一、技术领域
本发明涉及生物、化学和药品领域，特别涉及羟基酪醇脂质体的制备方法。
二、
背景技术：
脂质体主要是由类脂材料组成的双分子层空心小球，同时具有亲水性和疏水性两种性质，因此既能包封脂溶性物质又能包埋水溶性物质。将类脂材料分散于水中时，水溶性物质会自发地分布在脂质体的内部，而脂溶性物质分布在脂质体的亲脂端。脂质体的制备方法主要有：薄膜分散法、超声波分散法、冻融法、乙醇注入法、逆相蒸发法等。其理化性质的评价指标主要有：脂质体平均粒径及其粒径分布、包封率、物化稳定性等。制备的脂质体具有靶向性、缓释性、保护性、低剂量、长效性、低毒性等优点。
长循环脂质体又称长效脂质体，是一种表面含有天然或合成聚合物修饰的类脂衍生物的新型脂质体。在血液中驻留时间延长，从而延长药物作用时间，具有长效作用。常用的修饰物有聚乙二醇(peg)和神经节甘酯(gm1)。gm1增强膜刚性，减少单核吞噬细胞系统(mps)的摄取，这种长循环脂质体在血液中的滞留量与被mps摄取量的比值高于传统脂质体几十倍。但gm1难以大量获得，且有一定的免疫毒性。含有peg的类脂衍生物，它们在脂质体表面具有高度修饰的作用，能形成空间位阻层，这种立体位阻能够保护脂质体不被识别、摄取，使其消除减慢，作用时间延长。
油橄榄中包含大量的多酚类化合物，如橄榄苦苷、羟基酪醇、毛蕊花苷和酪醇等。尤其是羟基酪醇(3，4-二羟基苯乙醇，hydroxytyrosol，简称ht)，清除自由基的能力强，表现出独特的生物和药理活性，如抗氧化、抗菌、抗炎、改善心脏的冠脉血流、有效地抑制由丙烯醛造成视网膜上皮细胞的氧化损伤和线粒体功能失调，保护软骨和抗骨质疏松等。而且ht还能抑制人类早幼细胞白血病细胞hl-60、结肠癌细胞ht-29、女性乳腺癌细胞mcf-7等扩散，透过阻滞肿瘤细胞的循环及诱发其凋亡，具有很好的抗癌活性。尽管ht有诸多生物和药理活性，已逐渐引起研究者的关注。但是，ht含有3个酚羟基，暴露在空气中极易被氧化，性质很不稳定。且亲水性强，难以更好地溶于细胞膜结构以增强其功效性。如果将ht制备为脂质体后，不但能保护其不受外界环境因素的影响提高稳定性，还能增强其生物利用度(抗癌、抗菌、抗氧化等生物活性)。
国内外的文献报道了从油橄榄叶或橄榄果提取分离橄榄苦苷、羟基酪醇、毛蕊花苷和酪醇等多酚类化合物，但目前采用橄榄叶提取油橄榄多酚提取物大多是10～40％橄榄苦苷提取物，羟基酪醇含量小于10％，毛蕊花苷低于5％，限制油橄榄多酚活性的多功能开发。
三、
技术实现要素：
为了解决橄榄苦苷、羟基酪醇、毛蕊花苷等高活性多酚稳定性与生物活性，本发明找到一种富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物复合方法，并且加工成长循环脂质体，因此，本发明的技术方案是采用如下步骤来实现：
第一步：油橄榄多酚提取物制备
取油橄榄叶，加入30～50％乙醇提取，油橄榄叶与30～50％乙醇质量体积比(kg∶l)1∶5～20，提取两次，温度70～85℃，合并提取液，滤液过陶瓷膜(孔径50nm)和分子量3000da超滤膜，再用纳滤膜浓缩滤液，滤液过纳滤膜，橄榄叶与浓缩滤液质量体积比(kg∶l)1∶1～3，浓缩液真空干燥，粉碎成粉制成油橄榄多酚提取物，hplc分析，其中橄榄苦苷10～40％，毛蕊花苷3～6％，羟基酪醇2～7％，水溶性为100ml水溶解2～8g；
第二步：富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物制备
将90％羟基酪醇与10～40％橄榄苦苷提取物及90％毛蕊花苷复配，按质量比例为4～8∶2～5∶1～3，加入3～8倍无水乙醇，60～90℃加热回流10～30min，样品充分溶解后过滤，减压浓缩，制备富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物，其中羟基酪醇为50～70％，橄榄苦苷为10～20％，毛蕊花苷为5～15％；
第三步：薄膜分散-机械振荡法制备长循环油橄榄多酚脂质体
以富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物为包封目标，设计温度40～70℃、卵磷脂与胆固醇质量比为1∶1～8∶1，称卵磷脂与胆固醇质量3～10g，表面活性剂吐温-80体积2～10ml，peg2001～5g，放人圆底烧瓶中，加入适量有机溶剂，超声振荡5～20min，溶解后减压薄膜蒸发除去溶剂，再加入1～4mg/ml羟基酪醇(ht)水溶液1～10ml，油橄榄多酚水溶液1～3ml，旋转洗膜水化时间5～50min，再超声溶解5～30min可得到脂质体。根据单因素与正交设计优化，制备均匀的乳白色长循环脂质体，具有稳定性、缓释性、抗氧化性和抑菌性等功能；
