低积雪草苷含量总苷出发同时制备积雪草苷和羟基积雪草苷的工艺的制作方法

专利名称：低积雪草苷含量总苷出发同时制备积雪草苷和羟基积雪草苷的工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种低积雪草苷含量总苷出发同时制备积雪草苷和羟基积雪草苷的 工艺。积雪草Centella asiatica (L. ) UrBan为伞形科植物，植物学家林奈 (Linnaeus, Carolus)于1764年将积雪草归入天胡荽属(Hydrocotyle)，并定名为 Hydrocotyleasiatica L.。在1879年，德国人UrBan根据花瓣的排列以及果实的棱数将其 从天胡荽属中的独立出来并建立积雪草属(Centella)，积雪草归入该属并更名为Centella asiatica (L)Urb.。积雪草主要分布于南北半球热带和亚热带地区，主产地为南非、印度、 斯里兰卡、马来西亚、印度尼西亚、澳大利亚、日本等，我国亦产积雪草。积雪草在中国的药 用历史已达二千多年之久，民间常用于治疗感冒、扁桃腺炎、传染性肝炎、痢疾、跌打损伤、 疔疮肿毒、外伤出血等。积雪草现代药理学研究和应用有了很大发展，表明积雪草可用于治 疗抑郁症、皮肤创伤、胃溃疡、传染性肝炎、皮肤病和流行性脑脊髓膜炎等。积雪草的化学成分复杂，主要有三萜类、黄酮类、挥发油类、多炔烯类等。积 雪草总苷是积雪草提物中主要的药效成分，主要由积雪草苷(Aisaticoside，CAS No. 16830-15-2)、羟基积雪草苷(Asaiticoside A ；Madecassoside, CAS No. :34540-22_2)和 积雪草苷B (Asaiticoside B，CAS No. : 125265-68-1)等物质组成。其中积雪草苷在医药、 化妆品等领域已有广泛应用，研究表明积雪草苷具有促进伤口愈合，治疗疤痕的药理作用。积雪草苷(a)、羟基积雪草苷(b)与积雪草苷B(C)的结构式如下(R = Glu-Glu-Rha)在工业上，从积雪草中提取的积雪草总苷产品常因积雪草产地或工艺的不同而导 致其中积雪草苷、羟基积雪草苷与积雪草苷B的含量有明显的变化。有些积雪草总苷中积 雪草苷含量大于20%且羟基积雪草苷/积雪草苷(w/w)小于2，有些则积雪草苷含量低于 20%且羟基积雪草苷/积雪草苷(w/w)大于2。对于上述两种积雪草总苷中的前者，浙江大学化工系制药工程研究所绿色制药工 程研究室的吕秀阳研究员课题组成功开发的采用结晶法从积雪草总苷出发制备积雪草苷
背景技术：
纯品的工艺(专利CN2008-10162211)，可以高效地制备得到高纯度的积雪草苷产品，具有 高效节能、产品纯度高、回收率高等特点。但此工艺应用于后者时，却存在积雪草苷回收率 偏低、产品纯度不高的问题。同时，为了从该工艺过程的结晶余液中进一步回收残留的积雪 草苷与羟基积雪草苷，非常有必要寻找一种从低积雪草苷含量总苷出发同时制备积雪草苷 和羟基积雪草苷的工艺。

发明内容
本发明的目的是提供一种低积雪草苷含量总苷出发同时制备积雪草苷和羟基积 雪草苷的工艺。工艺的步骤如下1)低积雪草苷含量总苷在50 65°C下用甲醇加热溶解，冷却结晶得到固形物I 与结晶母液I ；2)固形物I继续在50 65°C下用甲醇加热溶解，冷却结晶得到固形物II与结晶 母液II ；3)固形物II再次在50 65°C下用甲醇加热溶解，冷却结晶得到固形物III与结 晶母液III ；4)固形物III经真空干燥后得到高纯度羟基积雪草苷；5)结晶母液I经大孔吸附树脂纯化，富含总苷的收集液浓缩后真空干燥，得到高 积雪草苷含量总苷；6)高积雪草苷含量总苷用溶剂I溶解、再加入溶剂II结晶得到固形物IV与结晶 母液IV ；7)固形物IV经真空干燥后得到高纯度积雪草苷；8)合并结晶母液II、III、IV经大孔吸附树脂纯化，富含总苷的收集液浓缩后真空 干燥作为起始原料回至步骤1)。其中步骤6)中溶剂I为甲醇或二甲基甲酰胺，加入量为2. 5 10mL/g积雪草总 苷。步骤6)中溶剂II为丙酮、乙腈、乙醚、乙酸乙酯或水，加入量为溶剂I加入量的0.5 10 倍。步骤 5)、8)中的大孔吸附树脂型号为 HPD100、HPD200、HPD300、HPD400、HPD500、 HPD600、HPD700、X_5、AB-8 或 D4020。本发明中的低积雪草苷含量总苷是指积雪草苷、羟基积雪草苷、积雪草苷B总含 量大于70%，积雪草苷含量低于20%且羟基积雪草苷/积雪草苷(w/w)大于2的积雪草总 苷。高积雪草苷含量总苷是指积雪草苷、羟基积雪草苷、积雪草苷B总含量大于70%，积雪 草苷含量高于20%且羟基积雪草苷/积雪草苷(w/w)小于2的积雪草总苷。高纯度积雪草 苷是指纯度大于90%的积雪草苷产品，高纯度羟基积雪草苷是指纯度大于90%的羟基积 雪草苷产品。冷却结晶过程在室温下进行，结晶时间通常在4小时以上。本发明具有过程简单、生产成本低、污染少、产品积雪草苷收率和纯度高等优点， 适合于工业化生产。


附图是低积雪草苷含量总苷出发同时制备积雪草苷和羟基积雪草苷的工艺流程简图。
具体实施例方式以下用实施例对本发明的工艺方法作进一步的说明。本发明的保护范围不受实施 例的限制，本发明的保护范围由权利要求书决定。积雪草总苷原料由广西昌洲天然药业有限公司提供，经检测其中积雪草苷质量含 量为15. 0 %，羟基积雪草苷含量为33 %，积雪草苷B质量含量占28 %。实施例中所用的分析条件如下高效液相色谱(HPLC)分析条件AgilentllOO液相色谱分析系统，色谱柱为 Synergi 4 μ Hydro-RP 80Α reversed—phase column(4. 6mmX 250mm,4 μ m, Phenomenex), 流动相甲醇-水(60 40)，流速0.5mL/min，柱温25°C，紫外检测波长205nm，积雪草苷标 准对照品购自Sigma公司，羟基积雪草苷标准对照品购自中国药品生物制品检定所。本发明中大孔吸附树脂纯化的具体步骤如下1)结晶母液经浓缩后真空干燥，再用水溶解至1. 5g/L浓度；2)在层析柱中装入预处理的大孔吸附树脂，高径比为3 5 ；3)物料溶液以0. 5 1. 5BV/h的流速流过树脂柱，至流出液中总皂苷穿透；4)4个床层体积的水洗涤树脂柱，接着用乙醇-水混合流动相(乙醇的体积百分比 为30% )以0. 5 2BV/h的流速洗脱积雪草总皂苷，洗脱液经HPLC分析后合并得到富含总 苷的收集液。实施例1取60g积雪草总苷原料加入烧杯中，加入150mL甲醇(2. 5mL溶剂I/g积雪草总 苷)，加热至50°C溶解后冷却结晶得到固形物I与结晶母液I ；固形物I经真空干燥后重量 为37. 2g，加入93mL甲醇(2. 5mL溶剂I/g积雪草总苷)，加热至50°C溶解后冷却结晶得到 固形物II与结晶母液II ；固形物II经真空干燥后重量为28. lg，加入140. 4mL甲醇(5mL 溶剂I/g积雪草总苷)加热至50°C溶解后冷却结晶得到固形物III与结晶母液III ；固形 物III经真空干燥后羟基积雪草苷产品，重量为17. 5g，收率80. 6%，纯度91. 2%。结晶母液I经浓缩后真空干燥，重量为40. 