百里香复方植物精油在防治鸡坏死性肠炎中的应用的制作方法

本发明属于兽医学领域，具体涉及百里香复方精油在防治鸡坏死性肠炎中的应用。

背景技术：

鸡坏死性肠炎是parish(1961)首次发现的，是产气荚膜梭菌引起的一种急性消化道疾病，它是鸡普遍存在的一种疾病。给全世界的养禽业造成了每年超过20亿美元的损失。近年来，欧盟禁止在饲料中添加抗生素生长促进剂，导致了坏死性肠炎在欧洲国家的养鸡业中大量暴发。

坏死性肠炎通常发生在4周龄以后，在全世界的家禽养殖区均有发生(longjr，1973)。临床症状表现为急性临床症状和亚临床症状。

坏死性肠炎急性临床症状：急性临床症状经典的特征就是鸡群死亡率突然增加，没有先兆，有时候会出现垫料潮湿的早期症状。发病非常快，在1h～2h内死亡，有时候死亡率会增加到50％(riddelletal1992)。

亚临床症状：过去的几年里，亚临床症状更普遍，这种形式的坏死性肠炎，没有明显的临床症状且死亡率也不会增加。但是，肠粘膜的慢性损伤，会导致消化吸收不良，增重率下降，饲料转化率增加，造成巨大的生产损失(elwingeretal1992)。在亚临床感染情况下，肠道的损伤导致细菌到达胆管及门静脉，大量的产气荚膜梭菌寄生于肝脏，导致了胆管炎和肝炎，肝脏上出现淡红色或白色病灶(onderkaetal1990)。

其中，肠道病变包括：肉眼可见病变通常出现在小肠，但是其他的器官也会发生病变，如肝和肾。通过病理解剖可以发现，十二指肠、空肠和回肠肠壁变薄，且充满气体。坏死性肠炎的临床症状是小肠黏膜出现大面积坏死，表面覆盖着黄棕色伪膜。典型的亚临床症状是，肠粘膜表面有凹凸状的溃疡，黏膜变黄，表面有纤维素样物质附着。坏死性肠炎早期表现出强烈的炎症反应，固有层充血，大量的炎性细胞浸润，主要是嗜中性粒细胞。坏死性肠炎后期，肠粘膜出现弥散性坏死，占到肠道黏膜的三分之一到一半。坏死部位和其他组织之间由于嗜中性粒细胞的积累而出现一条清晰地界线。

鸡坏死性肠炎诱发因素包括以下几点：

一、营养：坏死性肠炎发生的主要风险因素就是在肠道内形成了有利于产气荚膜梭菌生长的环境。日粮的性质是影响坏死性肠炎发生的一个重要的非细菌性因子。日粮中含有高水平难消化的水溶性淀粉多糖更易患坏死性肠炎，因此大麦、黑麦、燕麦、小麦是坏死性肠炎发生的风险因素，因为水溶性淀粉多糖会增加食糜粘度，延长其在肠道通过的时间，减少营养物质消化率(cravenetal2000)。日粮中的高浓度蛋白质，如鱼粉，也会增加坏死性肠炎的发病率，因为高蛋白饲料在肠道内不易消化，导致胃肠道内蛋白质浓度增加，为细菌的生长提供了丰富的营养基质(nauerbyetal2003)。饲料颗粒的大小也会影响坏死性肠炎的发病率，饲料颗粒大的要比小的更易患坏死性肠炎(engbergetal2002)。

二、球虫：坏死性肠炎最主要的诱发因素之一就是球虫，由于球虫对肠粘膜造成了损坏，导致蛋白质血浆渗出，在肠道内为产气荚膜梭菌提供了丰富的营养基质，有利于其增殖和毒素产生(williamsetal2005)。球虫病往往是先于或与坏死性肠炎同时爆发的。试验证明，艾美耳球虫和产气荚膜梭菌在坏死性肠炎病变过程中起协同作用。al-sheikhly等在试验中，用共同感染产气荚膜梭菌和艾美耳的试验组与仅感染产气荚膜梭菌或仅感染艾美耳球虫组相比较发现，前者病变更严重且死亡率更高。

三、致病性的产气荚膜梭菌：患有坏死性肠炎的鸡的肠道中产气荚膜梭菌含量达到了10⁶～10⁸cfu/g，而健康鸡肠道中产气荚膜梭菌含量为0～10⁵cfu/g(keyburnetal2008)。然而肠道中即使含有大量的产气荚膜梭菌也不足以造成坏死性肠炎。因此产气荚膜梭菌的数量与坏死性肠炎并没有直接关系，并不是所有的产气荚膜梭菌都能够诱导坏死性肠炎。坏死性肠炎的发生需要特定的致病条件，当病变条件都存在的情况下，高数量的产气荚膜梭菌可能会导致更严重的病变，但前提是致病性菌株的存在。

