女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物及其用途的制作方法

本发明涉及一种女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物在制备治疗和/或预防神经退行性疾病药物中的应用。

背景技术：

神经退行性疾病是神经细胞进行性变性坏死所引起的中枢神经功能减退导致的疾病，伴随着全球人口的老龄化而呈加重趋势，包括阿尔茨海默病(alzheimer’sdisease,ad)、帕金森病(parkinson’sdisease,pd)、肌萎缩侧索硬化症(atrophylateralsclerosis,als)、亨廷顿氏病(huntington’sdisease,hd)以及脑中风(stroke)和心脑血管性痴呆(vasculardementia,vd)。其主要影响患者的认知功能和运动功能，致残、致死率极高，给患者家庭和社会带来极大的心理和经济负担。

目前大部分神经退行性疾病尚无有效地阻断神经细胞变性过程的治愈疾病的手段，临床上主要是以药物对症治疗为主，只能改善症状且有明显副作用。例如左旋多巴作为临床治疗pd的药物，但长期服用左旋多巴会带来严重的不良反应——无意识的运动能力上的波动性：即左旋多巴引起的运动障碍(l-dopa-induceddyskinesia，lid)和非运动功能副作用。具体体现为易怒冲动、赌博成瘾、强迫症、多巴胺调节异常综合征等。因此，寻找一种安全可靠无副作用的药物治疗pd等神经退行性疾病具有深远意义。

传统的中医学认为山香圆叶具有清热解毒，利咽消肿，活血止痛。用于乳蛾喉痹，咽喉肿痛，疮疡肿毒，跌扑伤痛。女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷是山香圆叶的主要成分之一，

女贞苷的分子式：c33h40o18，分子量：724.2，结构式如下：

野漆树苷的分子式：c27h30o14，分子量：578.52，结构式如下：

金丝桃苷的分子式：c21h20o12，分子量：464.38，结构式如下：

目前并未发现山香圆叶主要成分具有治疗和/或预防神经退行性疾病药物的作用。

技术实现要素：

本发明人出乎意料地发现，一种女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物对于神经退行性疾病具有良好的治疗和/或预防作用。

本发明提供一种女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物在制备治疗和/或预防神经退行性疾病药物中的应用，所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物是由下列重量配比制成的：女贞苷40％～90％、野漆树苷5％～40％、金丝桃苷5％～30％。

优选的，其中所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物是由下列重量配比制成的：女贞苷40％～80％、野漆树苷10％～40％、金丝桃苷10％～25％。

优选的，其中所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物是由下列重量配比制成的：女贞苷50％～70％、野漆树苷20％～35％、金丝桃苷10％～25％。

优选的，其中所述的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物是由下列重量配比制成的：女贞苷58％、野漆树苷25％、金丝桃苷17％。

优选的，其中，所述神经退行性疾病为帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症、脑中风或心脑血管性痴呆。

优选的，其中，所述神经退行性疾病为阿尔兹海默病。

优选的，其中，所述神经退行性疾病为app/ps1阿尔兹海默病。

优选的，其中，所述神经退行性疾病为帕金森病。

优选的，其中，所述神经退行性疾病为mptp引起的帕金森病。

优选的，其中，所述女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物可单独或与其他药物组合制备预防和/或治疗神经退行性疾病药物。

附图说明

图1：女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物改善ad小鼠的水迷宫实验数据图。

图2，女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物缓解ad小鼠的y迷宫实验数据图。

图3：女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物改善pd小鼠悬挂实验的实验数据图。

图4：女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物改善pd小鼠爬杆能力的实验数据图。

图5：女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物提高pd小鼠游泳时间的实验数据图。

具体实施方式

实施例1：女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物的制备

取山香园叶1000g，加12倍量70％乙醇回流提取1.5小时，滤过，滤渣再加10倍量70％乙醇回流提取1.5小时，滤过，合并两次提取液，回收乙醇，水溶液通过已处理好的d101大孔树脂柱，分别用水、10％乙醇、45％乙醇、1％氢氧化钠溶液洗脱，收集45％乙醇洗脱部分，减压浓缩，干燥，得30％以上女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷的混合总苷，经硅胶柱层析、sephadexlh-20柱层析分离，分别合并女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷流份，结晶，得到女贞苷(3.5g，纯度：98.5％)、野漆树苷(1.5g，纯度：98.7％)、金丝桃苷(1g，纯度：98.2％)纯品。