第四步：富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体包封率
取脂质体于烧杯中，加入去离子水，脂质体与去离子水质量体积比浓度为2～15mg/ml，放入透析袋中，在室温下透析1～15h，hplc分析水溶性中ht浓度(c)和透析滤液中ht浓度(c0)，ht水溶性体积(v)，透析滤液的总体积(v0)，根据下式计算富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体包封率为20～80％以上；
第五步：富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体平均粒度及其分布
将1～10mg/ml脂质体放入比色皿中，加入一定量的去离子水，用zetaplus型激光粒度仪在光源波长368nm和散射角90°下室温测试，制备的脂质体的粒径分布在200～1000nm。
第六步：富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体的稳定性
1.物理稳定性：取1～8mg/ml脂质体悬浊液和相同浓度ht水溶液，分别用4000r/min～10000r/min离心机离心10～20min，制备的脂质体在4000～6000r/min无沉淀和不分层，乳液稳定；于4℃～25℃下贮藏0～30d，脂质体中羟基酪醇和毛蕊花苷稳定，相同条件下比ht水溶液中ht稳定性提高20～40％；
2.水解稳定性：在薄膜分散-机械振荡法制备脂质体悬浮液，在ph值为3.0～7.0的柠檬酸缓冲液(0.1～0.5mol/l柠檬酸溶液与0.2～0.5mol/l磷酸氢二钠溶液)，分别测定各脂质体的包封率，结果是，随着水化液ph值的升高，包封率增加。
第七步：富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体的缓释性
配制ht浓度为1～8mg/ml脂质体悬液，移取悬液1～5ml放入透析袋内，将其完全浸入含有100ml生理盐水的烧杯中；将烧杯放入37℃恒温的水浴锅内，在24h内每间隔2h分析透析滤液中ht浓度。与相同浓度ht水溶液作对照，ht水溶液2h内释放了(43.66±1.82)％，脂质体释放了(28.62±1.87)％；24h后，ht溶液和脂质体释放分别为(73.41±1.72)％和(55.72±1.88)％，相同条件下脂质体提高30～65％的缓释性能。
第八步：富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体的抗氧化性
将脂质体悬液和ht水溶液样品分别配成0.25、0.5、1、1.5、2μg/ml的无水乙醇待测溶液。1ml待测样品加入40mg/ldpph醇溶液3ml，充分混匀后，室温下避光反应30min，在517nm波长下测定吸光度(ai)。每个样品平行3次，取平均值。经计算得知ht脂质体的ic50为0.5～2μg/ml，为ht水溶液和脂质体对dpph自由基清除效果大体一致。说明利用脂质体技术把ht制备成相应脂质体后，它对dpph自由基的清除效果并没有受到影响。
样品溶液对dpph自由基清除率(η)的计算公式如下：
式中：
a0——1ml待测样品与3ml无水乙醇的混合液30min后的吸光值(空白值)；
a1——1ml无水乙醇与3mldpph醇溶液混合反应30min后的吸光值(自由基总值)；
ai——1ml待测样品与3mldpph醇溶液混合反应30min后的吸光值。
第九步：富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体的抑菌性
采用菌体浓度为105cfu/ml的菌悬液配制脂质体悬液和ht水溶液样品浓度浓度依次为1024、512、256、128、64、32、16、8、4、2、1μg/ml的样品溶液。将上述配好的溶液放置恒温恒湿培养箱内，37℃培养24h后观察结果，试管中几乎无浑浊现象对应的样品浓度作为此样品的mic值。每种样品做3个平行测试。在mic测定结果的基础上，选取未见细菌生长的各管培养液，移取0.1ml涂布于固体培养基上，放置37℃培养箱内，24h后观察结果，仍无细菌生长现象对应的样品浓度作为此样品的mbc值。相对于ht水溶液，脂质体的抑菌效果相当，且对金黄色葡萄球菌的mic为4～16μg/ml，mbc值为16～64μg/ml。对大肠杆菌的mic为16～64μg/ml，mbc值为32～128μg/ml。