四、细菌素：细菌素在坏死性肠炎发病机制中具有重要作用。通过脉冲场凝胶电泳或扩增片段长度多态性分析，健康鸡群可以分离出不同基因型的a型产气荚膜梭菌，甚至是在鸡的同一肠道内。相反的，在坏死性肠炎的病例中肠道中只能克隆出一个亚型。在自然恢复或治疗后，鸡体内的细菌又出现多个基因型(parketal，2008)。这种单一菌株占主导地位的现象在多个研究中已被证明，它是坏死性肠炎发病的主要过程。坏死性肠炎中的分离株比正常的菌株能分泌更多的抑制其他产气荚膜梭菌的生长因子。这种由细菌产生的有毒的可以抑制其他相关菌株生长的蛋白质称为细菌素。细菌素的产生抑制了其他产气荚膜梭菌在肠道内的生长，使得强势毒株代替了其他菌株。

五、netb毒素：netb毒素首次发现在患有坏死性肠炎的病鸡中分离出的a型产气荚膜梭菌中。与多种成孔毒素的氨基酸序列具有相似性，与产气荚膜梭菌β毒素同源性有38％，与葡萄球菌产生的α毒素同源性有31％。netb毒素可以使鸡的肝癌细胞变圆溶解，在细胞膜上形成1.6～1.8nm左右的孔隙。netb毒素基因位于质粒上，受到virsr双组分信号系统的调控。敲除netb毒素基因的产气荚膜梭菌，在试验中不能感染鸡或不能在肠道中产生坏死性肠炎病变。但是，插入netb毒素基因后的补充突变体和野毒株一样具有致病性(keyburnetal2008)。因此，可以看出netb毒素是引起鸡坏死性肠炎的关键因素。大多数从坏死性肠炎病例中分离出的菌株都携带netb毒素基因。在加拿大，从坏死性肠炎病鸡的产气荚膜梭菌中95％都含有netb毒素基因，从健康鸡分离出的产气荚膜梭菌中netb毒素基因阳性只占35％(chalmersetal2008)。美国分离株中，坏死性肠炎分离株netb毒素基因阳性为58％，正常菌群中菌株携带netb毒素基因只有8.75％(martinandsmyth2009)。通过使用netb毒素基因阴性和netb毒素基因阳性的a型产气荚膜梭菌大量的肉鸡感染试验，发现只有netb毒素基因阳性的产气荚膜梭菌才能产生坏死性肠炎病变，且病变程度与netb毒素的产生能力有着直接关系(keyburnetal2009)。

随着全球化的发展，我国对抗生素的控制也必将与国际标准接轨。所以需要做好应对鸡坏死性肠炎的措施。由于坏死性肠炎是一种复杂的，受多因素影响的疾病，要重现该疾病要考虑到多个方面。

而鸡坏死性肠炎动物模型的构建存在以下难点：如netb阳性菌株的筛选，不同菌株致病性能力的鉴定；攻毒前细菌需要在两种不同培养基中进行连续30个小时的培养；实验动物饲料的摸索；攻毒菌液拌料的浓度的确定，等等。此外使用不同的得分标准，造成了不同的评分系统不能进行相互的比较研究。因为鸡坏死性肠炎动物模型的建立相对复杂，所以目前大多数的研究只进行了体外测试，而没有进行动物模型中的测试。仅进行体外测试的结果往往不能真实的反应供试药物对于鸡坏死性肠炎的防治效果。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供百里香复方植物精油在防治鸡坏死性肠炎中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

百里香复方精油在防治鸡坏死性肠炎中的应用，百里香复方精油包括百里香-肉豆蔻复方精油、百里香-罗勒复方精油。

优选的，百里香-肉豆蔻复方精油中百里香精油和肉豆蔻精油的体积比为(1-3):(3-1)。

优选的，百里香-肉豆蔻复方精油中百里香精油和肉豆蔻精油的体积比为1:1。

优选的，百里香-罗勒复方精油中百里香精油和罗勒精油的体积比为(1-3):(3-1)。

优选的，百里香-罗勒复方精油中百里香精油和罗勒精油的体积比为1:1。

本发明研究中对百里香-肉豆蔻复方精油以及百里香-罗勒复方精油在(1-3):(3-1)范围内的各种配比做了相关实验，发现1:1效果佳，而且简单方便，所有优选体积比为1:1来进行后续的动物实验。

优选的，百里香复方精油通过添加到鸡的日粮中来防治鸡坏死性肠炎。

优选的，百里香复方精油添加到鸡日粮中的比例为80-150mg/kg。

优选的，百里香复方精油添加到鸡日粮中的比例为100mg/kg。

一种预防鸡坏死性肠炎的饲料添加剂，添加剂为百里香复方精油或百里香复方精油及其可接受的食品级辅料。

优选的，百里香复方精油包括百里香-肉豆蔻复方精油、百里香-罗勒复方精油。

优选的，百里香-肉豆蔻复方精油中百里香精油和肉豆蔻精油的体积比为(1-3):(3-1)。

优选的，百里香-肉豆蔻复方精油中百里香精油和肉豆蔻精油的体积比为1:1。

优选的，百里香-罗勒复方精油中百里香精油和罗勒精油的体积比为(1-3):(3-1)。

优选的，百里香-罗勒复方精油中百里香精油和罗勒精油的体积比为1:1。

一种防治鸡坏死性肠炎的方法，是将百里香复方精油添加到鸡的日粮中防治鸡坏死性肠炎；百里香复方精油包括百里香精油和肉豆蔻精油按照体积比(1-3):(3-1)混合的复方精油、百里香精油和罗勒复方精油按照体积比(1-3):(3-1)混合的复方精油。

