本发明属于医药技术领域，涉及一种基于维生素e衍生物的纳米胶束药物载体、纳米胶束药物组合物及其制备方法和应用。
背景技术：
在过去几十年里，纳米药物逐渐成为提高化疗效果的新选择。然而，多药耐药性仍是对抗癌症的一大障碍。与运输相关的多药耐药产生的一个主要原因是由于药物外排泵的过表达，如会将多种药物排出细胞的p-糖蛋白(p-gp)。由于目前广泛使用的如阿霉素、紫杉醇、长春花碱等结构不一的化疗药物均是p-糖蛋白的底物，因此p-糖蛋白过表达的癌症成为临床化疗的一大挑战。其通过促进向胞外的输出而引起胞内药物积累量的下降，从而使得治疗效果下降，并导致耐药肿瘤治疗更加复杂化。
d-α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(tpgs1k)是一种由疏水部分α-tos(α-生育酚琥珀酸酯，维生素e的衍生物)和分子量为1kda的亲水部分peg(聚乙二醇)组成的非离子型双亲性分子。tpgs1k是被fda批准的一种安全性药用辅料。它的主要优点之一就是其可以克服多药耐药的能力。据报道，tpgs1k是一种p-糖蛋白的抑制剂，其作用机理是可以抑制p-糖蛋白的atp酶，而这种酶是为p-糖蛋白在排出药物时提供能量。然而，tpgs1k的亲水端不足够长来提高胶束在血液中的循环时间。另外，tpgs1k的临界胶束浓度(cmc)相当高(0.2mg/ml)，也就意味着其在血液循环中将不稳定。
鉴于此，含有2kda的peg分子的tpgs2k(其cmc为0.02mg/ml)，被引入混合胶束以降低cmc值，不仅能提高胶束的稳定性，还能延长胶束在血液中的循环时间。同时tpgs2k也可作为附加的药物载体。然而，仅仅tpgs-1k和tpgs-2k的组合，由于其疏水内核的疏水性不强，不能够负载足够多的药物，药物负载量少，抗肿瘤的效果不能提高。
因此，在本领域中开发一种既能够提高胶束稳定性又能够提高药物负载量，并具有良好抗肿瘤效果的药物胶束是本领域研究的重点。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于维生素e衍生物的纳米胶束药物载体、纳米胶束药物组合物及其制备方法和应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种基于维生素e衍生物的纳米胶束药物载体，所述纳米胶束药物载体是由d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯(tpgs1k)、d-α-生育酚聚乙二醇2000琥珀酸酯(tpgs2k)和α-生育酚琥珀酸酯(α-tos)形成的纳米胶束。
在本发明中，通过d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯与d-α-生育酚聚乙二醇2000琥珀酸酯和α-生育酚琥珀酸酯相互配合，使得形成的纳米胶束载体亲水和疏水作用达到较好的平衡，在保证具有高的胶束稳定性的同时，具有较好的p-糖蛋白抑制能力，具有较好的抗肿瘤效果，并且对正常细胞具有较小的毒性，具有良好的生物相容性。
在本发明中，所述d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯与d-α-生育酚聚乙二醇2000琥珀酸酯均为维生素e衍生物。
在本发明中，如果不使用α-tos，仅利用tpgs1000和tpgs2000是不能很稳定地负载dox。
优选地，所述d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯与d-α-生育酚聚乙二醇2000琥珀酸酯的质量比为1:10～10:1，例如1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1，优选2:1～1:2，进一步优选1:1。超出1:10～10:1的范围，例如质量比过大会增加对正常细胞的毒性；质量比过小就达不到抑制p-gp的效果。经过筛选发现，1:1的效果是最好的，对正常细胞毒性小并且p-gp抑制效果最好。