橄榄苦苷、羟基酪醇、毛蕊花苷等多酚类化合物具有较好醇溶性，目前市场生产的橄榄提取物不仅橄榄苦苷、羟基酪醇、毛蕊花苷等多酚类化合物含量低，而且水溶性不好，为了改善橄榄苦苷提取物水溶性，有利于脂质体制备与活性，在本发明中，采用30～50％乙醇提取油橄榄叶，提取两次，温度70～85℃，采用陶瓷膜(孔径50nm)和分子量3000da超滤膜过滤，再用纳滤膜浓缩滤液，去掉大分子蛋白、多糖、胶质体、单宁等，浓缩物为水溶性小分子橄榄苦苷、羟基酪醇、毛蕊花苷等多酚类化合物，真空干燥，粉破成粉制成油橄榄多酚提取物，水溶性为100ml水溶解1～6g，具有很好的水溶性。
为了达到油橄榄多酚提取物长循环脂质体的效果，本发明采用薄膜分散-机械振荡法。旋蒸减压成膜压力-0.05～-0.1mpa，温度50～70℃、真空冷冻干燥成膜压力2～10mpa，温度-10～-50℃，超声机械振荡功率100～200w，时间20～40min，高速剪切功率500～1000w，时间5～10min，采用其中一种或者几种方法达到薄膜分散的效果。
为了改善油橄榄多酚提取物长循环脂质体的稳定性，采用磷脂为表面活性乳化剂，优选大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂和氢化大豆磷脂中的一种或复合。为了更好的分散，也添加胆固醇质量3～10g，表面活性剂吐温-80体积2～10ml，peg2001～5g，形成均一稳定的乳相。为了油橄榄多酚提取物及乳化助剂充分溶解形成均相，采用无水乙醇、丙酮、异丙酮和氯仿中的一种作为有机溶剂。
本发明的有益效果表现为：
创新性制备富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物，羟基酪醇为50～70％，橄榄苦苷为10～20％，毛蕊花苷为5～15％，活性多酚中羟基酪醇、橄榄苦苷和毛蕊花苷比例合理，水溶性高达100ml水溶解6g多酚提取物，浓度高，抗氧化活性更高。
2.采用薄膜分散-机械振荡法制备了油橄榄多酚提取物脂质体，包封率高、粒径分布均匀、稳定性好；
3.制备的富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体具有缓释性，可减少用药次数；
4.制备的富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体具有一定的抗氧化性和抑菌性。
四、附图说明：
附图1温度对富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体包封率的影响；
附图2卵胆比对富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体包封率的影响；
附图3吐温-80体积对富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体包封率的影响；
附图4ht质量对富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体包封率的影响。
五、具体实施方式
以下实施例为本发明的一些举例，不应被看做是对本发明的限定。
实施例1
油橄榄多酚提取物制备
取1kg油橄榄叶，加入30％乙醇8l提取，温度85℃，提取时间2小时，提取两次，合并提取液，分别采用陶瓷膜(孔径50nm)和分子量3000da超滤膜过滤，再用纳滤膜浓缩滤液至1.5l，浓缩物真空干燥，粉破成粉制成油橄榄多酚提取物，hplc分析，其中橄榄苦苷36.8％，毛蕊花苷5.6％，羟基酪醇3.4％，水溶性为100ml水溶解5.2g。
实施例2
富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物制备
将90％羟基酪醇与36.8％橄榄苦苷提取物及90％毛蕊花苷复配，按质量比例为4～8∶2～5∶1～3，优选4～5∶2～3∶1～2，加入4倍无水乙醇，60℃加热回流20min，样品充分溶解后过滤，减压浓缩，制备富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物，hplc分析，其中羟基酪醇为56％，橄榄苦苷为18％，毛蕊花苷为7％；
为了达到油橄榄多酚提取物长循环脂质体的效果，本发明采用薄膜分散-机械振荡法。旋蒸减压成膜压力-0.05～-0.1mpa，温度50～70℃、真空冷冻干燥成膜压力2～10mpa，温度-10～-50℃，超声机械振荡功率100～200w，时间20～40min，高速剪切功率500～1000w，时间5～10min，采用其中一种或者几种方法达到薄膜分散的效果。