优选的，百里香复方精油添加到鸡日粮中的比例为80-150mg/kg。

优选的，百里香复方精油添加到鸡日粮中的比例为100mg/kg。

植物精油可以很好地和鸡日粮混合均匀。

本发明的有益效果是：

申请人经过1-2年的时间成功地构建了鸡坏死性肠炎动物模型，本模型使用小麦基础饲料进行饲喂，并在后期添加鱼粉。小麦含有非淀粉性多糖，增加了食糜粘度，影响了小肠的消化吸收，为产气荚膜梭菌的增殖提供了条件。后期加入的鱼粉，使日粮中蛋白质含量增加，可以提供给产气荚膜梭菌大量的氨基酸，使鸡更易患坏死性肠炎。采用产气荚膜梭菌单独攻毒，典型病变明显；能排除以前球虫并发模型与球虫病混淆的现象。本模型试验周期短，重复性高。除了体外实验，申请人还利用该模型研究植物精油的体内防治效果，真正明确了植物精油对于鸡坏死性肠炎具有预防和治疗的效果。

申请人经过大量研究，优选出百里香-肉豆蔻1:1混合复方精油、百里香-罗勒1:1混合复方精油，上述植物精油组合对鸡坏死性肠炎都具有一定的防治效果。

高通量测序技术是目前比较先进的研究微生物多样性的手段，申请人运用高通量测序技术研究植物精油对鸡坏死性肠炎肠道微生物的影响。得到的试验结果数据量大，准确性高。优于传统的试验方法。本发明通过对8个实验组的小肠和盲肠段的肠道菌群进行高通量测序。经过质控、拼接处理后，每个样品中的优化序列条带均在3000条以上。通过稀释曲线可知，测序量和测序深度足够覆盖样品中大部分物种，满足后续分析。通过4个alpha指数，即ace指数、chao指数、shannon指数和simpson指数可以看出，在小肠段，相对于坏死性肠炎疾病模型组，各植物精油治疗组肠道内容物中物种的丰度减小，但多样性增加。肠道微生物菌群是维持肠道健康的重要因素，一个平衡的微生物菌群可以有效地防御肠道内的病原体。采用植物精油治疗组的肠道菌群相对于人工感染组都有不同程度的变化，这些变化可能对疾病的防御产生积极的影响。

附图说明

图1为鸡坏死性肠炎小肠不同病变；其中注：1为空白对照，2、3、4、5、6、7对应的分别是典型的1分、2分、3分、4分、5分、6分病变；

图2为病灶分离出的产气荚膜梭菌基因型鉴定；其中，m为dl2000marker，1～20为病灶分离出的产气荚膜梭菌菌株；

图3为病灶分离出的产气荚膜梭菌netb基因鉴定；其中，m为dl2000marker，1～20为病灶分离出的产气荚膜梭菌菌株；

图4为有效序列长度分布统计；

图5为稀释性曲线；

图6为门水平物种分布柱状图；

图7为目水平物种分布柱状图；

图8为科水平物种分布柱状图；

图9为差异性矩阵热图；

图10为多样品相似度树状图；

图11为基于unweightedunifrac的pcoapcoa散点图。

具体实施方式

鸡坏死性肠炎是产气荚膜梭菌引起的一种急性消化道疾病，是鸡最重要的肠道疾病之一。给全球的养禽业造成了巨大的损失。随着国内外对抗生素促生长剂使用的限制，该病的发病率有所增加。找到一种安全、有效地新型药剂是当今养殖领域的热点问题。

发明人建立了鸡坏死性肠炎人工发病模型，并为其体内的筛选奠定了基础。整个研究包括7部分1.鸡粪便样品和坏死性肠炎病例肠道组织中产气荚膜梭菌的分离鉴定；2.multi-pcr方法对产气荚膜梭菌野外分离株进行基因型鉴定；3.产气荚膜梭菌野外分离株netb毒素基因(netb)检测；4.产气荚膜梭菌野外分离株的耐药性检测；5.eric-pcr对产气荚膜梭菌野外分离株进行亚型分析；6.鸡坏死性肠炎模型建立；7.植物精油对坏死性肠炎的防治。

试验从广东省清远、佛山、云浮、江门、广州等地的5个规模化养鸡场中采集了粪便样品和坏死性肠炎病例肠道组织550份，采用选择性培养基tsc平板和血琼脂平板进行初步分离，然后又对分离株进行了生化鉴定和含铁牛乳特征性鉴定。初步分离出47株产气荚膜梭菌，分离率为8.5％，相对于国外报道分离率较低。

