本发明属于医药
技术领域：
：，特别涉及一种外用丹皮酚纳米缓释温度敏感型原位凝胶及其制备方法。
背景技术：
：：丹皮酚(paeonol，pae)，又称牡丹酚，主要是从萝摩科植物徐长卿cynanchumpaniculatum(bunge)kitagawa干燥根或全草和毛茛科芍药属植物牡丹paeoniafruticosaandr、芍药p.lactiflorapall.的根皮中提取分离出来的活性成分。大量研究资料表明，pae具有良好的抗炎抗过敏及抗感染作用，但由于pae的脂溶性极强，生物利用度极低，具有易挥发、易氧化、生物半衰期短等缺点，影响其制剂的稳定性和生物利用度。技术实现要素：为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种外用丹皮酚纳米缓释温度敏感型原位凝胶及其制备方法，增强了丹皮酚的溶解度，提高了药物稳定性，具有良好的缓释性，还具有粒径小，分散性强，稳定性好，缓慢释药，靶向性等优点，提高了丹皮酚生物利用度，延缓其在体内的药物代谢时间，减少辅料用量，降低生产成本，在医药领域有广阔的市场前景。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种外用丹皮酚纳米缓释温度敏感型原位凝胶，由丹皮酚纳米结构脂质载体及在低温下加入其中的泊洛沙姆407(p407)和泊洛沙姆188(p188)组成，其中，所述丹皮酚纳米结构脂质载体由混合油相、混合乳化剂、丹皮酚以及超纯水组成。所述混合油相为硬脂酸和肉豆蔻酸异丙酯(ipm)混合，所述混合乳化剂为辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(labrasol)和二乙二醇单乙基醚(transtolhp)混合。所述丹皮酚纳米结构脂质载体中，以质量分数计，硬脂酸含量3％，ipm含量3％，labrasol含量18％，transtolhp含量15％，丹皮酚含量10％，余量为超纯水。所述p407的加入量为原位凝胶总质量的18～24％，p188的加入量为原位凝胶总质量的0～10％，且不能取0。当p188质量分数不变，p407质量分数增大时，胶凝温度呈下降趋势；当p407质量分数不变，p188质量分数增大时，胶凝温度先升高后趋于平稳。所述低温是4℃。本发明外用丹皮酚纳米缓释温度敏感型原位凝胶的制备方法，包括如下步骤：步骤1，以微乳法制备丹皮酚纳米结构脂质载体；步骤2，以冷溶法制备丹皮酚温度敏感型原位凝胶：将所述丹皮酚纳米结构脂质载体置于冰箱中，4℃冷藏1h，在磁力搅拌下缓慢加入p407和p188，继续搅拌使其分散均匀，放入冰箱，4℃保存＞24h，使泊洛沙姆充分溶胀，最终形成淡蓝色半透明的丹皮酚纳米缓释温度敏感型原位凝胶溶液。所述步骤1中，丹皮酚纳米结构脂质载体的制备方法如下：将混合油相、混合乳化剂、丹皮酚、超纯水混合得到初乳液；将所得初乳液于0℃下分散于冰水中分散，得到淡蓝色乳光的纳米结构脂质载体，为分散液形式。与现有技术相比，本发明制备的丹皮酚纳米粒原位凝胶制剂提高了丹皮酚的靶向及缓释作用，实现了中药材丹皮酚产品产业链的技术升级，提高了中药材丹皮酚的科技含量和产业附加值，促进了区域性经济发展，推进中医药现代化、国际化进程。随着世界范围内大型制药公司的不断投入，制药新技术的不断突破，纳米药物上市已经越来越多，早在2006年，美国已实现商业化纳米药物13个，开发研制130个纳米药物及递送系统，表明药物的发展已进入纳米时代，但目前尚未见关于纳米粒原位凝胶制剂上市。我国目前关于外用纳米制剂、纳米粒原位凝胶制剂、靶向纳米粒原位凝胶制剂均未见产品上市。本发明进行具有明确疗效的中药有效成分丹皮酚纳米粒原位凝胶新制剂研制，该研究成果的推广应用，将可以填补我国中药丹皮酚纳米原位凝胶制剂的市场空白。附图说明图1为丹皮酚nlc纳米粒透射电镜形态图。