5g，用27L水溶解制成总苷水溶液。在 内径为4cm的层析柱中装入经预处理的大孔吸附树脂HPD100，树脂柱高为12cm(高径比为 3)，树脂柱的床层体积为150. SmL ；总苷水溶液以0. 5BV/h的流速过层析柱，至流出液中雪 草总苷穿透，共加入总苷水溶液6. 7L ；先用4个床层体积的水洗涤树脂柱，接着用乙醇-水 混合流动相以0. 5BV/h的流速洗脱积雪草总皂苷，乙醇-水混合流动相中乙醇的体积百分 比为30%。上述大孔吸附树脂纯化过程重复3次，洗脱液经HPLC分析后合并，浓缩后真空 干燥，重量为16. 7g，加入41. SmL甲醇(2. 5mL溶剂I/g积雪草总苷)，溶解后加入41. SmL 水(溶剂I加入量的1倍)进行结晶，然后经过滤得到固形物IV与结晶母液IV ；固形物IV 经真空干燥后即为高纯度积雪草苷产品，重量为6. 8g，收率69. 6%，纯度91. 4%。合并结晶母液II、III、IV经浓缩后真空干燥，重量为12g后用水溶解制成总苷水 溶液，用8L水溶解，在内径为3cm的层析柱中装入经预处理的大孔吸附树脂HPD100，树脂 柱高为9cm(高径比为3)，树脂柱的床层体积为63. 6mL ；总苷水溶液以0. 5BV/h的流速过层 析柱，至流出液中雪草总苷穿透，共加入总苷水溶液2. 8L ；先用4个床层体积的水洗涤树脂柱，接着用乙醇_水混合流动相以0. 5BV/h的流速洗脱积雪草总皂苷，乙醇_水混合流动相 中乙醇的体积百分比为30%。上述大孔吸附树脂纯化过程重复2次，洗脱液经HPLC分析后 合并得到富含总苷的收集液，收集液经浓缩后真空干燥，重量为8. 3g，作为起始原料回用。实施例2取60g积雪草总苷原料加入烧杯中，加入300mL甲醇(5mL溶剂I/g积雪草总苷)， 加热至55°C溶解后冷却结晶得到固形物I与结晶母液I ；固形物I经真空干燥后重量为 27. 6g，加入138mL甲醇(5mL溶剂I/g积雪草总苷)，加热至55°C溶解后冷却结晶得到固形 物II与结晶母液II ；固形物II经真空干燥后重量为16. 3g，加入40. 7mL甲醇(2. 5mL溶剂 I/g积雪草总苷)加热至55°C溶解后冷却结晶得到固形物III与结晶母液III ；固形物III 经真空干燥后羟基积雪草苷产品，重量为12. 6g，收率58. 7%，纯度92. 5%。结晶母液I经浓缩后真空干燥，重量为44. 4g，用29. 6L水溶解制成总苷水溶液。 在内径为3cm的层析柱中装入经预处理的大孔吸附树脂HPD200，树脂柱高为12cm(高径比 为4)，树脂柱的床层体积为84. SmL ；总苷水溶液以lBV/h的流速过层析柱，至流出液中雪草 总苷穿透，共加入总苷水溶液3. 8L ；先用4个床层体积的水洗涤树脂柱，接着用乙醇_水混 合流动相以lBV/h的流速洗脱积雪草总皂苷，乙醇-水混合流动相中乙醇的体积百分比为 30 %。上述大孔吸附树脂纯化过程重复7次，洗脱液经HPLC分析后合并，浓缩后真空干燥， 重量为20. 6g，加入103. 2mL 二甲基甲酰胺(5mL溶剂I/g积雪草总苷)，溶解后加入51. 6mL 水(溶剂I加入量的0.5倍)进行结晶，然后经过滤得到固形物IV与结晶母液IV;固形物 IV经真空干燥后即为高纯度积雪草苷产品，重量为5. 2g，收率53. 3 %，纯度90. 8 %。合并结晶母液II、III、IV经浓缩后真空干燥，重量为18. 5g后用水溶解制成总苷 水溶液，用12. 3L水溶解，在内径为4cm的层析柱中装入经预处理的大孔吸附树脂HPD200， 树脂柱高为12cm(高径比为3)，树脂柱的床层体积为150. SmL ；总苷水溶液以lBV/h的流速 过层析柱，至流出液中雪草总苷穿透，共加入总苷水溶液6. 7L ；先用4个床层体积的水洗涤 树脂柱，接着用乙醇_水混合流动相以lBV/h的流速洗脱积雪草总皂苷，乙醇-水混合流动 相中乙醇的体积百分比为30%。上述大孔吸附树脂纯化过程重复1次，洗脱液经HPLC分析 后合并得到富含总苷的收集液，收集液经浓缩后真空干燥，重量为12. Sg,作为起始原料回 用。实施例3取60g积雪草总苷原料加入烧杯中，加入450mL甲醇(7. 5mL溶剂I/g积雪草总 苷)，加热至60°C溶解后冷却结晶得到固形物I与结晶母液I ；固形物I经真空干燥后重量 为18g，加入135mL甲醇(7. 5mL溶剂I/g积雪草总苷)，加热至60°C溶解后冷却结晶得到固 形物II与结晶母液II ；固形物II经真空干燥后重量为7. 7g，加入57. 4mL甲醇(7. 5mL溶 剂I/g积雪草总苷)加热至60°C溶解后冷却结晶得到固形物III与结晶母液III ；固形物 III经真空干燥后羟基积雪草苷产品，重量为3. 6g，收率17. 2%，纯度93. 9%。结晶母液I经浓缩后真空干燥，重量为54. 4g，用36. 2L水溶解制成总苷水溶液。 在内径为4cm的层析柱中装入经预处理的大孔吸附树脂HPD300，树脂柱高为20cm(高径 比为5)，树脂柱的床层体积为251. 3mL ；总苷水溶液以1. 5BV/h的流速过层析柱，至流出液 中雪草总苷穿透，共加入总苷水溶液11. 2L ；先用4个床层体积的水洗涤树脂柱，接着用乙 醇_水混合流动相以1. 5BV/h的流速洗脱积雪草总皂苷，乙醇-水混合流动相中乙醇的体积百分比为30%。上述大孔吸附树脂纯化过程重复2次，洗脱液经HPLC分析后合并，浓缩 后真空干燥，重量为30. 6g，加入229. 3mL甲醇(7. 5mL溶剂I/g积雪草总苷)，溶解后加入 917. ImL水(溶剂I加入量的4倍)进行结晶，然后经过滤得到固形物IV与结晶母液IV ； 固形物IV经真空干燥后即为高纯度积雪草苷产品，重量为5. 1 g，收率52. 3 %，纯度90. 3 %。合并结晶母液II、III、IV经浓缩后真空干燥，重量为27. 5g后用水溶解制成总苷 水溶液，用18. 3L水溶解，在内径为3cm的层析柱中装入经预处理的大孔吸附树脂HPD300， 树脂柱高为15cm(高径比为5)，树脂柱的床层体积为106mL ；总苷水溶液以1. 5BV/h的流速 过层析柱，至流出液中雪草总苷穿透，共加入总苷水溶液4. 7L ；先用4个床层体积的水洗涤 树脂柱，接着用乙醇_水混合流动相以1. 5BV/h的流速洗脱积雪草总皂苷，乙醇-水混合流 动相中乙醇的体积百分比为30%。上述大孔吸附树脂纯化过程重复3次，洗脱液经HPLC分 析后合并得到富含总苷的收集液，收集液经浓缩后真空干燥，重量为19. lg，作为起始原料 回用。实施例4取60g积雪草总苷原料加入烧杯中，加入600mL甲醇(IOmL溶剂I/g积雪草总 苷)，加热至65°C溶解后冷却结晶得到固形物I与结晶母液I ；固形物I经真空干燥后重量 为8. 4g，加入21mL甲醇(2. 5mL溶剂I/g积雪草总苷)，加热至65°C溶解后冷却结晶得到 固形物II与结晶母液II ；固形物II经真空干燥后重量为6. 3g，加入31. 7mL甲醇(5mL溶 剂I/g积雪草总苷)加热至65°C溶解后冷却结晶得到固形物III与结晶母液III ；固形物 III经真空干燥后羟基积雪草苷产品，重量为4g，收率18. 7%，纯度93. 