针对α、β、ε和ι四种毒素基因进行引物设计，建立multi-pcr方法。使用引物如下所示：

表1：muliti-pcr引物序列

pcr反应体系为25μl反应体系：dna模板2μl，上下游引物各0.125μl，maxmaster12.5μl，无核酸酶水9.5μl。反应程序：94℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，30个循环；72℃，10min；10℃保存。

pcr反应结束后，取8μl的pcr产物，在1％琼脂糖凝胶电泳，80v，40min检测，使用凝胶成像系统记录成像，图片保存。

使用该方法对47株产气荚膜梭菌进行基因型鉴定，47株分离株均扩增出400bp左右的特异性片段，可以鉴定为a型。另外通过该方法对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌、丁酸梭菌进行扩增，没有出现特异性产物，说明了该方法具有特异性。

设计出netb毒素基因的引物，如下所示：

上游引物：5’-gctggtgctggaataaatgc-3’(seqidno：9)；

下游引物：5’-tcgccattgagtagtttccc-3’(seqidno：10)。

pcr反应体系为25μl反应体系：模板dna2μl，引物各0.5μl，maxmaster12.5μl，无核酸酶水9.5μl。反应程序：94℃2min；94℃45s，50℃30s，72℃45s，30个循环；72℃10min；10℃保存。

pcr反应结束后，取8μl的pcr产物，在1％琼脂糖凝胶电泳，80v，40min检测，使用凝胶成像系统记录成像，图片保存。

通过pcr方法检测47株产气荚膜梭菌，结果只有3株产气荚膜梭菌是netb基因阳性，记名为cpnetbb、cpnetbd和cpnetbf。

对47个分离株进行药敏试验。试验使用了12种抗生素和化学合成药，其中对甲硝唑和林可霉素的耐药比率较高，分别为95.7％和91.5％。对头孢氨苄、土霉素、多西环素、克林霉素、红霉素的耐药比率也在70％～80％之间。氨苄青霉素耐药比率最低，只有12.8％。

对47株通过multi-pcr鉴定为a型的产气荚膜梭菌采用eric-pcr技术进行亚型分析。以相似性≥0.60为分界点，47株分离株可以分为5个主型，以相似性≥0.70为分界点，47株分离株可以分为8个亚型。

模型试验中，采用1日龄的健康罗斯308鸡苗，随机分为6组，每组10只。自由饮水，采食小麦为基础的日粮。其中1组是空白对照，其他组为试验组。除了空白对照组，其他组都采用菌液拌料的方式进行攻毒。5组试验组中3个实验组分别采用3株netb基因阳性菌株攻毒，另外2组分别用2个netb基因阴性的菌株攻毒。整个饲养过程日粮分为两个阶段：1～13日龄饲喂小麦基础的日粮，14～23日龄在基础饲料中添加50％的鱼粉。21～23日龄对5个试验组进行菌液拌料攻毒，每天两次。攻毒试验所用的菌液配制方法：试验菌株先在庖肉培养基里40℃厌氧培养15h，然后转移至ft液体培养基中继续40℃厌氧培养15h。24日龄剖检，观察小肠病变并进行记分，记分使用的是6分系统。结果发现，空白对照组和另外2个netb基因阴性的菌株攻毒组都没有明显的病变。3个netb基因阳性的菌株攻毒组都出现了典型的坏死性肠炎病变。均在发病鸡的病灶中分离出netb基因阳性的a型产气荚膜梭菌。

采用纸片扩散法和二倍稀释法研究植物精油或复方植物精油对产气荚膜梭菌的抑菌活性。

下面结合具体实验对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。如无特殊说明，本发明中所述的混合复方精油配方中肉豆蔻精油、百里香精油、罗勒精油均是按照体积比进行混合。所述精油产品参考国家标准。

实验1鸡的坏死性肠炎模型建立

1.材料与方法

1.1试验菌株

试验攻毒所用菌株为坏死性肠炎病例分离出的a型产气荚膜梭菌，其中ne01和ne02为netb基因阴性菌株，cpnetbb、cpnetbd和cpnetbf为分离自广东省博罗、东莞、佛山地区netb阳性菌株。

1.2试验动物及设计

试验选用1日龄的罗斯308商用鸡苗，购自广东东莞正大康地有限公司。随机分为6组，每组10只。试验分为6组，1组为空白对照不进行细菌攻毒，其他5组在21日龄进行菌液拌料攻毒，5组攻毒细菌分别是ne01、ne02、cpnetbb、cpnetbd和cpnetbf。

1.3试验日粮

基础日粮和江昌蒸汽鱼粉购自广州市江丰实业有限公司，基础日粮组成和营养水平见表2。

表2基础日粮组成及营养水平

。

1.4饲养管理

试验前1周，清理鸡舍，先用火焰消毒笼舍、地面，再用甲醛熏蒸消毒，饲养全程定期消毒。采用笼养。相对湿度保持在64％～76％。，整个过程保持良好通风，自由采食及自由饮水。1～13日龄饲喂基础日粮，14～23日龄在基础日粮中加入鱼粉，使鱼粉含量达到50％。

1.5攻毒菌悬液准备

将试验组的产气荚膜梭菌(包括netb基因阴性菌株ne01和ne02，netb阳性菌株cpnetbb、cpnetbd和cpnetbf)复苏，划线接种到tsc平板上，40℃厌氧培养24h。取平板上黑色典型菌落接种到庖肉培养基中，40℃厌氧培养15h。然后将庖肉培养物接种到400ml的ft液体培养基中，40℃厌氧培养15h。