为了改善油橄榄多酚提取物长循环脂质体的稳定性，采用磷脂为表面活性乳化剂，优选大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂和氢化大豆磷脂中的一种或复合。为了更好的分散，也添加胆固醇质量3～10g，表面活性剂吐温-80体积2～10ml，peg2001～5g，形成均一稳定的乳相。为了油橄榄多酚提取物及乳化助剂充分溶解形成均相，采用无水乙醇、丙酮、异丙酮和氯仿中的一种作为有机溶剂。
实施例3
富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体的制备
以富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物为包封目标，设计温度40～70℃，优选55℃，卵磷脂与胆固醇质量比为3∶1称卵磷脂与胆固醇质量4g，表面活性剂吐温-80体积5ml，peg2003.5g，放入圆底烧瓶中，加入丙酮，超声振荡10min，溶解后减压薄膜蒸发除去溶剂，旋蒸减压成膜压力-0.05～-0.1mpa，温度50～70℃、真空冷冻干燥成膜压力2～10mpa，温度-10～-50℃，超声机械振荡功率100～200w，时间20～40min，高速剪切功率500～1000w，时间5～10min。再加入3mg/ml羟基酪醇(ht)水溶液6ml，油橄榄多酚提取物水溶液2ml，旋转洗膜水化时间15min，再超声溶解20min可得到脂质体。
实施例4
富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体的包封率
取0.05g脂质体于烧杯中，加入10ml去离子水，再放入处理过的透析袋中，在室温下透析9h后测定其中ht含量，并计算ht的包封率。脂质体包封率的计算公式：
式中：
c——ht水溶液的浓度，mg/ml；
v——ht水溶液的体积，ml；
c0——透析滤液中ht的浓度，mg/ml；
v0——透析滤液的总体积，ml。
当ht水溶液浓度为2mg/ml，ht水溶液体积为2ml，卵胆比为4∶1(卵磷脂80mg，胆固醇20mg，下同)，吐温-80为6ml，制备温度为65℃，可得到ht脂质体的包封率为37.51％。
实施例4
富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体的缓释性
配制ht浓度为1mg/ml脂质体悬液，移取悬液2ml放入透析袋内，将其完全浸入含有100ml生理盐水的烧杯中；将烧杯放入37℃恒温的水浴锅内，在24h内每间隔2h分析透析滤液中ht浓度。与相同浓度ht水溶液作对照，ht水溶液2h内释放了(43.66±1.82)％，脂质体释放了(28.62±1.87)％；24h后，ht溶液和脂质体释放分别为(73.41±1.72)％和(55.72±1.88)％，相同条件下脂质体提高30～55％的缓释性能。
实施例5
富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体的抗氧化性
将脂质体悬液和ht水溶液样品分别配成0.25、0.5、1、1.5、2μg/ml的无水乙醇待测溶液。1ml待测样品加入40mg/ldpph醇溶液3ml，充分混匀后，室温下避光反应30min，在517nm波长下测定吸光度(ai)。每个样品平行3次，取平均值。经计算得知ht脂质体的ic50为0.5～2μg/ml，为ht水溶液和脂质体对dpph自由基清除效果大体一致。说明利用脂质体技术把ht制备成相应脂质体后，它对dpph自由基的清除效果并没有受到影响。
样品溶液对dpph自由基清除率(η)的计算公式如下：
式中：
a0——1ml待测样品与3ml无水乙醇的混合液30min后的吸光值(空白值)；
a1——1ml无水乙醇与3mldpph醇溶液混合反应30min后的吸光值(自由基总值)；
ai——1ml待测样品与3mldpph醇溶液混合反应30min后的吸光值。
实施例6
富含羟基酪醇和毛蕊花苷油橄榄多酚提取物长循环脂质体的抑菌性
采用菌体浓度为105cfu/ml的菌悬液配制ht脂质体悬液和ht水溶液样品浓度浓度依次为1024、512、256、128、64、32、16、8、4、2、1μg/ml的样品溶液。将上述配好的溶液放置恒温恒湿培养箱内，37℃培养24h后观察结果，试管中几乎无浑浊现象对应的样品浓度作为此样品的mic值。每种样品做3个平行测试。在mic测定结果的基础上，选取未见细菌生长的各管培养液，移取0.1ml涂布于固体培养基上，放置37℃培养箱内，24h后观察结果，仍无细菌生长现象对应的样品浓度作为此样品的mbc值。相对于ht水溶液，脂质体的抑菌效果相当，且对金黄色葡萄球菌的mic和mbc值分别为8和32μg/ml。对大肠杆菌的mic和mbc值分别为32和64μg/ml。