实施例2：

将女贞苷(14g)、野漆树苷(6g)与金丝桃苷(3.6g)以7∶3∶1.8的比例混合，搅拌、研磨、混合均匀后得女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物(23.6g)。

实施例3：

将女贞苷(10g)、野漆树苷(10g)与金丝桃苷(6g)以5∶5∶3的比例混合，搅拌、研磨、混合均匀后得女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物(26g)。

实施例4：

将女贞苷(16g)、野漆树苷(4g)与金丝桃苷(2g)以8∶2∶1的比例混合，搅拌、研磨、混合均匀后得女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物(22g)。

实施例5：

将女贞苷(16g)、野漆树苷(2g)与金丝桃苷(2g)以8∶1∶1的比例混合，搅拌、研磨、混合均匀后得女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物(20g)。

实施例5：女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物对app/ps1阿尔兹海默症小鼠的治疗作用

1.材料与方法

1.1实验动物与药品

本实验选用app/ps1雄性小鼠和同窝野生型小鼠，在室温(22℃-24℃)，湿度(50％-60％)，每日光照和和黑暗时间各12h的安静环境下饲养，自由取食饮水。实验前，将动物至于实验环境适应3天。女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物如实施例2制备。

1.2动物分组与给药

小鼠称重后随机分为野生型，野生型给药组，app/ps1模型组、app/ps1女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物0.5g/l和1.0g/l治疗组，灌胃容量均为0.4ml/只，每组5只。小鼠3月龄开始灌胃给药，持续给药6个月。

1.3行为学检测

1.3.1水迷宫实验

圆形恒温水池直径120cm，高50cm；圆形平台直径9cm,高度可调，升降范围20-35cm，本实验设定高度为20cm，平台可置于任意一个象限的中央。按东南西北四个方向将水池平均划分为四个象限(ne、se、sw、nw)，于各象限的池壁中点处将已剪好的不同形状的彩纸贴于高于水面的池壁内侧，做为小鼠寻找平台的标记物。水池内壁均为黑色，池壁标记物的位置在整个实验过程中保持固定。水迷宫视频采集系统要求水池壁和水的颜色要与实验动物毛色形成颜色反差，从而可以视频跟踪记录小鼠运动轨迹和各项实验参数。水深21cm,平台位于水面下1cm,肉眼观察水面无法看到平台位置。并用白色染料二氧化钛200g溶入水中搅匀，使水的颜色变成乳白色。为了适应啮齿类动物的趋暗性，实验室挂窗帘严密避光且整个水池周围挂遮光布帘，保证其内部无灯光直射。水池内有温控器，将水温保持在21-22℃。实验期间打开水池外的白炽灯，功率≤13瓦，灯光直射墙面，使墙面反光分散的分布于水池内。

历时6d，实验前1天不放置平台，让小鼠自由游泳1min。正式实验时将平台固定在nw象限，位于水面下1cm。实验室中的物品和人员的位置在实验期间固定不变，作为动物的空间参照物。每日每只小鼠测试4次，第一次和第四次从目标象限对侧的象限(se)入水，第二次和第三次采用随机法确定入水象限(不包括se和nw象限)。监测时间为60s，小鼠在平台上停留超过2s判为寻台成功，小鼠入水至寻台成功的时程记作逃避潜伏期；若小鼠60s内未找到平台则潜伏期记为60s。小鼠爬上平台或实验时间超过60s则实验中止；让小鼠休息1min后，开始下一次实验。实验第一天的第一次测试前，先将小鼠置于平台上停留15s(称为适应)，之后的各次测试前不再给予适应。测试完毕不论寻台是否成功，均将小鼠置于平台适应10s。每次训练完后，用干毛巾将小鼠擦干，以防止低体温造成的应激。