优选地，所述α-生育酚琥珀酸酯的质量与d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯和d-α-生育酚聚乙二醇2000琥珀酸酯的总质量的比值为0.25:1～10:1，例如0.25:1、0.38:1、0.5:1、0.8:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1，优选0.5:1～3:1，进一步优选1:2。α-生育酚琥珀酸酯在这里能起到损伤线粒体的作用，因此比例过小会导致对线粒体的损伤能力不足，而比例过大又会导致体系不稳定，对抗肿瘤药物的包裹能力会降低。
优选地，所述基于维生素e衍生物的纳米胶束药物载体的平均粒径为5～80nm，例如5nm、8nm、10nm、12nm、15nm、18nm、20nm、23nm、25nm、28nm、30nm、35nm、38nm、40nm、43nm、45nm、48nm、50nm、55nm、58nm、60nm、65nm、68nm、70nm、75nm、78nm或80nm，优选10～40nm。
另一方面，本发明提供一种纳米胶束药物组合物，所述纳米胶束药物组合物以如上所述基于维生素e衍生物的纳米胶束药物载体作为载体，包载有疏水性抗肿瘤药物。
在本发明中，通过d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯与d-α-生育酚聚乙二醇2000琥珀酸酯和α-生育酚琥珀酸酯相互配合，使得形成的纳米胶束载体亲水和疏水作用达到较好的平衡，在保证具有高的胶束稳定性的同时，可以提高药物的包封率，并且具有较好的p-糖蛋白抑制能力，具有良好的抗肿瘤效果，并且对正常细胞具有较小的毒性，具有良好的生物相容性。
在本发明中，tpgs1k和tpgs2k均是双亲性的，其中tpgs1k可以抑制p-糖蛋白，从而增加药物在胞内的积累，tpgs2k具有的长peg链成为体系亲水端的外壳以避免蛋白的吸附，能够增强纳米胶束载体的亲水作用，提高纳米载体在体内水环境下的稳定性，α-tos作为疏水端，能够提高纳米载体对疏水药物的包载能力，并且能够与tpgs1k和tpgs2k联合使得体系的亲水和疏水作用达到良好的平衡，增加纳米粒子在生理条件下的稳定性，并且α-tos也具有抗肿瘤的能力，可以在细胞内产生活性氧自由基(ros)，从而降低线粒体膜电位(mmp)，使得细胞色素c释放至胞质，进一步活化细胞凋亡的caspase通路。另外，α-tos具有癌细胞的高选择性，对于正常细胞毒性小甚至几乎没有毒性。因此，α-tos的引入也可以与抗肿瘤药物协同发挥抗肿瘤的效果，提高对肿瘤细胞杀伤性，并且α-tos的引入也更加能够提高纳米胶束体系对肿瘤细胞的靶向性，减小对正常细胞的毒性。
优选地，所述疏水性抗肿瘤药物为阿霉素、紫杉醇或长春花碱中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述纳米胶束药物组合物的平均粒径为5～80nm，例如5nm、8nm、10nm、12nm、15nm、18nm、20nm、23nm、25nm、28nm、30nm、35nm、38nm、40nm、43nm、45nm、48nm、50nm、55nm、58nm、60nm、65nm、68nm、70nm、75nm、78nm或80nm，优选10～30nm。
另一方面，本发明提供了如上所述的纳米胶束药物组合物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：将d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯、d-α-生育酚聚乙二醇2000琥珀酸酯、α-生育酚琥珀酸酯和疏水性抗肿瘤药物溶于有机溶剂中，而后除去有机溶剂，水化，超声，得到所述纳米胶束药物组合物的水溶液体系。
优选地，所述有机溶剂为三氯甲烷、二氯甲烷或四氢呋喃中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述除去有机溶剂的方法为通过旋转蒸发仪蒸发除去。
优选地，所述水化时使用的溶剂为水或缓冲溶液，优选缓冲溶液。
优选地，所述缓冲溶液为pbs缓冲溶液。
优选地，所述水化的温度为25～50℃，例如25℃、28℃、30℃、33℃、35℃、38℃、40℃、43℃、45℃、48℃或50℃。
优选地，所述水化的时间为10～60min，例如10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min或60min。