1.6疾病模型建立

将ft培养物加入饲料中，拌匀，菌液与饲料比例为(体积/重量；ml/g)1：1.5。每天两次，上午8:00，下午4:00，连续饲喂3d。

1.7病变记分

24日脱颈处死，剖检观察十二指肠、空肠回肠病变，分别对各组的病变进行记分。记分标准见表3。

表3坏死性肠炎病变评分

。

1.8病灶分离产气荚膜梭菌基因型和netb基因检测

用一次性拭子从病变部位采集样品。经过分离鉴定后，进行产气荚膜梭菌分离基因型鉴定和进行netb基因检测。

1.9数据处理

数据用平均值±标准差表示，用spss17.0进行显著性分析。

2.鸡坏死性肠炎模型建立结果

2.1临床症状和肠道病变

没有攻毒前鸡状态良好，开始攻毒1d后，除空白组外，其余各组均出现轻微的腹泻。连续攻毒后，3组netb基因阳性菌株攻毒组腹泻症状加重，食欲减退，排红色或黑褐色煤焦油样粪便，有的粪便中混有血液、肠粘膜组织。

剖检后，空白组，肠粘膜光滑，无损伤。

两株netb基因阴性的菌株攻毒组，出现仅出现肠粘膜增厚现象，并没有其他明显可见病变。

3株netb阳性菌株攻毒组，出现的不同程度的典型坏死性肠炎病变，小肠黏膜表面有凹凸状溃疡，表面有纤维样物质附着，严重的肠粘膜出现弥散性坏死。结果见图1。图1为鸡坏死性肠炎小肠不同病变；其中：1为空白对照，2、3、4、5、6、7对应的分别是典型的1分、2分、3分、4分、5分、6分病变。

2.2小肠病变记分

小肠病变记分结果见表4。

表4小肠病变记分结果

注：表内肩注小写字母不同表示差异显著(p＜0.05)，大写字母不同表示差异极显著(p＜0.01)，字母相同表示差异不显著。

表4结果显示：空白组没有任何病变出现。netb基因阴性的两株菌只是引起了肠壁黏膜的变厚，没有其他可见病变。netb基因阳性的三组都出现了明显的坏死性肠炎病变。其中netb阳性三组得分极显著高于空白组和netb阴性组。两组netb阴性组得分差异不显著。

2.3病灶分离产气荚膜梭菌基因型和netb基因检测结果

经过muliti-pcr方法进行基因型检测，发现所有病灶分离出的产气荚膜梭菌(图2和图3)均扩增出400bp左右的片段，判定为a型菌，netb基因检测也都为阳性。

图2为病灶分离出的产气荚膜梭菌基因型鉴定；其中，m为dl2000marker，1～20为病灶分离出的产气荚膜梭菌菌株。

图3为病灶分离出的产气荚膜梭菌netb基因鉴定；其中，m为dl2000marker，1～20为病灶分离出的产气荚膜梭菌菌株。

近年来对鸡坏死性肠炎的研究集中在找控制该病的方法，及弄清楚发病机制方面。通过人工诱导建立鸡坏死性肠炎模型是研究的基础。在以前研究中，常采用球虫并发的模式诱导试验，但问题是小肠球虫病和鸡坏死性肠炎容易混淆。发明人在本发明中只采用了产气荚膜梭菌菌液单独攻毒方案，效果明显。netb基因阳性的3个菌株试验组都出现了典型的坏死性肠炎病变。且从病灶分离出的产气荚膜梭菌菌株都是a型netb基因阳性的菌株，说明了攻毒的3组netb阳性菌可以引起鸡的坏死性肠炎。3组出现坏死性肠炎病变的试验组，病变得分各不相同，病变程度有差异，这说明即使都是netb基因阳性的产气荚膜梭菌，但是各个菌株的致病性还是存在差别的。2组netb阴性的分离株和空白组都没有出现坏死性肠炎病变。这从反面说明netb基因是鸡坏死性肠炎发病的重要原因。

试验中基础饲料中使用了小麦，小麦含有非淀粉性多糖，增加了食糜粘度，影响了小肠的消化吸收，为产气荚膜梭菌的增殖提供了条件。后期加入的鱼粉，使日粮中蛋白质含量增加，可以提供给产气荚膜梭菌大量的氨基酸，使鸡更易患坏死性肠炎。

本次试验模型的初步成功，为进一步的研究奠定了基础，如抗菌药物、疫苗、毒力因子评价等。不过由于不同的研究者对疾病的再现有着不同的目的，所要求的疾病严重性也不同，所以应用时还需要对模型进行相应的调整。

实验2植物精油的体外抑菌试验

日粮中添加抗生素一直以来都是控制坏死性肠炎的主要方法，但是随着抗生素促生长剂逐渐在世界各地被禁用，对新型替代治疗药物的研究成为当务之急，申请人优选出几种精油配方作为一种安全有效的抗生素替代品，具有重要的开发价值。