9%。结晶母液I经浓缩后真空干燥，重量为54g，用36L水溶解制成总苷水溶液。在内径 为4cm的层析柱中装入经预处理的大孔吸附树脂HPD400，树脂柱高为20cm(高径比为5)， 树脂柱的床层体积为251. 3mL ；总苷水溶液以0. 5BV/h的流速过层析柱，至流出液中雪草总 苷穿透，共加入总苷水溶液11. 2L ；先用4个床层体积的水洗涤树脂柱，接着用乙醇-水混 合流动相以2BV/h的流速洗脱积雪草总皂苷，乙醇-水混合流动相中乙醇的体积百分比为 30 %。上述大孔吸附树脂纯化过程重复2次，洗脱液经HPLC分析后合并，浓缩后真空干燥， 重量为30. 2g，加入302. 5mL 二甲基甲酰胺(IOmL溶剂I/g积雪草总苷)，溶解后加入605mL 水(溶剂I加入量的2倍)进行结晶，然后经过滤得到固形物IV与结晶母液IV ；固形物IV 经真空干燥后即为高纯度积雪草苷产品，重量为4. 5g，收率45. 5%，纯度89. 8%。合并结晶母液II、III、IV经浓缩后真空干燥，重量为27. 8g后用水溶解制成总苷 水溶液，用18. 5L水溶解，在内径为4cm的层析柱中装入经预处理的大孔吸附树脂HPD400， 树脂柱高为12cm(高径比为3)，树脂柱的床层体积为150. SmL ；总苷水溶液以0. 5BV/h的流 速过层析柱，至流出液中雪草总苷穿透，共加入总苷水溶液6. 7L ；先用4个床层体积的水洗 涤树脂柱，接着用乙醇_水混合流动相以2BV/h的流速洗脱积雪草总皂苷，乙醇-水混合流 动相中乙醇的体积百分比为30%。上述大孔吸附树脂纯化过程重复2次，洗脱液经HPLC分 析后合并得到富含总苷的收集液，收集液经浓缩后真空干燥，重量为19. 3g，作为起始原料 回用。实施例5取60g积雪草总苷原料加入烧杯中，加入150mL甲醇(2. 5mL溶剂I/g积雪草总 苷)，加热至50°C溶解后冷却结晶得到固形物I与结晶母液I ；固形物I经真空干燥后重量为37. 2g，加入93mL甲醇(2. 5mL溶剂I/g积雪草总苷)，加热至50°C溶解后冷却结晶得到 固形物II与结晶母液II ；固形物II经真空干燥后重量为28. lg，加入280. 9mL甲醇(IOmL 溶剂I/g积雪草总苷)加热至50°C溶解后冷却结晶得到固形物III与结晶母液III ；固形 物III经真空干燥后羟基积雪草苷产品，重量为9. 2g，收率43. 1%，纯度93. 1%。结晶母液I经浓缩后真空干燥，重量为49. 8g，用33. 2L水溶解制成总苷水溶液。 在内径为4cm的层析柱中装入经预处理的大孔吸附树脂HPD500，树脂柱高为16cm(高径比 为4)，树脂柱的床层体积为201. ImL ；总苷水溶液以lBV/h的流速过层析柱，至流出液中雪 草总苷穿透，共加入总苷水溶液8. 9L ；先用4个床层体积的水洗涤树脂柱，接着用乙醇_水 混合流动相以0. 5BV/h的流速洗脱积雪草总皂苷，乙醇-水混合流动相中乙醇的体积百分 比为30 %。上述大孔吸附树脂纯化过程重复3次，洗脱液经HPLC分析后合并，浓缩后真空 干燥，重量为26g，加入65. ImL甲醇(2. 5mL溶剂I/g积雪草总苷)，溶解后加入651. ImL水 (溶剂I加入量的10倍)进行结晶，然后经过滤得到固形物IV与结晶母液IV ；固形物IV 经真空干燥后即为高纯度积雪草苷产品，重量为7. 5g，收率76. 7 %，纯度91. 4 %。合并结晶母液II、III、IV经浓缩后真空干燥，重量为19. 6g后用水溶解制成总苷 水溶液，用13. IL水溶解，在内径为3cm的层析柱中装入经预处理的大孔吸附树脂HPD500， 树脂柱高为12cm(高径比为4)，树脂柱的床层体积为84. SmL ；总苷水溶液以lBV/h的流速 过层析柱，至流出液中雪草总苷穿透，共加入总苷水溶液3. 8L ；先用4个床层体积的水洗涤 树脂柱，接着用乙醇_水混合流动相以0. 5BV/h的流速洗脱积雪草总皂苷，乙醇-水混合流 动相中乙醇的体积百分比为30%。上述大孔吸附树脂纯化过程重复2次，洗脱液经HPLC分 析后合并得到富含总苷的收集液，收集液经浓缩后真空干燥，重量为13. 6g，作为起始原料 回用。实施例6取60g积雪草总苷原料加入烧杯中，加入300mL甲醇(5mL溶剂I/g积雪草总苷)， 加热至55°C溶解后冷却结晶得到固形物I与结晶母液I ；固形物I经真空干燥后重量为 27. 6g，加入138mL甲醇(5mL溶剂I/g积雪草总苷)，加热至55°C溶解后冷却结晶得到固形 物II与结晶母液II ；固形物II经真空干燥后重量为16. 3g，加入81. 4mL甲醇(5mL溶剂 I/g积雪草总苷)加热至55°C溶解后冷却结晶得到固形物III与结晶母液III ；固形物III 经真空干燥后羟基积雪草苷产品，重量为10. lg，收率47. 6 %，纯度93 %。结晶母液I经浓缩后真空干燥，重量为46. 9g，用31. 2L水溶解制成总苷水溶液。 在内径为3cm的层析柱中装入经预处理的大孔吸附树脂HPD600，树脂柱高为15cm(高径比 为5)，树脂柱的床层体积为106mL ；总苷水溶液以1. 5BV/h的流速过层析柱，至流出液中雪 草总苷穿透，共加入总苷水溶液4. 7L ；先用4个床层体积的水洗涤树脂柱，接着用乙醇-水 混合流动相以lBV/h的流速洗脱积雪草总皂苷，乙醇-水混合流动相中乙醇的体积百分比 为30 %。上述大孔吸附树脂纯化过程重复6次，洗脱液经HPLC分析后合并，浓缩后真空 干燥，重量为23. lg，加入115. 3mL 二甲基甲酰胺(5mL溶剂I/g积雪草总苷)，溶解后加入 922. 2mL水(溶剂I加入量的8倍)进行结晶，然后经过滤得到固形物IV与结晶母液IV ； 固形物IV经真空干燥后即为高纯度积雪草苷产品，重量为5. 9g，收率60. 9 %，纯度90. 8 %。合并结晶母液II、III、IV经浓缩后真空干燥，重量为20. Ig后用水溶解制成总苷 水溶液，用13. 4L水溶解，在内径为3cm的层析柱中装入经预处理的大孔吸附树脂HPD600，树脂柱高为15cm(高径比为5)，树脂柱的床层体积为106mL ；总苷水溶液以1. 5BV/h的流速 过层析柱，至流出液中雪草总苷穿透，共加入总苷水溶液4. 7L ；先用4个床层体积的水洗涤 树脂柱，接着用乙醇_水混合流动相以lBV/h的流速洗脱积雪草总皂苷，乙醇-水混合流动 相中乙醇的体积百分比为30%。上述大孔吸附树脂纯化过程重复2次，洗脱液经HPLC分析 后合并得到富含总苷的收集液，收集液经浓缩后真空干燥，重量为14g，作为起始原料回用。实施例7取60g积雪草总苷原料加入烧杯中，加入450mL甲醇(7. 5mL溶剂I/g积雪草总 苷)，加热至60°C溶解后冷却结晶得到固形物I与结晶母液I ；固形物I经真空干燥后重量 为18g，加入90mL甲醇(5mL溶剂I/g积雪草总苷)，加热至60°C溶解后冷却结晶得到固形 物II与结晶母液II ；固形物II经真空干燥后重量为10. 6g，加入26. 6mL甲醇(2. 5mL溶剂 I/g积雪草总苷)加热至60°C溶解后冷却结晶得到固形物III与结晶母液III ；固形物III 经真空干燥后羟基积雪草苷产品，重量为8. 2g，收率38. 