1.3.2y迷宫实验

y迷宫装置：y迷宫用pvc板制作，内外壁贴黑色胶纸。共3个臂，各个臂夹角120度，每一臂尺寸30cm×8cm×15cm(长×宽×高)，在中央处各有一个可移动的隔板，在迷宫各个臂内贴上不同几何图形，作为视觉标记。每个y迷宫的3个臂被随机设为：新异臂(novelarm)、起始臂(startarm)和其他臂(otherarm)。新异臂：在实验的第1个阶段即训练期时用隔板挡住，在第2个阶段即测试期时打开；起始臂：小鼠进入迷宫时所在的臂。整个实验过程中起始臂和其他臂都是一直打开，动物可以自由出入。迷宫内铺垫木屑，每次训练或测试结束后，混匀各个臂里的锯末，以防动物残留气味干扰。迷宫上方1.5m处安置摄像镜头，全过程录像。

1.3.3tht检测小鼠大脑沉积的β淀粉样斑块

切片脱蜡水化后，加入1％的硫磺素(tht)漂洗15min,双蒸水漂洗5min,加入1％的醋酸缓冲液5min去除多余颜色，50％甘油封片，荧光显微镜下观察。

1.4统计方法

实验数据以(mean±sem)表示，应用graphpadprism5.0软件进行统计分析。计量资料采用单因素方差分析，p＜0.05为差异有统计学意义。

2.实验结果

2.1女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物改善ad小鼠空间学习记忆能力

小鼠水迷宫实验结果表明，小鼠的逃避潜伏期和到达平台前游泳距离随训练时间的增加明显减少，女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物给药组表现出学习能力较好的趋势，具有统计学意义。如图1所示，女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物组能够增加小鼠在撤去平台后在平台的目标象限的活动时间(p＜0.05)。图2小鼠y迷宫实验结果说明女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物可以提高小鼠在新颖臂中的停留时间(p＜0.05)。综上说明女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物能够改善ad小鼠的空间学习记忆能力。

2.2女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物对ad小鼠aβ的沉积没有影响

学习记忆能力的改善作用与ad的淀粉样斑块沉积无关。体外实验通过女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物与amyloidbeta1-42蛋白孵育72h，tht染色后通过荧光酶标仪检测，发现女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物与aβ的聚集无关。

3.实验数据结论

ad的临床症状是逐渐发生的记忆障碍或遗忘发展为以语言功能障碍、视空间功能受损、失认及失用和计算力障碍为主的认知障碍和精神障碍。app/ps1阿尔兹海默症小鼠在出生后3个月出现ad病理改变，6个月aβ开始沉积。因此，在小鼠3月龄开始灌胃给予女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物，持续给药6个月。给药结束后通过水迷宫、y迷宫检测小鼠学习记忆能力，tht染色检测小鼠aβ淀粉样斑块沉积。

基本确定女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物对小鼠阿尔兹海默症具有改善的作用，且这种改善作用与aβ的产生无关。

实施例6：女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物对mptp致小鼠帕金森病的治疗作用

1.材料与方法

1.1实验动物与药品

本实验选用10-12周龄25-28g健康雄性c57bl/6小鼠，小鼠在室温(22℃-24℃)，湿度(50％-60％)，每日光照和和黑暗时间各12h的安静环境下饲养，自由取食饮水。实验前，将动物至于实验环境适应3天。

mptp购于sigma，左旋多巴购于罗氏制药，女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物如实施例2制备。mptp在给药前30min内以生理盐水配制，冰上保存。

1.2动物分组与给药

小鼠称重后随机分为正常组，mptp(25mg/kg)模型组，女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物5mg/kg和10mg/kg治疗组，左旋多巴治疗组，每组8-10只。mptp(25mg/kg)按小鼠体重0.1ml/20g腹腔注射5天，女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物在mptp给药1h后按小鼠体重0.1ml/20g在另一侧腹腔注射给药11天，给药结束后进行行为学实验检测。美多芭(75mg/kg)按小鼠体重0.1ml/20g灌胃。

1.3行为学检测

1.3.1悬挂实验(ractiontest)

正常小鼠具有攀爬习性，这需要适当的握力和肢体运动协调性，因此可以用悬挂实验来测试mptp给药后小鼠的运动功能障碍。实验中将小鼠放置于距地面30cm高度，成水平状态的粗细度为0.5cm的小木杆上，记录下落地前的时间，若超过3min则记录为3min，然后作统计学分析。

1.3.2爬杆实验(poletest)