优选地，所述超声的时间为1～20min，例如1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、10min、12min、14min、16min、18min或20min，优选5-10min。
另一方面，本发明提供了如上所述的纳米胶束药物组合物作为抗肿瘤药物的应用。
本发明的基于维生素e衍生物的纳米胶束药物组合物可以作为抗肿瘤药物而应用，其具有肿瘤细胞或组织的靶向性，对正常细胞或组织无毒副作用，抗肿瘤效果显著。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明的基于维生素e衍生物的纳米胶束药物载体，通过d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯与d-α-生育酚聚乙二醇2000琥珀酸酯和α-生育酚琥珀酸酯相互配合，使得形成的纳米胶束载体亲水和疏水作用达到较好的平衡，胶束稳定性好，粒径小且均一，平均粒径在5～80nm，其形成的纳米胶束药物组合物可以提高药物的包封率，并且具有较好的p-糖蛋白抑制能力，具有良好的抗肿瘤效果，其对耐药株mcf-7细胞作用48小时后的ic50为3.52±0.24，并且对正常细胞具有较小的毒性，具有良好的生物相容性，并且制备方法简单，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1是实施例3制备得到的载药纳米胶束t1k2k-tos-dox的dls图；
图2是实施例3制备得到的载药纳米胶束t1k2k-tos-dox的tem图；
图3是载体t1k2k、未载药纳米胶束t1k2k-tos，实施例4制备的载药纳米胶束t1k2k-tos-dox与dox对多药耐药细胞株mcf-7(mcf-7/adr)的细胞毒性测定结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
在本实施例中，通过以下方法制备得到维生素e衍生物纳米胶束(t1k2k-tos)，具体包括以下步骤：
称取1mgtpgs1k，5mgtpgs2k，3mgα-tos，并将其溶于15ml三氯甲烷中，通过旋转蒸发仪将溶剂移除，形成的薄膜在1.5mlpbs(ph7.4)中、45℃下水化30分钟，随后超声5分钟，用0.22μm的过滤膜过滤得所述维生素e衍生物纳米胶束体系t1k2k-tos。
用malvern仪器公司的zetasizernanozs90激光动态光散射仪检测维生素e衍生物纳米胶束的粒径，平均粒径为17.2nm。
实施例2
在本实施例中，通过以下方法制备得到维生素e衍生物纳米胶束(t1k2k-tos)，具体包括以下步骤：
称取1mgtpgs1k,7mgtpgs2k和3mgα-tos，并将其溶于20ml三氯甲烷中，通过旋转蒸发仪将溶剂移除，形成的薄膜在2mlpbs(ph7.4)中、45℃下水化30分钟，随后超声5分钟，用0.22μm的过滤膜过滤得所述维生素e衍生物纳米胶束体系t1k2k-tos。
用malvern仪器公司的zetasizernanozs90激光动态光散射仪检测维生素e衍生物纳米胶束的粒径，平均粒径为64.3nm。
实施例3
在本实施例中，通过以下方法制备得到基于维生素e衍生物的纳米胶束药物组合物t1k2k-tos-dox，具体包括以下步骤：
称取1mgtpgs1k,5mgtpgs2k,2.5mgα-tos和0.6mg疏水阿霉素，并将其溶于15ml三氯甲烷中，通过旋转蒸发仪将溶剂移除，形成的薄膜在1.5mlpbs(ph7.4)中、45℃下水化30分钟，随后超声5分钟，用0.22μm的过滤膜过滤得纳米胶束药物组合物体系。
用malvern仪器公司的zetasizernanozs90激光动态光散射仪检测所述基于维生素e衍生物的纳米胶束药物组合物体系的粒径，结果如图1所示，可以看出其平均粒径为23.6nm。
利用透射电镜(ht7700,hitachi,jpn)对实施例3制备得到的载药纳米胶束t1k2k-tos-dox进行表征，如图2所示，可以看出，纳米胶束粒径均一，约为20nm。
实施例4
在本实施例中，通过以下方法制备得到基于维生素e衍生物的纳米胶束药物组合物t1k2k-tos-dox，具体包括以下步骤：
称取1mgtpgs1k，7mgtpgs2k，4mgα-tos和1.2mg阿霉素，并将其溶于20ml三氯甲烷中，通过旋转蒸发仪将溶剂移除，形成的薄膜在2mlpbs(ph7.4)中、45℃下水化30分钟，随后超声5分钟，用0.22μm的过滤膜过滤得纳米胶束药物组合物体系。