6%，纯度93. 3%。结晶母液I经浓缩后真空干燥，重量为49. Sg,用33. 2L水溶解制成总苷水溶液。在 内径为4cm的层析柱中装入经预处理的大孔吸附树脂HPD700，树脂柱高为12cm(高径比为 3)，树脂柱的床层体积为150. SmL ；总苷水溶液以0. 5BV/h的流速过层析柱，至流出液中雪 草总苷穿透，共加入总苷水溶液6. 7L ；先用4个床层体积的水洗涤树脂柱，接着用乙醇-水 混合流动相以1. 5BV/h的流速洗脱积雪草总皂苷，乙醇-水混合流动相中乙醇的体积百分 比为30%。上述大孔吸附树脂纯化过程重复4次，洗脱液经HPLC分析后合并，浓缩后真空 干燥，重量为26g，加入195. ImL甲醇(7. 5mL溶剂I/g积雪草总苷)，溶解后加入390. ImL 水(溶剂I加入量的2倍)进行结晶，然后经过滤得到固形物IV与结晶母液IV ；固形物IV 经真空干燥后即为高纯度积雪草苷产品，重量为4. 9g，收率50. 2 %，纯度90. 3 %。合并结晶母液II、III、IV经浓缩后真空干燥，重量为23. Ig后用水溶解制成总苷 水溶液，用15. 4L水溶解，在内径为3cm的层析柱中装入经预处理的大孔吸附树脂HPD700， 树脂柱高为9cm(高径比为3)，树脂柱的床层体积为63. 6mL ；总苷水溶液以0. 5BV/h的流速 过层析柱，至流出液中雪草总苷穿透，共加入总苷水溶液2. 8L ；先用4个床层体积的水洗涤 树脂柱，接着用乙醇_水混合流动相以1. 5BV/h的流速洗脱积雪草总皂苷，乙醇-水混合流 动相中乙醇的体积百分比为30%。上述大孔吸附树脂纯化过程重复4次，洗脱液经HPLC分 析后合并得到富含总苷的收集液，收集液经浓缩后真空干燥，重量为16g，作为起始原料回 用。实施例8取60g积雪草总苷原料加入烧杯中，加入600mL甲醇(IOmL溶剂I/g积雪草总 苷)，加热至65°C溶解后冷却结晶得到固形物I与结晶母液I ；固形物I经真空干燥后重量 为8. 4g，加入21mL甲醇(2. 5mL溶剂I/g积雪草总苷)，加热至65°C溶解后冷却结晶得到 固形物II与结晶母液II ；固形物II经真空干燥后重量为6. 3g，加入31. 7mL甲醇(5mL溶 剂I/g积雪草总苷)加热至65°C溶解后冷却结晶得到固形物III与结晶母液III ；固形物 III经真空干燥后羟基积雪草苷产品，重量为4g，收率18. 7%，纯度93. 9%。结晶母液I经浓缩后真空干燥，重量为54g，用36L水溶解制成总苷水溶液。在内 径为4cm的层析柱中装入经预处理的大孔吸附树脂X-5，树脂柱高为16cm(高径比为4)，树 脂柱的床层体积为201. ImL ；总苷水溶液以lBV/h的流速过层析柱，至流出液中雪草总苷穿透，共加入总苷水溶液8. 9L ；先用4个床层体积的水洗涤树脂柱，接着用乙醇_水混合流动 相以2BV/h的流速洗脱积雪草总皂苷，乙醇-水混合流动相中乙醇的体积百分比为30%。 上述大孔吸附树脂纯化过程重复3次，洗脱液经HPLC分析后合并，浓缩后真空干燥，重量 为30. 2g，加入75. 6mL 二甲基甲酰胺(2. 5mL溶剂I/g积雪草总苷)，溶解后加入37. SmL水 (溶剂I加入量的0. 5倍)进行结晶，然后经过滤得到固形物IV与结晶母液IV ；固形物IV 经真空干燥后即为高纯度积雪草苷产品，重量为6. 6g，收率68. 1 %，纯度91. 4 %。合并结晶母液II、III、IV经浓缩后真空干燥，重量为25. 6g后用水溶解制成总苷 水溶液，用17. IL水溶解，在内径为4cm的层析柱中装入经预处理的大孔吸附树脂X-5，树脂 柱高为16cm(高径比为4)，树脂柱的床层体积为201. ImL ；总苷水溶液以lBV/h的流速过层 析柱，至流出液中雪草总苷穿透，共加入总苷水溶液8. 9L ；先用4个床层体积的水洗涤树脂 柱，接着用乙醇-水混合流动相以2BV/h的流速洗脱积雪草总皂苷，乙醇-水混合流动相中 乙醇的体积百分比为30%。上述大孔吸附树脂纯化过程重复1次，洗脱液经HPLC分析后合 并得到富含总苷的收集液，收集液经浓缩后真空干燥，重量为17. 8g，作为起始原料回用。实施例9取60g积雪草总苷原料加入烧杯中，加入150mL甲醇(2. 5mL溶剂I/g积雪草总 苷)，加热至50°C溶解后冷却结晶得到固形物I与结晶母液I ；固形物I经真空干燥后重量 为37. 2g，加入372mL甲醇(IOmL溶剂I/g积雪草总苷)，加热至50°C溶解后冷却结晶得到 固形物II与结晶母液II ；固形物II经真空干燥后重量为9. 7g，加入24. 2mL甲醇(2. 5mL 溶剂I/g积雪草总苷)加热至50°C溶解后冷却结晶得到固形物III与结晶母液III ；固形 物III经真空干燥后羟基积雪草苷产品，重量为7. 5g，收率35. 2%，纯度93. 4%。结晶母液I经浓缩后真空干燥，重量为50. 5g，用33. 7L水溶解制成总苷水溶液。 在内径为4cm的层析柱中装入经预处理的大孔吸附树脂AB-8，树脂柱高为20cm(高径比 为5)，树脂柱的床层体积为251. 3mL ；总苷水溶液以1. 5BV/h的流速过层析柱，至流出液 中雪草总苷穿透，共加入总苷水溶液11. 2L ；先用4个床层体积的水洗涤树脂柱，接着用乙 醇_水混合流动相以lBV/h的流速洗脱积雪草总皂苷，乙醇-水混合流动相中乙醇的体积 百分比为30 %。上述大孔吸附树脂纯化过程重复2次，洗脱液经HPLC分析后合并，浓缩后真 空干燥，重量为26. 7g，加入133. 7mL甲醇(5mL溶剂I/g积雪草总苷)，溶解后加入133. 7mL 水(溶剂I加入量的1倍)进行结晶，然后经过滤得到固形物IV与结晶母液IV ；固形物IV 经真空干燥后即为高纯度积雪草苷产品，重量为5. 3g，收率54. 7 %，纯度90. 8 %。合并结晶母液II、III、IV经浓缩后真空干燥，重量为23. 4g后用水溶解制成总苷 水溶液，用15. 6L水溶解，在内径为3cm的层析柱中装入经预处理的大孔吸附树脂ABU^i 脂柱高为15cm(高径比为5)，树脂柱的床层体积为106mL ；总苷水溶液以1. 5BV/h的流速过 层析柱，至流出液中雪草总苷穿透，共加入总苷水溶液4. 7L ；先用4个床层体积的水洗涤树 脂柱，接着用乙醇_水混合流动相以lBV/h的流速洗脱积雪草总皂苷，乙醇-水混合流动相 中乙醇的体积百分比为30%。上述大孔吸附树脂纯化过程重复2次，洗脱液经HPLC分析后 合并得到富含总苷的收集液，收集液经浓缩后真空干燥，重量为16. 3g，作为起始原料回用。实施例10取60g积雪草总苷原料加入烧杯中，加入300mL甲醇(5mL溶剂I/g积雪草总苷)， 加热至55°C溶解后冷却结晶得到固形物I与结晶母液I ；固形物I经真空干燥后重量为27. 6g，加入138mL甲醇(5mL溶剂I/g积雪草总苷)，加热至55°C溶解后冷却结晶得到固形 物II与结晶母液II ；固形物II经真空干燥后重量为16. 3g，加入81.4mL甲醇(5mL溶剂 I/g积雪草总苷)加热至55°C溶解后冷却结晶得到固形物III与结晶母液III ；固形物III 经真空干燥后羟基积雪草苷产品，重量为10. lg，收率47. 