1.材料与方法

1.1试验菌株

病料中分离出的3株netb阳性菌株，即cpnetbb、cpnetbd和cpnetbf。

1.2植物精油

肉豆蔻单方精油、百里香单方精油、罗勒单方精油、肉豆蔻和百里香精油1:1混合复方、肉豆蔻和罗勒1:1混合复方、百里香和罗勒1:1混合复方。所用植物精油均购自广州市某日用品有限公司。

1.3滤纸片的制备

选吸水性强而质地均匀的滤纸，用打孔机打成直径为6mm的圆片，分装于洁净的干燥试管中，121℃高压灭菌15min后备用。

1.4菌株活化

将冻存的3株菌株解冻，划线接种于tsc平板上，40℃厌氧培养24h。挑取典型的黑色菌落，接种到10mlft液体培养基中，40℃厌氧培养8h。按照0.5麦氏比浊管将菌液稀释至10⁸cfu/ml。

1.5纸片扩散法

用移液枪吸取100μl10⁸cfu/ml试验菌液至ft营养琼脂培养基上，用涂布器均匀涂布3次然后绕平板边缘涂抹一周，盖好平皿，置室温干燥3～5min。每个平板贴放用灭菌的镊子小心夹取滤纸片，贴于培养基表面，并轻压纸片，使其紧贴培养基表面，各纸片中心相距大于24mm，纸片距平皿外缘大于15mm。分别吸取5μl植物精油原液滴加到滤纸片上。将平皿倒置，40℃厌氧培养24h，观察并测量抑菌圈的直径，每组做3次重复，取平均值。

抑菌圈判定标准：抑菌作用效果以抑菌圈直径小于10mm为不敏感，在11～15mm之间为敏感，在16～20之间为中度敏感，大于20mm为高度敏感。

2纸片扩散法结果

利用纸片扩散法检测单方精油和复方精油对产气荚膜梭菌致病菌的敏感性和抑菌作用。结果见表5和表6。

表5：3种单方植物精油对三株致病菌的抑菌圈直径(mm)

注：抑菌圈判定标准：抑菌作用效果以抑菌圈直径小于10mm为不敏感，在11～15mm之间为敏感，在16～20之间为中度敏感，大于20mm为高度敏感。

从表5中可以看出3种单方植物精油对3株产气荚膜梭菌致病菌都有较强的抑菌作用。对于netbc和netbd株效果更为明显，达到了高度敏感。对于netbf株抑制效果为中度敏感。

表6：复方植物精油对三株致病菌的抑制作用(mm)

注：抑菌圈判定标准：抑菌作用效果以抑菌圈直径小于10mm为不敏感，在11～15mm之间为敏感，在16～20之间为中度敏感，大于20mm为高度敏感。

从表6中可以发现3种复方植物精油的抑菌效果也比较强。对于netbc株复方植物精油的增效作用明显。

实验3植物精油的最小抑菌浓度(mic)试验

1.材料与方法

1.1植物精油供试品的配制

吸取0.4ml植物精油至ep管内，添加吐温-800.1ml，混合均匀，加入0.5ml无菌水，稀释成浓度为400μl/ml，再次混合均匀。乳白色液体，现配现用。

1.2二倍稀释法

无菌条件下，取10支试管，编号，其中9号管为阳性管，10号管为为阴性管，其余为不同浓度管。用移液枪给1号管和10号管加9mlft培养基，其余各管加5mlft培养基。再给1号管加入植物精油供式品，吹打均匀，吸取5ml放入2号管，依次类推至8号管。10号管加入植物精油供式品，吹打均匀，吸取5ml，弃去。给1号管至9号管添加100μl菌悬液。36℃±1℃厌氧培养6～8h。分别吸取各管内液体100μl至ft营养琼脂培养基上，涂布均匀。36℃±1℃厌氧培养24小时，观察结果。凡是无菌生长平板对应的药物最高稀释浓度为这种植物精油对产气荚膜梭菌的最小抑菌浓度。试验重复3次。

2.最低抑菌浓度试验结果

结果见表7。

表7植物精油对对三株致病菌的mci结果(μl/ml)

如表7所示，单方及复方精油对3株netb阳性菌株均具有一定的抑制作用。对于netbc株六种精油或精油组合的mic均为0.31μl/ml。对于netbd株六种精油的mic均为0.63μl/ml。对于netbf株百里香、罗勒和百里香+罗勒效果最好，mic为1.25μl/ml。

实验4植物精油用于防治鸡坏死性肠炎的动物试验

1.材料与方法

1.1试验菌株

netbf菌株：为a型产气荚膜梭菌，netb基因阳性。

1.2试验动物及设计

试验选用1日龄的罗斯308商用鸡苗80只，随机分为8个组，每组15只。1组为空白组，1组是攻菌对照组，其余6组组为植物精油防治组，分别在17日龄后饲料中添加100mg/kg1:1的肉豆蔻单方精油、百里香单方精油、罗勒单方精油以及复方植物精油。