图2为p407和p188质量分数对丹皮酚纳米缓释温度敏感型原位凝胶胶凝温度的响应面。图3为p407和p188质量分数对丹皮酚纳米缓释温度敏感型原位凝胶胶凝温度的等高线。图4为丹皮酚原料药、丹皮酚nlc、丹皮酚纳米缓释温度敏感型原位凝胶的体外释放曲线。具体实施方式下面结合附图和实施例详细说明本发明的实施方式。鉴于纳米给药系统具有增溶难溶性药物，提高药物生物利用度的特点，能够明显改善药物及制剂的突释效应，延长药物作用时间，减少用药次数，提高患者依从性。而温度敏感型原位凝胶剂作为近年来新型的外用制剂，具有易于涂抹、生物相容性好等优点，局部给药后易于吸收、不污染衣物、稳定性好。本发明提供一种外用丹皮酚纳米缓释温度敏感型原位凝胶及其制备方法。1、本发明外用丹皮酚纳米缓释温度敏感型原位凝胶的制备方法如下：1.1，采用微乳法制备丹皮酚纳米结构脂质载体以质量分数计，先以3％硬脂酸和3％ipm(即质量比1:1)构成混合油相，18％labrasol和15％transtolhp为混合乳化剂(即质量比2:1)，5％丹皮酚，余量用超纯水补齐100％超纯水制备成初乳液。将此初乳液于0℃下于冰水中分散，可得到淡蓝色乳光的纳米结构脂质载体分散液，透射电镜下观察纳米结构脂质载体的粒径与形态，见图1。1.2，采用冷溶法制备丹皮酚温度敏感型原位凝胶。将制备的丹皮酚纳米结构脂质载体置于冰箱中，4℃冷藏1h，在磁力搅拌下缓慢加入p407和p188，继续搅拌使其分散均匀，放入冰箱，4℃保存＞24h，使泊洛沙姆充分溶胀，最终形成淡蓝色半透明的丹皮酚纳米缓释温度敏感型原位凝胶溶液。2、对本发明所得丹皮酚纳米缓释温度敏感型原位凝胶进行温度测定：取制备好的凝胶溶液2ml于西林瓶中，放入20℃水浴锅中，西林瓶内液面低于水浴液面1cm，缓慢升温。每升高0.1℃即倾斜西林瓶45°，观察液体流动情况，不再流动时的温度即为凝胶的相转变温度。3、本发明的处方优化：3.1、试验设计在单因素试验基础上，以胶凝温度为考察指标，选取p407和p188质量分数为考察因素，p407的取值范围为18～24％，p188的取值范围为0～10％。根据星点设计原理，胶凝温度为因变量，每个因素五个水平，分别为±α，±1和0(α＝1.414)，试验设计及结果见表1。表1丹皮酚nlc温敏型原0位凝胶处方星点设计试验分析3.2、模型拟合采用design-expert8.06软件分别对因变量与各自变量的关系进行多元线性回归和二项式方程拟合，得多元线性方程：y＝88.28971-2.68071x1+1.30872x2(r＝0.8779，p＜0.0001)二项式方程：y＝181.15625-11.39904x1+1.19572x2+0.10333x1x2+0.19528x12-0.20570x22(r＝0.9980，p＜0.0001)其中，y为考察指标(即胶凝温度)；x1为自变量p407的百分比；x2为自变量p188的百分比；r为rsd值(即相对标准偏差)；p为概率(用来反映反映某一事件发生的可能性大小。统计学根据显著性检验方法所得到的p值，一般以p<0.05为显著，p<0.01为非常显著，其含义是样本间的差异由抽样误差所致的概率小于0.05或0.01)说明采用二项式方程拟合的效果较好。对二项式方程拟合模型进行方差分析，结果见表2。表2回归模型的方差分析方差来源ssfmsfp模型488.80597.76707.63<0.0001x1258.701258.701872.60<0.0001x2171.271171.271239.76<0.0001x1x22.4012.4017.390.0042x125.3715.3738.880.0004x2245.99145.99332.91<0.00013.3、响应面优化与预测应用design-expert8.06软件绘制各自变量对响应值的三维效应面，见图2，二维等高线，见图3。