6 %，纯度93 %。结晶母液I经浓缩后真空干燥，重量为47. 9g，用31. 9L水溶解制成总苷水溶液。 在内径为4cm的层析柱中装入经预处理的大孔吸附树脂D4020，树脂柱高为12cm(高径比为 3)，树脂柱的床层体积为150. SmL ；总苷水溶液以lBV/h的流速过层析柱，至流出液中雪草 总苷穿透，共加入总苷水溶液6. 7L ；先用4个床层体积的水洗涤树脂柱，接着用乙醇_水混 合流动相以1. 5BV/h的流速洗脱积雪草总皂苷，乙醇-水混合流动相中乙醇的体积百分比 为30%。上述大孔吸附树脂纯化过程重复4次，洗脱液经HPLC分析后合并，浓缩后真空干 燥，重量为24. Ig,加入180. 4mL 二甲基甲酰胺(7. 5mL溶剂I/g积雪草总苷)，溶解后加入 1082. 5mL水(溶剂I加入量的6倍)进行结晶，然后经过滤得到固形物IV与结晶母液IV ； 固形物IV经真空干燥后即为高纯度积雪草苷产品，重量为5. 2g，收率53. 6 %，纯度90. 3 %。合并结晶母液II、III、IV经浓缩后真空干燥，重量为20. 8g后用水溶解制成总苷 水溶液，用13. 9L水溶解，在内径为4cm的层析柱中装入经预处理的大孔吸附树脂D4020，树 脂柱高为16cm(高径比为4)，树脂柱的床层体积为201. ImL ；总苷水溶液以lBV/h的流速过 层析柱，至流出液中雪草总苷穿透，共加入总苷水溶液8. 9L ；先用4个床层体积的水洗涤树 脂柱，接着用乙醇_水混合流动相以1. 5BV/h的流速洗脱积雪草总皂苷，乙醇-水混合流动 相中乙醇的体积百分比为30%。上述大孔吸附树脂纯化过程重复1次，洗脱液经HPLC分析 后合并得到富含总苷的收集液，收集液经浓缩后真空干燥，重量为14. 4g，作为起始原料回 用。实施例11取60g积雪草总苷原料加入烧杯中，加入600mL甲醇(IOmL溶剂I/g积雪草总 苷)，加热至50°C溶解后冷却结晶得到固形物I与结晶母液I ；固形物I经真空干燥后重量 为8. 4g，加入21mL甲醇(2. 5mL溶剂I/g积雪草总苷)，加热至50°C溶解后冷却结晶得到 固形物II与结晶母液II ；固形物II经真空干燥后重量为6. 3g，加入31. 7mL甲醇(5mL溶 剂I/g积雪草总苷)加热至50°C溶解后冷却结晶得到固形物III与结晶母液III ；固形物 III经真空干燥后羟基积雪草苷产品，重量为4g，收率18. 7%，纯度93. 9%。结晶母液I经浓缩后真空干燥，重量为55g，用36. 7L水溶解制成总苷水溶液。在 内径为4cm的层析柱中装入经预处理的大孔吸附树脂HPD100，树脂柱高为12cm(高径比为 3)，树脂柱的床层体积为150. SmL ；总苷水溶液以0. 5BV/h的流速过层析柱，至流出液中雪 草总苷穿透，共加入总苷水溶液6. 7L ；先用4个床层体积的水洗涤树脂柱，接着用乙醇-水 混合流动相以0. 5BV/h的流速洗脱积雪草总皂苷，乙醇-水混合流动相中乙醇的体积百分 比为30%。上述大孔吸附树脂纯化过程重复4次，洗脱液经HPLC分析后合并，浓缩后真空 干燥，重量为31. 2g，加入156. 2mL甲醇(5mL溶剂I/g积雪草总苷)，溶解后加入156. 2mL 水(溶剂I加入量的1倍)进行结晶，然后经过滤得到固形物IV与结晶母液IV ；固形物IV 经真空干燥后即为高纯度积雪草苷产品，重量为5. 3g，收率54. 7%，纯度90. 8%。合并结晶母液II、III、IV经浓缩后真空干燥，重量为26. 9g后用水溶解制成总苷 水溶液，用17. 9L水溶解，在内径为3cm的层析柱中装入经预处理的大孔吸附树脂HPD100，树脂柱高为9cm(高径比为3)，树脂柱的床层体积为63. 6mL ；总苷水溶液以0. 5BV/h的流速 过层析柱，至流出液中雪草总苷穿透，共加入总苷水溶液2. 8L ；先用4个床层体积的水洗涤 树脂柱，接着用乙醇_水混合流动相以0. 5BV/h的流速洗脱积雪草总皂苷，乙醇-水混合流 动相中乙醇的体积百分比为30%。上述大孔吸附树脂纯化过程重复5次，洗脱液经HPLC分 析后合并得到富含总苷的收集液，收集液经浓缩后真空干燥，重量为18. 7g，作为起始原料 回用。实施例12取60g积雪草总苷原料加入烧杯中，加入450mL甲醇(7. 5mL溶剂I/g积雪草总 苷)，加热至55°C溶解后冷却结晶得到固形物I与结晶母液I ；固形物I经真空干燥后重量 为18g，加入90mL甲醇(5mL溶剂I/g积雪草总苷)，加热至55°C溶解后冷却结晶得到固形 物II与结晶母液II ；固形物II经真空干燥后重量为10. 6g，加入26. 6mL甲醇(2. 5mL溶剂 I/g积雪草总苷)加热至55°C溶解后冷却结晶得到固形物III与结晶母液III ；固形物III 经真空干燥后羟基积雪草苷产品，重量为8. 2g，收率38. 6%，纯度93. 3%。结晶母液I经浓缩后真空干燥，重量为48. 8g，用32. 5L水溶解制成总苷水溶液。 在内径为3cm的层析柱中装入经预处理的大孔吸附树脂HPD200，树脂柱高为12cm(高径比 为4)，树脂柱的床层体积为84. SmL ；总苷水溶液以lBV/h的流速过层析柱，至流出液中雪草 总苷穿透，共加入总苷水溶液3. 8L ；先用4个床层体积的水洗涤树脂柱，接着用乙醇_水混 合流动相以lBV/h的流速洗脱积雪草总皂苷，乙醇-水混合流动相中乙醇的体积百分比为 30 %。上述大孔吸附树脂纯化过程重复8次，洗脱液经HPLC分析后合并，浓缩后真空干燥， 重量为25g，加入250. ImL 二甲基甲酰胺(IOmL溶剂I/g积雪草总苷)，溶解后加入125mL 水(溶剂I加入量的0.5倍)进行结晶，然后经过滤得到固形物IV与结晶母液IV;固形物 IV经真空干燥后即为高纯度积雪草苷产品，重量为4. 1 g，收率42. 3 %，纯度89. 8 %。合并结晶母液II、III、IV经浓缩后真空干燥，重量为23. 9g后用水溶解制成总苷 水溶液，用15. 9L水溶解，在内径为4cm的层析柱中装入经预处理的大孔吸附树脂HPD200， 树脂柱高为16cm(高径比为4)，树脂柱的床层体积为201. ImL ；总苷水溶液以lBV/h的流速 过层析柱，至流出液中雪草总苷穿透，共加入总苷水溶液8. 9L ；先用4个床层体积的水洗涤 树脂柱，接着用乙醇_水混合流动相以lBV/h的流速洗脱积雪草总皂苷，乙醇-水混合流动 相中乙醇的体积百分比为30%。上述大孔吸附树脂纯化过程重复1次，洗脱液经HPLC分析 后合并得到富含总苷的收集液，收集液经浓缩后真空干燥，重量为16. 6g，作为起始原料回 用。实施例13取60g积雪草总苷原料加入烧杯中，加入300mL甲醇(5mL溶剂I/g积雪草总苷)， 加热至60°C溶解后冷却结晶得到固形物I与结晶母液I ；固形物I经真空干燥后重量为 27. 6g，加入207mL甲醇(7. 5mL溶剂I/g积雪草总苷)，加热至60°C溶解后冷却结晶得到固 形物II与结晶母液II ；固形物II经真空干燥后重量为11. 7g，加入88mL甲醇(7. 5mL溶剂 I/g积雪草总苷)加热至60°C溶解后冷却结晶得到固形物III与结晶母液III ；固形物III 经真空干燥后羟基积雪草苷产品，重量为5. 