1.3试验日粮

基础日粮，鱼粉采用如实验1。

1.4坏死性肠炎模型建立

根据实验1所用的方法对除了空白对照组的其余7个试验组进行攻毒。

1.5小肠病变记分。

24日龄，随机选取10只鸡，脱颈处死，剖检观察十二指肠、空肠、回肠病变，分别对各组的病变进行记分。记分标准如表3。数据处理如实验1。

1.6分离株基因型netb基因鉴定

用一次性拭子从病变部位采集样品。经过分离鉴定后，按照实验1的方法进行产气荚膜梭菌分离基因型鉴定和进行netb基因检测。

1.7高通量测序技术分析鸡肠道菌群的多样性

1.7.1肠道内容物样本采集

在24日龄时，每个实验组随机选取5只鸡，剖解后，在十二指肠和盲肠端两端扎结取出，冰盒保存。在超净工作台内，将肠道分为两部分，小肠段(十二指肠、空肠和回肠)和盲肠段。无菌环境下将肠道内容物取出，并将每组5只鸡的肠道内容物充分混合。－80℃保存。

1.7.2细菌总dna提取

鸡肠道内容物中细菌总dna提取采用qiaampdnastoolminikit试剂盒进行抽提，具体流程参照试剂盒说明书。

1.7.3illuminamiseq测序分析

将提取的肠道细菌dna送至微基生物科技(上海)有限公司进行高通量测序。

1.7.4生物信息学分析

包括测序数据处理、out分析、物种信息分析、alpha多样性分析和beta多样性分析。

2动物试验结果

2.1小肠病变记分结果，见表8。

表8：小肠病变记分

注：表内肩注小写字母不同表示差异显著(p＜0.05)，大写字母不同表示差异极显著(p＜0.01)，字母相同表示差异不显著。

由表8看出：与攻毒组比较，百里香单方精油治疗组没有显著性差异，其他机组均有显著性差异。结果表明肉豆蔻单方精油、罗勒单方精油、肉豆蔻和百里香精油1:1混合复方、肉豆蔻和罗勒1:1混合复方、百里香和罗勒1:1混合复方治疗组可以显著减轻产气荚膜梭菌对肠道的损伤。百里香单方治疗组没有效果。从病变严重程度来看，百里香单方植物精油效果最好，相对于其他组，病变处在4～6分的鸡只有1只。肉豆蔻+罗勒复方植物精油相对于其单方时，病变处在4～6分的鸡也有所下降。

综上所述，动物试验中肉豆蔻单方精油、罗勒单方精油、肉豆蔻和百里香精油1:1混合复方、肉豆蔻和罗勒1:1混合复方、百里香和罗勒1:1混合复方对坏死性肠炎都具有一定的防治效果。但是根据记分结果来看，治疗组中还是有较多的病变出现，这可能是由于虽然植物精油具有抑菌效果，但是并不能使毒素失活。在这次试验动物模型中，采用的是连续培养后的菌液拌料攻毒，培养液中含有大量的毒素，造成了肠黏膜的损伤。另外，植物精油的用量，添加时间的长短等可能都会影响其防治效果。实际应用中可以增加植物精油饲喂时间，这样可以在前期控制产气荚膜梭菌的增殖，使得细菌数量和毒素含量都大大降低，从而减小疾病的发生。

2.2病灶分离产气荚膜梭菌基因型和netb基因检测结果

经过基因型检测所有病灶分离出的产气荚膜梭菌均扩增出400bp左右的片段，判定为a型菌，netb基因检测也都为阳性。

2.3不同植物精油对鸡肠道菌群的影响

2.3.1序列数目结果

结果见表9和表10，以及图4。

表9有效序列统计

注：表中g1、g2、g3、g4、g5、g6、g7、g8分别代表空白组、攻毒对照组、肉豆蔻组、百里香组、罗勒组、肉豆蔻+百里香1:1混合复方组、肉豆蔻+罗勒1:1混合复方组、百里香+罗勒1:1混合复方组。a代表小肠段，b代表盲肠段。在本发明中如无特殊说明，均代表此含义。

表10优化序列统计

表9和表10以及图4结果显示，高通量测序的有效序列均在50000条左右，有效序列长度大多在450bp左右，经过质控和拼接处理后，每个样品所得到的条带序列均在30000条以上。

鸡的肠道内存在着复杂的微生物菌群，这些菌群的组成对宿主的健康、生产性能、发育及营养物质消化吸收等方面都有重要作用。研究其肠道菌群结构组成和变化有着重要意义。高通量测序技术是目前比较先进的研究微生物多样性的手段，本次试验运用高通量测序技术研究植物精油对鸡坏死性肠炎肠道微生物的影响。得到的试验结果数据量大，准确性高。优于传统的试验方法。

本次试验通过对8个实验组的小肠和盲肠段的肠道菌群进行高通量测序。经过质控、拼接处理后，每个样品中的优化序列条带均在3000条以上。通过稀释曲线可知，测序量和测序深度足够覆盖样品中大部分物种，满足后续分析。

2.3.2肠道菌群的丰度及多样性分析

样品中菌群的稀释性曲线如图5，由图5可知，随着测序序列数的增加，其斜率逐渐减小，趋于平台期。说明测序深度足够覆盖样品中的大部分物种，满足后续分析。

各样品的otu数目、ace指数、chao指数、shannon指数和simpson指数如表11所示。

表11样品多样性结果

由表11可知，所有样品中均可检测出较多的otu，otu的数量分布在192～274之间。这表明本次取样的肠道内容物中，各组物种丰度很高，但是不同组之间物种构成的差异较大。通过4个alpha指数可以看出，在小肠中，相对于坏死性肠炎疾病模型组，各治疗组肠道内容物中物种的丰富度减小，但多样性增加。其中肉豆蔻+百里香组多样性最高。在盲肠中，相对于坏死性肠炎疾病模型组，肉豆蔻+罗勒组菌群丰富度最高、多样性最好。