用malvern仪器公司的zetasizernanozs90激光动态光散射仪检测所述基于维生素e衍生物的纳米胶束药物组合物体系的粒径，平均粒径为30.1nm。
实施例5
与实施例4的区别仅在于，所使用的tpgs1k与tpgs2k的质量为：4mgtpgs1k，4mgtpgs2k，除此之外，其他条件以及制备方法均与实施例4相同，制备得到纳米胶束药物组合物体系。
用malvern仪器公司的zetasizernanozs90激光动态光散射仪检测所述基于维生素e衍生物的纳米胶束药物组合物体系的粒径，平均粒径为25.5nm。
实施例6
与实施例4的区别仅在于，所使用的tpgs1k与tpgs2k的质量为：6mgtpgs1k，2mgtpgs2k，除此之外，其他条件以及制备方法均与实施例4相同，制备得到纳米胶束药物组合物体系。
用malvern仪器公司的zetasizernanozs90激光动态光散射仪检测所述基于维生素e衍生物的纳米胶束药物组合物体系的粒径，平均粒径为28.4nm。
实施例7
与实施例4的区别仅在于，所使用的tpgs1k与tpgs2k的质量为：7.2mgtpgs1k，0.8mgtpgs2k，除此之外，其他条件以及制备方法均与实施例4相同，制备得到纳米胶束药物组合物体系。
用malvern仪器公司的zetasizernanozs90激光动态光散射仪检测所述基于维生素e衍生物的纳米胶束药物组合物体系的粒径，平均粒径为62.1nm。
实施例8
与实施例4的区别仅在于，所使用的α-tos的质量为2mg，除此之外，其他条件以及制备方法均与实施例4相同，制备得到纳米胶束药物组合物体系。
用malvern仪器公司的zetasizernanozs90激光动态光散射仪检测所述基于维生素e衍生物的纳米胶束药物组合物体系的粒径，平均粒径为33.4nm。
对比例1
与实施例4的区别仅在于，所使用的tpgs1k与tpgs2k的质量为：0.5mgtpgs1k，7.5mgtpgs2k，除此之外，其他条件以及制备方法均与实施例4相同，制备得到纳米胶束药物组合物体系。
用malvern仪器公司的zetasizernanozs90激光动态光散射仪检测所述基于维生素e衍生物的纳米胶束药物组合物体系的粒径，平均粒径为71.2nm。
对比例2
与实施例4的区别仅在于，所使用的α-tos的质量为0.7mg，除此之外，其他条件以及制备方法均与实施例4相同，制备得到纳米胶束药物组合物体系。
用malvern仪器公司的zetasizernanozs90激光动态光散射仪检测所述基于维生素e衍生物的纳米胶束药物组合物体系的粒径，平均粒径为33.7nm。
实施例9
在本发明中，对本发明的维生素e衍生物纳米胶束组合物(t1k2k-tos-dox)对多药耐药细胞株mcf-7(mcf-7/adr)的细胞毒性进行测定，方法如下：
按照文献(细胞培养，司徒镇强，世界图书出版公司，1996年)中的方法将上述细胞进行培养，而后分别加入实施例4制备的药物组合物，加药48小时后按照文献(细胞培养，司徒镇强，世界图书出版公司，1996年)中的方法(mtt法)检测细胞存活率(阳性对照为含相同浓度疏水性药物的游离药物组，阴性对照为不含疏水性药物的空白培养基，其中以阴性对照组中细胞的存活率按100％计算)。实施例4中的药物组合物以及阳性对照对mcf-7/adr细胞的杀伤情况分别如图3所示，加入药物的浓度以阿霉素的浓度计，分别为1、5、10、20和50μm。结果显示，实施例4中的药物组合物对mcf-7/adr细胞的杀伤效果明显高于阳性对照组。如表1所示，当本发明的基于维生素e衍生物的纳米胶束药物组合物(t1k2k-tos-dox)作用于耐药株mcf-7细胞48小时时其ic50为3.52±0.24μg/ml，比dox单药作用效果提高45倍。
同样对实施例1-3和5-8以及对比例1-2制备的药物载体以及药物组合物均进行了如上所述的细胞毒性测定，并与游离的药物dox以及单独的tpgs1k和tpgs2k形成的载体(t1k2k)做对比，其测定得到的ic50值如表1所示。
表1
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的基于维生素e衍生物的纳米胶束药物载体、纳米胶束药物组合物及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。