6g，收率26. 3%，纯度93. 7%。结晶母液I经浓缩后真空干燥，重量为51. 4g，用34. 3L水溶解制成总苷水溶液。 在内径为4cm的层析柱中装入经预处理的大孔吸附树脂HPD300，树脂柱高为20cm(高径比为5)，树脂柱的床层体积为251. 3mL ；总苷水溶液以1. 5BV/h的流速过层析柱，至流出液 中雪草总苷穿透，共加入总苷水溶液11. 2L ；先用4个床层体积的水洗涤树脂柱，接着用乙 醇-水混合流动相以1. 5BV/h的流速洗脱积雪草总皂苷，乙醇-水混合流动相中乙醇的体 积百分比为30%。上述大孔吸附树脂纯化过程重复2次，洗脱液经HPLC分析后合并，浓缩 后真空干燥，重量为27. 6g，加入207. 3mL甲醇(7. 5mL溶剂I/g积雪草总苷)，溶解后加入 829mL水(溶剂I加入量的4倍)进行结晶，然后经过滤得到固形物IV与结晶母液IV;固 形物IV经真空干燥后即为高纯度积雪草苷产品，重量为5. lg，收率52. 3%，纯度90. 3%。合并结晶母液II、III、IV经浓缩后真空干燥，重量为25. 5g后用水溶解制成总苷 水溶液，用17L水溶解，在内径为3cm的层析柱中装入经预处理的大孔吸附树脂HPD300，树 脂柱高为15cm(高径比为5)，树脂柱的床层体积为106mL ；总苷水溶液以1. 5BV/h的流速过 层析柱，至流出液中雪草总苷穿透，共加入总苷水溶液4. 7L ；先用4个床层体积的水洗涤树 脂柱，接着用乙醇_水混合流动相以1. 5BV/h的流速洗脱积雪草总皂苷，乙醇-水混合流动 相中乙醇的体积百分比为30%。上述大孔吸附树脂纯化过程重复3次，洗脱液经HPLC分析 后合并得到富含总苷的收集液，收集液经浓缩后真空干燥，重量为17. 7g，作为起始原料回 用。实施例14取60g积雪草总苷原料加入烧杯中，加入150mL甲醇(2. 5mL溶剂I/g积雪草总 苷)，加热至65°C溶解后冷却结晶得到固形物I与结晶母液I ；固形物I经真空干燥后重量 为37. 2g，加入93mL甲醇(2. 5mL溶剂I/g积雪草总苷)，加热至65°C溶解后冷却结晶得至Ij 固形物II与结晶母液II ；固形物II经真空干燥后重量为28. lg，加入140. 4mL甲醇(5mL 溶剂I/g积雪草总苷)加热至65°C溶解后冷却结晶得到固形物III与结晶母液III ；固形 物III经真空干燥后羟基积雪草苷产品，重量为17. 5g，收率80. 6%，纯度91. 2%。结晶母液I经浓缩后真空干燥，重量为40. 5g，用27L水溶解制成总苷水溶液。在 内径为4cm的层析柱中装入经预处理的大孔吸附树脂HPD400，树脂柱高为20cm(高径比 为5)，树脂柱的床层体积为251. 3mL ；总苷水溶液以0. 5BV/h的流速过层析柱，至流出液 中雪草总苷穿透，共加入总苷水溶液11. 2L ；先用4个床层体积的水洗涤树脂柱，接着用乙 醇_水混合流动相以2BV/h的流速洗脱积雪草总皂苷，乙醇-水混合流动相中乙醇的体积 百分比为30%。上述大孔吸附树脂纯化过程重复1次，洗脱液经HPLC分析后合并，浓缩后 真空干燥，重量为16. 7g，加入167mL 二甲基甲酰胺(IOmL溶剂I/g积雪草总苷)，溶解后加 入334mL水(溶剂I加入量的2倍)进行结晶，然后经过滤得到固形物IV与结晶母液IV ； 固形物IV经真空干燥后即为高纯度积雪草苷产品，重量为4. 5g，收率45. 5 %，纯度89. 8 %。合并结晶母液II、III、IV经浓缩后真空干燥，重量为14. 2g后用水溶解制成总苷 水溶液，用9. 5L水溶解，在内径为3cm的层析柱中装入经预处理的大孔吸附树脂HPD400，树 脂柱高为9cm(高径比为3)，树脂柱的床层体积为63. 6mL ；总苷水溶液以0. 5BV/h的流速过 层析柱，至流出液中雪草总苷穿透，共加入总苷水溶液2. 8L ；先用4个床层体积的水洗涤树 脂柱，接着用乙醇_水混合流动相以2BV/h的流速洗脱积雪草总皂苷，乙醇-水混合流动相 中乙醇的体积百分比为30%。上述大孔吸附树脂纯化过程重复2次，洗脱液经HPLC分析后 合并得到富含总苷的收集液，收集液经浓缩后真空干燥，重量为9. 9g，作为起始原料回用。实施例15
取60g积雪草总苷原料加入烧杯中，加入600mL甲醇(IOmL溶剂I/g积雪草总 苷)，加热至50°C溶解后冷却结晶得到固形物I与结晶母液I ；固形物I经真空干燥后重量 为8. 4g，加入21mL甲醇(2. 5mL溶剂I/g积雪草总苷)，加热至50°C溶解后冷却结晶得到 固形物II与结晶母液II ；固形物II经真空干燥后重量为6. 3g，加入63. 4mL甲醇(IOmL溶 剂I/g积雪草总苷)加热至50°C溶解后冷却结晶得到固形物III与结晶母液III ；固形物 III经真空干燥后羟基积雪草苷产品，重量为2. lg，收率9. 8%，纯度94. 1%。结晶母液I经浓缩后真空干燥，重量为56. 9g，用38L水溶解制成总苷水溶液。在 内径为4cm的层析柱中装入经预处理的大孔吸附树脂HPD500，树脂柱高为16cm(高径比为 4)，树脂柱的床层体积为201. ImL ；总苷水溶液以lBV/h的流速过层析柱，至流出液中雪草 总苷穿透，共加入总苷水溶液8. 9L ；先用4个床层体积的水洗涤树脂柱，接着用乙醇_水混 合流动相以0. 5BV/h的流速洗脱积雪草总皂苷，乙醇-水混合流动相中乙醇的体积百分比 为30 %。上述大孔吸附树脂纯化过程重复3次，洗脱液经HPLC分析后合并，浓缩后真空干 燥，重量为33. Ig,加入82. 8mL甲醇(2. 5mL溶剂I/g积雪草总苷)，溶解后加入828. 3mL水 (溶剂I加入量的10倍)进行结晶，然后经过滤得到固形物IV与结晶母液IV ；固形物IV 经真空干燥后即为高纯度积雪草苷产品，重量为7. 5g，收率76. 7%，纯度91. 4%。合并结晶母液II、III、IV经浓缩后真空干燥，重量为26. 7g后用水溶解制成总苷 水溶液，用17. 8L水溶解，在内径为3cm的层析柱中装入经预处理的大孔吸附树脂HPD500， 树脂柱高为12cm(高径比为4)，树脂柱的床层体积为84. SmL ；总苷水溶液以lBV/h的流速 过层析柱，至流出液中雪草总苷穿透，共加入总苷水溶液3. 8L ；先用4个床层体积的水洗涤 树脂柱，接着用乙醇_水混合流动相以0. 5BV/h的流速洗脱积雪草总皂苷，乙醇-水混合流 动相中乙醇的体积百分比为30%。上述大孔吸附树脂纯化过程重复4次，洗脱液经HPLC分 析后合并得到富含总苷的收集液，收集液经浓缩后真空干燥，重量为18. 5g，作为起始原料 回用。实施例16取60g积雪草总苷原料加入烧杯中，加入450mL甲醇(7. 5mL溶剂I/g积雪草总 苷)，加热至55°C溶解后冷却结晶得到固形物I与结晶母液I ；固形物I经真空干燥后重量 为18g，加入90mL甲醇(5mL溶剂I/g积雪草总苷)，加热至55°C溶解后冷却结晶得到固形 物II与结晶母液II ；固形物II经真空干燥后重量为10. 6g，加入53. ImL甲醇(5mL溶剂 I/g积雪草总苷)加热至55°C溶解后冷却结晶得到固形物III与结晶母液III ；固形物III 经真空干燥后羟基积雪草苷产品，重量为6. 