮细胞坏死明显减少，间质内水肿及细胞浸润减少，细胞形态基本恢复正常。pas染色在普通光学显微镜下显示病理改变肾小管细胞坏死、小管扩张、管内细胞脱落、管型形成，据此进行半定量评估小管坏死程度。空白组小鼠肾小球和肾小管较少糖原沉积，着色较淡，未见病理变化；cddp组肾小球基底膜增厚，系膜基质增生，大量糖原沉积，部分肾小管轻度萎缩或管腔扩张，上皮细胞坏死，细胞核消失；gfa低剂量组肾小球和肾小管细胞内糖原沉积减少；高剂量组细胞形态基本恢复正常。2.6对小鼠肾组织细胞凋亡的影响凋亡细胞通过hoechst33258染色后细胞呈阳性表达，空白对照组肾细胞排列整齐且细胞核清晰可见，几乎没有蓝色荧光细胞；模型组细胞核皱缩，可见部分碎片，呈致密浓染，有大面积蓝色细胞核且荧光较强；给药组荧光强度减小，高剂量组损伤显著缓解。用tunel染色法进行评估gfa对cddp肾损伤细胞凋亡的影响。tunel染色阳性试验显示空白对照组很少管状上皮细胞阳性表达。相反,模型组tunel阳性细胞数显著高于对照组，与模型组比gfa给药组显著降低tunel阳性细胞的数量。推测gfa对抗cddp肾损伤的保护作用可能是通过诱导细胞凋亡实现的。2.7对小鼠肾组织蛋白免疫组织化学表达的影响空白组小鼠细胞结构正常，bcl-2、cox-2主要在胞浆中表达，模型组小鼠肾小管上皮细胞及近曲小管呈阳性表达，细胞核排列杂乱，部分无完整细胞结构；给药剂量组呈现不同程度阳性表达，其中高剂量组较低剂量组细胞形态健康整齐且阳性表达较少。bax、inos主要在细胞的细胞核上阳性表达，模型组细胞核排列紊乱阳性表达非常明显，细胞结构损伤严重，低剂量组细胞核阳性表达明显减少，高剂量组表达情况基本与对照组小鼠相同。cox-2与inos在受到炎性因子刺激的时候呈高表达状态，推测gfa可能有抗炎症作用；bax和bcl-2可共同调节蛋白凋亡，推测gfa保护顺铂诱导肾损伤可能与其抗凋亡作用有关。2.8对小鼠肾组织蛋白免疫荧光表达的影响细胞核经dapi染色后表现为蓝色亮点，4-hne、ho-1细胞阳性表达为红色荧光亮点，cyp2e1细胞阳性表达为绿色荧光亮点。空白对照组小鼠肾细胞结构排列整齐，肾小管结构完整且几乎无荧光表达；模型组小鼠出现大面积荧光表达，细胞严重损伤；给药低高剂量组阳性表达明显减少。该结果显示gfa保护肾损伤可能是抗氧化作用而实现的。2.9gfa对小鼠肾组织bax和bcl-2免疫蛋白印记分析的影响bax和bcl-2可共同调节蛋白凋亡，促凋亡蛋白bax主要在细胞的细胞核上阳性表达而抗凋亡蛋白bcl-2主要在胞浆中表达。结果表明，bax蛋白条带上模型组与空白组相比条带颜色深且条带粗，gfa给药组与模型组相比颜色浅且条带较窄，gfa高剂量组与空白组表达结果几乎接近。bcl-2与bax表达相反，但组间结果比较结果与bax相同。bax和bcl-2免疫蛋白印记分析结果与免疫组织化学结果一致，由此说明gfa保护顺铂诱导肾损伤与其抗凋亡作用有关。3讨论研究结果显示，25mg/kg顺铂诱导小鼠血清中bun和cre水平显著升高，炎症因子tnf-α和il-1β含量也增加，肝组织中sod、cat和gsh水平的降低以及mda水平的升高，模型组肾细胞肿胀，肾小管明显损伤，上皮细胞变性，局部细胞坏死；皮质肾小管各段显示退行性变化，说明造模成功；gfa给药组与模型组相比血清中bun和cre水平降低，肾组织中sod、cat、gsh升高和mda水平降低，结果显示人参果花青素可以缓解对顺铂造成的肾损伤。顺铂通过肾小球滤过以及肾小管再分泌在体内进行排泄，过量的顺铂在转运酶作用下将其运输到肾小管，细胞色素p450系统是引起活性氧产生催化铁的重要来源，通过细胞色素p450系统，顺铂可引起微粒体内ros形成。ros可使谷胱甘肽的消耗增多，促使抗氧化物sod、cat含量降低，导致mda、4-hne的代谢减少，最终引起mda、4-hne的累积，4-hne是脂质过氧化的标志产物。细胞发生脂质过氧化时诱导型酶ho-1能加快血红素分解代谢的速度，组织ho-1表达增加可增强其抗氧化能力。目前对gfa的活性研究报道相对较少，本实验首次证明gfa对cddp诱导肾损伤具有保护作用，其可能的机制包括抑制氧化应激，减少炎症反应及抑制细胞凋亡，为gfa的深入研究及临床应用提供一定的理论依据。实施例药物的实施例制备药剂的实施例一胶囊剂的制备200g人参果花青素，药用淀粉适量，两者充分混匀，装胶囊，制成1000粒胶囊，每粒重0.25g，每粒含人参果花青素200mg。口服，每次4粒，每日三次。制备药剂的实施例二片剂的制备200g人参果花青素，药用淀粉适量，两者充分混匀，用乙醇做粘合剂制湿颗粒，干燥，过120目筛整粒，装胶囊，每粒200mg，每次口服1-2粒，每日2次。制备药剂的实施例三滴丸剂的制备聚乙二醇4000300g，在水浴上熔化，加入人参果花青素原料200g，搅拌均匀，倾入保温管中，调节恒温装置，使药液在80-90℃下滴入冷却过的液体石蜡中（温度±4℃），滴完后，将药丸倾入滤纸上吸干石蜡油，再加入少量滑石粉，混匀，得人参果花青素滴丸1000粒。口服，一次4粒，每日三次，饭后服用。以上根据上述实施方式对本发明的人参果花青素在制备预防急性肾损伤药物的应用进行了说明，但本发明并不限于上述实施方式，在不脱离其要旨的范围内，可在各种方式中实施本发明。除了上述实施方式之外，其它等同技术方案也应当在其保护范围之内，在此不再一一叙述。当前第1页12