结果显示当p188质量分数不变，p407质量分数增大时，丹皮酚纳米缓释温度敏感型原位凝胶溶液的胶凝温度呈下降趋势；当p407质量分数不变，p188质量分数增大时，胶凝温度先升高后趋于平稳，与单因素试验一致。据文献报道，温敏凝胶在体外的胶凝温度均在25～27℃之间，但考虑到夏季高温，凝胶在室温下即会发生相转变，需冷冻储存，不便于患者用药，因此确定胶凝温度在32～34℃，得处方1(x1＝22.85％，x2＝3.37％)，处方2(x1＝22.90％，x2＝3.34％)，处方3(x1＝21.39％，x2＝1.97％)，处方4(x1＝23.02％，x2＝3.76％)，处方5(x1＝23.06％，x2＝4.44％)。4、工艺验证按上述的5个处方制备丹皮酚纳米缓释温度敏感型原位凝胶，平行三份，测定胶凝温度，与预测值比较，见表3。结果表明，各处方的实测值与预测值差异较小。其中处方2的实测值与预测值偏差最小，故选择处方2进行后续研究。表3丹皮酚纳米缓释温度敏感型原位凝胶处方的验证试验(n＝3)处方p407/％p188/％预测值/℃实测值/℃偏差/％122.853.3732.733.8±0.2-3.36222.903.3433.633.4±0.10.60321.391.9732.733.8±0.3-3.36423.023.7633.334.5±0.2-3.60523.064.4432.432.8±0.3-1.23注：偏差＝(预测值—实测值)/预测值×100％5、体外释放性能考察5.1、色谱条件agilentzorbaxeclipsexdb-c18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流动相甲醇-水(70:30)，检测波长:274nm，进样量10μl，流速1.0ml·min-1，柱温30℃。5.2、标准曲线绘制准确称取丹皮酚对照品10.71mg置于50ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，得214.20μg·l-1储备液。以透析介质为溶剂，配制质量浓度分别为11.90、23.80、35.70、59.50、71.40、107.10μg·ml-1的丹皮酚对照品溶液，按5.1项下色谱条件测定，以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，得回归方程yy＝40.255x+16.950，r＝0.9998，线性范围11.90～107.10μg·ml-1。5.3、精密度考察精密吸取高、中、低质量浓度的丹皮酚对照品溶液适量，按5.1项下色谱条件连续进样6次，计算峰面积的rsd分别为0.5％，0.4％和0.2％，表明仪器精密度良好。5.4、回收率测定取适量空白凝胶，分别精密加入高、中、低质量浓度(107.10、59.50、11.90μg·ml-1)的丹皮酚对照品溶液1ml，用相应介质稀释并混匀，经0.45μm微孔滤膜滤过，按5.1项下色谱条件测定，计算回收率分别为0.98％、0.96％、0.97％，rsd依次为0.98％、0.96％、0.97％，见表4。表4丹皮酚回收率试验table4recoverytestofpaeonol6、体外药物释放分别精密量取丹皮酚原料药、丹皮酚纳米结构脂质载体和丹皮酚纳米缓释温度敏感型原位凝胶各5ml，置于透析袋中，将透析袋置于500ml水浴温度(34±0.5)℃的生理盐水中，转速100r·min-1磁力搅拌，每隔一定时间取样2ml，并补充等量同温度生理盐水。按5.1项下色谱条件测定丹皮酚含量，计算累积释放度，见图4。结果显示与原料药相比，丹皮酚纳米结构脂质载体及丹皮酚纳米缓释温度敏感型原位凝胶的体外释放均较缓慢，均具有明显的缓释效果，而丹皮酚纳米缓释温度敏感型原位凝胶的释放与丹皮酚纳米结构脂质载体相比得到了较为显著的延长，24h内丹皮酚纳米结构脂质载体和丹皮酚纳米缓释温度敏感型原位凝胶的累积释放量分别为59.18％和51.19％。当前第1页12当前第1页12