6g，收率31. 2%，纯度93. 5%。结晶母液I经浓缩后真空干燥，重量为52. 4g，用34. 9L水溶解制成总苷水溶液。 在内径为3cm的层析柱中装入经预处理的大孔吸附树脂HPD600，树脂柱高为15cm(高径比 为5)，树脂柱的床层体积为106mL ；总苷水溶液以1. 5BV/h的流速过层析柱，至流出液中雪 草总苷穿透，共加入总苷水溶液4. 7L ；先用4个床层体积的水洗涤树脂柱，接着用乙醇-水 混合流动相以lBV/h的流速洗脱积雪草总皂苷，乙醇-水混合流动相中乙醇的体积百分比 为30%。上述大孔吸附树脂纯化过程重复6次，洗脱液经HPLC分析后合并，浓缩后真空干 燥，重量为28. 6g，加入71. 5mL 二甲基甲酰胺(2. 5mL溶剂I/g积雪草总苷)，溶解后加入 571. 7mL水(溶剂I加入量的8倍)进行结晶，然后经过滤得到固形物IV与结晶母液IV ； 固形物IV经真空干燥后即为高纯度积雪草苷产品，重量为7. 4g，收率75. 8 %，纯度91. 4 %。
合并结晶母液II、III、IV经浓缩后真空干燥，重量为22. 2g后用水溶解制成总苷 水溶液，用14. 8L水溶解，在内径为3cm的层析柱中装入经预处理的大孔吸附树脂HPD600， 树脂柱高为15cm(高径比为5)，树脂柱的床层体积为106mL ；总苷水溶液以1. 5BV/h的流速 过层析柱，至流出液中雪草总苷穿透，共加入总苷水溶液4. 7L ；先用4个床层体积的水洗涤 树脂柱，接着用乙醇_水混合流动相以lBV/h的流速洗脱积雪草总皂苷，乙醇-水混合流动 相中乙醇的体积百分比为30%。上述大孔吸附树脂纯化过程重复2次，洗脱液经HPLC分析 后合并得到富含总苷的收集液，收集液经浓缩后真空干燥，重量为15. 4g，作为起始原料回 用。实施例17取60g积雪草总苷原料加入烧杯中，加入300mL甲醇(5mL溶剂I/g积雪草总苷)， 加热至60°C溶解后冷却结晶得到固形物I与结晶母液I ；固形物I经真空干燥后重量为 27. 6g，加入138mL甲醇(5mL溶剂I/g积雪草总苷)，加热至60°C溶解后冷却结晶得到固形 物II与结晶母液II ；固形物II经真空干燥后重量为16. 3g，加入40. 7mL甲醇(2. 5mL溶剂 I/g积雪草总苷)加热至60°C溶解后冷却结晶得到固形物III与结晶母液III ；固形物III 经真空干燥后羟基积雪草苷产品，重量为12. 6g，收率58. 7%，纯度92. 5%。结晶母液I经浓缩后真空干燥，重量为44. 4g，用29. 6L水溶解制成总苷水溶液。在 内径为4cm的层析柱中装入经预处理的大孔吸附树脂HPD700，树脂柱高为12cm(高径比为 3)，树脂柱的床层体积为150. SmL ；总苷水溶液以0. 5BV/h的流速过层析柱，至流出液中雪 草总苷穿透，共加入总苷水溶液6. 7L ；先用4个床层体积的水洗涤树脂柱，接着用乙醇-水 混合流动相以1. 5BV/h的流速洗脱积雪草总皂苷，乙醇-水混合流动相中乙醇的体积百分 比为30 %。上述大孔吸附树脂纯化过程重复3次，洗脱液经HPLC分析后合并，浓缩后真空 干燥，重量为20. 6g，加入154. 8mL甲醇(7. 5mL溶剂I/g积雪草总苷)，溶解后加入309. 6mL 水(溶剂I加入量的2倍)进行结晶，然后经过滤得到固形物IV与结晶母液IV ；固形物IV 经真空干燥后即为高纯度积雪草苷产品，重量为4. 9g，收率50. 2 %，纯度90. 3 %。合并结晶母液II、III、IV经浓缩后真空干燥，重量为18. 7g后用水溶解制成总苷 水溶液，用12. 5L水溶解，在内径为3cm的层析柱中装入经预处理的大孔吸附树脂HPD700， 树脂柱高为9cm(高径比为3)，树脂柱的床层体积为63. 6mL ；总苷水溶液以0. 5BV/h的流速 过层析柱，至流出液中雪草总苷穿透，共加入总苷水溶液2. 8L ；先用4个床层体积的水洗涤 树脂柱，接着用乙醇_水混合流动相以1. 5BV/h的流速洗脱积雪草总皂苷，乙醇-水混合流 动相中乙醇的体积百分比为30%。上述大孔吸附树脂纯化过程重复3次，洗脱液经HPLC分 析后合并得到富含总苷的收集液，收集液经浓缩后真空干燥，重量为13g，作为起始原料回 用。实施例18取60g积雪草总苷原料加入烧杯中，加入150mL甲醇(2. 5mL溶剂I/g积雪草总 苷)，加热至65°C溶解后冷却结晶得到固形物I与结晶母液I ；固形物I经真空干燥后重量 为37. 2g，加入93mL甲醇(2. 5mL溶剂I/g积雪草总苷)，加热至65°C溶解后冷却结晶得至Ij 固形物II与结晶母液II ；固形物II经真空干燥后重量为28. lg，加入140. 4mL甲醇(5mL 溶剂I/g积雪草总苷)加热至65°C溶解后冷却结晶得到固形物III与结晶母液III ；固形 物III经真空干燥后羟基积雪草苷产品，重量为17. 5g，收率80. 6%，纯度91. 2%。
结晶母液I经浓缩后真空干燥，重量为40. 5g，用27L水溶解制成总苷水溶液。在 内径为4cm的层析柱中装入经预处理的大孔吸附树脂X-5，树脂柱高为16cm(高径比为4)， 树脂柱的床层体积为201. ImL ；总苷水溶液以lBV/h的流速过层析柱，至流出液中雪草总苷 穿透，共加入总苷水溶液8. 9L ；先用4个床层体积的水洗涤树脂柱，接着用乙醇_水混合流 动相以2BV/h的流速洗脱积雪草总皂苷，乙醇-水混合流动相中乙醇的体积百分比为30 %。 上述大孔吸附树脂纯化过程重复2次，洗脱液经HPLC分析后合并，浓缩后真空干燥，重量为 16. 7g，加入125. 3mL 二甲基甲酰胺(7. 5mL溶剂I/g积雪草总苷)，溶解后加入62. 6mL水 (溶剂I加入量的0. 5倍)进行结晶，然后经过滤得到固形物IV与结晶母液IV ；固形物IV 经真空干燥后即为高纯度积雪草苷产品，重量为4. 6g，收率47. 1 %，纯度90. 3 %。合并结晶母液II、III、IV经浓缩后真空干燥，重量为14. Ig后用水溶解制成总苷 水溶液，用9. 4L水溶解，在内径为3cm的层析柱中装入经预处理的大孔吸附树脂X_5，树脂 柱高为12cm(高径比为4)，树脂柱的床层体积为84. SmL ；总苷水溶液以lBV/h的流速过层 析柱，至流出液中雪草总苷穿透，共加入总苷水溶液3. 8L ；先用4个床层体积的水洗涤树脂 柱，接着用乙醇_水混合流动相以2BV/h的流速洗脱积雪草总皂苷，乙醇-水混合流动相中 乙醇的体积百分比为30%。上述大孔吸附树脂纯化过程重复1次，洗脱液经HPLC分析后合 并得到富含总苷的收集液，收集液经浓缩后真空干燥，重量为9. 8g，作为起始原料回用。实施例19取60g积雪草总苷原料加入烧杯中，加入300mL甲醇(5mL溶剂I/g积雪草总苷)， 加热至50°C溶解后冷却结晶得到固形物I与结晶母液I ；固形物I经真空干燥后重量为 27. 6g，加入276mL甲醇(IOmL溶剂I/g积雪草总苷)，加热至50°C溶解后冷却结晶得到固 形物II与结晶母液II ；固形物II经真空干燥后重量为7. 2g，加入17. 9mL甲醇(2. 