2.3.3肠道菌群结构分析

对各样品从门、目、科3个水平进行整理分析，绘制不同水平上的物种相对丰度柱状图，如图6、图7和图8。并绘制群落热图。

从图6可以看出，在门水平上，在不同样品的不同肠段中，厚壁菌门(frimicutes)(firmicutes)均是最主要菌门。在小肠中，坏死性肠炎模型组变性菌门(proteobacteria)占18.9％。但是在植物精油治疗组中，罗勒、肉豆蔻+百里香、肉豆蔻+罗勒和百里香+罗勒组中，方线菌门(actinobacteria)比例增加，分别为32.5％、14.6％、45.3％、23.3％。其中百里香+罗勒组中拟杆菌门(bacterodetes)(bacterodetes)比例为23.3％，与其他各组差异较大。在盲肠中，拟杆菌门(bacterodetes)(bacterodetes)是各组含量第二多的门，但是相对于攻毒组，各植物精油防治组中拟杆菌门(bacterodetes)(bacterodetes)比例增加。

从图7可知，在目水平上看梭菌目(clostridiules)和乳杆菌目(lactobacillales)为各样品肠道中的主要目。在小肠中，植物精油防治组中，罗勒和肉豆蔻+罗勒组中，相对攻毒组，梭菌目(clostridiules)所占比例减少，攻毒组中梭菌目(clostridiules)比例为55.3％，57比例分别为20.1％和16.0％，且在肉豆蔻+罗勒组中芽孢杆菌目(bacillales)含量增加，为15.0％。百里香+罗勒组中拟杆菌目(bcateroidales)含量比其他组高，占23.3％。在盲肠中，拟杆菌目(bcateroidales)成为第三种主要目，各组菌群结构改变不大。

从图8可知，在科水平上，小肠中，攻毒组菌群结构中，主要的科为乳杆菌科(lactobacillaceae)、肠杆菌科(enterobacteriaceae)、瘤胃球菌科(ruminococcaceae)和毛螺旋菌科(lachnospiraceae)所占比例为19.5％、18.3％、5.1％和3.6％。相对于攻毒组，各植物精油治疗组中，罗勒、肉豆蔻+百里香、肉豆蔻+罗勒和百里香+罗勒组中菌群结构改变较大，罗勒组中，棒状杆菌科(corynebacteriacea)占31.4％；肉豆蔻+罗勒组中，瘤胃球菌科(ruminococcaceae)占19.8％，棒状杆菌科(corynebacteriacea)占13.3％，毛螺旋菌科(lachnospiraceae)占11.8％；肉豆蔻+罗勒组中比例最高的科是棒状杆菌科(corynebacteriacea)占27.3％，和其他组明显不同的是，葡萄球菌科(staphylococcaceae)和短杆菌科(brevibacteriacea)含量增加，比例分别为13.0％和10.2％；百里香+罗勒组中，理研菌科(rikenellaceae)含量增加，占23.3％。盲肠中，各种主要菌群为乳杆菌科(lactobacillaceae)、毛螺旋菌科(lachnospiraceae)和瘤胃球菌科(ruminococcaceae)，各组差别不大。热图代表样品中各物种的相对丰度水平，可以通过颜色的梯度及相似度来反映样品在各类水平上群落组成的相似性和差异性。

肠道中菌群的改变对鸡的饲料转化率也有着不同的影响，从侧面表现出植物精油对宿主生产性能的作用。肠道微生物菌群是维持肠道健康的重要因素，一个平衡的微生物菌群可以有效地防御肠道内的病原体。本发明试验中各治疗组的肠道菌群相对于攻毒组都有不同程度的变化，这些变化可能对疾病的防御产生积极的影响。

2.3.4beta多样性分析

分别利用差异性矩阵热图(图9)、多样品相似度树状图(图10)和pcoa散点图(图11)表示各样本之间的相似度，在矩阵热图中，颜色代表样本距离值，颜色越红代表样本相似度越高，颜色越蓝则表示相似性越低；pcoa散点图中，样品组成越相似，其在图中的距离约近。由图9、图10、和图11中可以看出，各组的小肠细菌结构，罗勒组和肉豆蔻+罗勒组与空白组群落结构相似，和攻毒对照组差别较大。其他几各治疗组和攻毒对照组相似性接种近。盲肠中，各组的肠道菌群结构很相似。

各组盲肠肠道菌群结构很相似。这说明由于坏死性肠炎病变主要发生在小肠段，产气荚膜梭菌的攻毒没有对盲肠段产生明显的影响。另外由于代谢吸收等作用，至盲肠植物精油的含量减小，作用也相应减少了。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>广东省农业科学院动物卫生研究所

<120>百里香复方植物精油在防治鸡坏死性肠炎中的应用

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