5mL溶 剂I/g积雪草总苷)加热至50°C溶解后冷却结晶得到固形物III与结晶母液III ；固形物 III经真空干燥后羟基积雪草苷产品，重量为5. 5g，收率26. 2%，纯度93. 7%。结晶母液I经浓缩后真空干燥，重量为51. 5g，用34. 3L水溶解制成总苷水溶液。 在内径为4cm的层析柱中装入经预处理的大孔吸附树脂AB-8，树脂柱高为20cm(高径比 为5)，树脂柱的床层体积为251. 3mL ；总苷水溶液以1. 5BV/h的流速过层析柱，至流出液 中雪草总苷穿透，共加入总苷水溶液11. 2L ；先用4个床层体积的水洗涤树脂柱，接着用乙 醇_水混合流动相以lBV/h的流速洗脱积雪草总皂苷，乙醇-水混合流动相中乙醇的体积 百分比为30 %。上述大孔吸附树脂纯化过程重复2次，洗脱液经HPLC分析后合并，浓缩后真 空干燥，重量为27. 7g，加入138. 3mL甲醇(5mL溶剂I/g积雪草总苷)，溶解后加入138. 3mL 水(溶剂I加入量的1倍)进行结晶，然后经过滤得到固形物IV与结晶母液IV ；固形物IV 经真空干燥后即为高纯度积雪草苷产品，重量为5. 3g，收率54. 7 %，纯度90. 8 %。合并结晶母液II、III、IV经浓缩后真空干燥，重量为25. 3g后用水溶解制成总苷 水溶液，用16. 9L水溶解，在内径为3cm的层析柱中装入经预处理的大孔吸附树脂ABU^i 脂柱高为15cm(高径比为5)，树脂柱的床层体积为106mL ；总苷水溶液以1. 5BV/h的流速过 层析柱，至流出液中雪草总苷穿透，共加入总苷水溶液4. 7L ；先用4个床层体积的水洗涤树 脂柱，接着用乙醇_水混合流动相以lBV/h的流速洗脱积雪草总皂苷，乙醇-水混合流动相 中乙醇的体积百分比为30%。上述大孔吸附树脂纯化过程重复3次，洗脱液经HPLC分析后 合并得到富含总苷的收集液，收集液经浓缩后真空干燥，重量为17. 6g，作为起始原料回用。
实施例20取60g积雪草总苷原料加入烧杯中，加入150mL甲醇(2. 5mL溶剂I/g积雪草总 苷)，加热至55°C溶解后冷却结晶得到固形物I与结晶母液I ；固形物I经真空干燥后重量 为37. 2g，加入186mL甲醇(5mL溶剂I/g积雪草总苷)，加热至55°C溶解后冷却结晶得到固 形物II与结晶母液II ；固形物II经真空干燥后重量为21. 9g，加入109. 7mL甲醇(5mL溶 剂I/g积雪草总苷)加热至55°C溶解后冷却结晶得到固形物III与结晶母液III ；固形物 III经真空干燥后羟基积雪草苷产品，重量为13. 7g，收率63. 7%，纯度92. 3%。结晶母液I经浓缩后真空干燥，重量为43. 3g，用28. 9L水溶解制成总苷水溶液。 在内径为4cm的层析柱中装入经预处理的大孔吸附树脂D4020，树脂柱高为12cm(高径比为 3)，树脂柱的床层体积为150. SmL ；总苷水溶液以lBV/h的流速过层析柱，至流出液中雪草 总苷穿透，共加入总苷水溶液6. 7L ；先用4个床层体积的水洗涤树脂柱，接着用乙醇_水混 合流动相以1. 5BV/h的流速洗脱积雪草总皂苷，乙醇-水混合流动相中乙醇的体积百分比 为30 %。上述大孔吸附树脂纯化过程重复3次，洗脱液经HPLC分析后合并，浓缩后真空干 燥，重量为19. 5g，加入146. 4mL 二甲基甲酰胺(7. 5mL溶剂I/g积雪草总苷)，溶解后加入 878. 7mL水(溶剂I加入量的6倍)进行结晶，然后经过滤得到固形物IV与结晶母液IV ； 固形物IV经真空干燥后即为高纯度积雪草苷产品，重量为5. 2g，收率53. 6 %，纯度90. 3 %。合并结晶母液II、III、IV经浓缩后真空干燥，重量为17. 3g后用水溶解制成总苷 水溶液，用11. 5L水溶解，在内径为3cm的层析柱中装入经预处理的大孔吸附树脂D4020，树 脂柱高为12cm(高径比为4)，树脂柱的床层体积为84. SmL ；总苷水溶液以lBV/h的流速过 层析柱，至流出液中雪草总苷穿透，共加入总苷水溶液3. 8L ；先用4个床层体积的水洗涤树 脂柱，接着用乙醇_水混合流动相以1. 5BV/h的流速洗脱积雪草总皂苷，乙醇-水混合流动 相中乙醇的体积百分比为30%。上述大孔吸附树脂纯化过程重复2次，洗脱液经HPLC分析 后合并得到富含总苷的收集液，收集液经浓缩后真空干燥，重量为12g，作为起始原料回用。
权利要求
一种低积雪草苷含量总苷出发同时制备积雪草苷和羟基积雪草苷的工艺，其特征在于，工艺的步骤如下1)低积雪草苷含量总苷在50～65℃下用甲醇加热溶解，冷却结晶得到固形物I与结晶母液I；2)固形物I继续在50～65℃下用甲醇加热溶解，冷却结晶得到固形物II与结晶母液II；3)固形物II再次在50～65℃下用甲醇加热溶解，冷却结晶得到固形物III与结晶母液III；4)固形物III经真空干燥后得到高纯度羟基积雪草苷；5)结晶母液I经大孔吸附树脂纯化，富含总苷的收集液浓缩后真空干燥，得到高积雪草苷含量总苷；6)高积雪草苷含量总苷用溶剂I溶解、再加入溶剂II结晶得到固形物IV与结晶母液IV；7)固形物IV经真空干燥后得到高纯度积雪草苷；8)合并结晶母液II、III、IV经大孔吸附树脂纯化，富含总苷的收集液浓缩后真空干燥作为起始原料回至步骤1)。
2.根据权利要求1所述的一种低积雪草苷含量总苷出发同时制备积雪草苷和羟基积 雪草苷的工艺，其特征在于所述步骤6)中溶剂I为甲醇或二甲基甲酰胺。
3.根据权利要求1所述的一种低积雪草苷含量总苷出发同时制备积雪草苷和羟基积 雪草苷的工艺，其特征在于所述步骤6)中溶剂I的加入量为2. 5 10mL/g积雪草总苷。
4.根据权利要求1所述的一种低积雪草苷含量总苷出发同时制备积雪草苷和羟基积 雪草苷的工艺，其特征在于所述步骤6)中溶剂II为丙酮、乙腈、乙醚、乙酸乙酯或水。
5.根据权利要求1所述的一种低积雪草苷含量总苷出发同时制备积雪草苷和羟基积 雪草苷的工艺，其特征在于所述步骤6)中溶剂II的加入量为溶剂I加入量的0. 5 10倍。
6.根据权利要求1所述的一种低积雪草苷含量总苷出发同时制备积雪草苷和羟基积 雪草苷的工艺，其特征在于所述步骤5)、步骤8)中的大孔吸附树脂型号为HPD100、HPD200、 HPD300、HPD400、HPD500、HPD600、HPD700、X_5、AB-8 或 D4020。
全文摘要
本发明公开了一种低积雪草苷含量总苷出发同时制备积雪草苷和羟基积雪草苷的工艺，工艺步骤如下1)低积雪草苷含量总苷在50～65℃下用甲醇加热溶解，冷却结晶得到固形物I与结晶母液I；2)固形物I再在上述条件下重结晶二次、再经真空干燥后得到高纯度羟基积雪草苷；3)结晶母液I经大孔吸附树脂纯化，浓缩、真空干燥后得到高积雪草苷含量总苷，然后用溶剂I溶解、再加入溶剂II结晶，最后经真空干燥后得到高纯度积雪草苷；4)结晶母液经大孔吸附树脂纯化，富含总苷的收集液浓缩后真空干燥作为起始原料回用。本发明过程简单、生产成本低、污染少、产品收率和纯度高，适合于工业化生产。
文档编号C07J63/00GK101983966SQ201010556169
公开日2011年3月9日 申请日期2010年11月19日 优先权日2010年11月19日
发明者吕秀阳, 郑兴芳 申请人:浙江大学