爬杆实验是为了检测并了解小鼠肢体运动协调情况。在一根长度为60cm且粗细为1cm的木杆顶端上放置一块海绵板，在木杆外面缠上纱布避免小鼠在攀爬过程中出现打滑问题。将小鼠头部向上放于杆顶端，记录动物从开始运动到完全转为头向下的时间(t-turn)，并作统计学分析。

1.3.3强迫游泳(swimtest)

目的是测试小鼠肢体运动协调情况。将受试小鼠放入一个直径为35cm的水桶中，水温为22℃-25℃，水深20cm，记录小鼠在5分钟游泳时间内小鼠不动的时间和游泳的时间，并作统计学分析。

实验数据以(mean±sem)表示，应用graphpadprism5.0软件进行统计分析。计量资料采用单因素方差分析，p＜0.05为差异有统计学意义。

2.实验结果

2.1女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物改善pd小鼠悬挂能力

用悬挂实验检测小鼠抓握能力。如图3所示，mptp-pd小鼠抓握能力减弱，在木杆上悬挂时间短，与正常小鼠相比，悬挂时间短有显著性差异(p<0.01)。在给予女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物治疗后，10mg/kg治疗组能够显著改善pd小鼠的悬挂能力(p<0.01)，给予左旋多巴后能够增加pd小鼠的悬挂时间(p<0.01)。这表明，10mg/kg的女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物治疗组能够显著改善pd小鼠的肌肉震颤，提高小鼠抓握能力。

图3中，(mean±sem,n＝8,**p<0.01vs.control,##p<0.01vs.mptp-treatedgroup)。

2.2女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物改善pd小鼠爬杆能力

小鼠爬杆能力能够检测小鼠的运动协调能力。mptp-pd小鼠运动协调能力差，在杆子上掉头的时间长，与正常小鼠相比有显著性差异。10mg/kg治疗组可以显著改善pd小鼠掉头时间，提高小鼠肢体协调能力(p<0.01)，左旋多巴也能够显著性的提高小鼠掉头的协调能力(p<0.01)。

图4中，各组小鼠在爬杆实验中掉转头的时间(mean±sem,n＝8,*p<0.01vs.control,##p<0.01vs.mptp-treatedgroup)。

2.3女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物改善pd小鼠强迫游泳能力

小鼠强迫游泳可以检测小鼠的运动协调能力和抑郁症状。如图5所示：mptp-pd小鼠表现出游泳时间短(p<0.05)，多数时间呈漂浮状态，在给予女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物后，能够显著提高pd小鼠的游泳能力和抑郁状态(p<0.05)，左旋多巴治疗组可以显著改善pd小鼠的运动协调能力和情绪抑郁状态(p<0.05)。

图5中，(mean±sem,n＝8,*p<0.05vs.control,#p<0.05vs.mptp-treatedgroup)。

4.实验结论

pd的临床症状是运动功能障碍，因此我们通过一系列行为学实验研究女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物对pd的治疗作用。给药结束后通过悬挂实验、爬杆实验、强迫游泳实验检测小鼠行为学，观察药物对小鼠帕金森样行为的改善。

悬挂实验中，正常小鼠具有良好的爪抓持物体的习性和攀爬活性，这需要适当的握力控制和运动协调性，因此可以通过悬挂实验来测试小鼠的肢体运动协调情况，通过小鼠悬挂时间及悬挂活动过程可以很好反应出小鼠震颤、肌肉僵直等情，从而用于评估小鼠的肌肉力量和肢体协调功能，是一种良好的帕金森病模型小鼠运动功能检测方法。女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物和左旋多巴都可以改善pd小鼠的运动协调能力。

爬杆实验中，正常小鼠均可以迅速地反转并且迅速爬到杆底部,且肢体动作协调，而mptp给药的小鼠，调头时间、爬杆时间与正常对照组相比均有不同程度的延长。女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物高剂量组和左旋多巴组都能提高pd小鼠的降低时间。

强迫游泳实验是一种用来评估潜在的抗抑郁疗效验证。mptp-pd小鼠中，由于大脑黑质多巴胺能神经元受损，情感上表现出抑郁症状，因此通过计算小鼠在一定时间内的平均游泳时间来评估小鼠的抑郁精神状态，观察其游泳过程的肢体运动判断小鼠运动协调能力。女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物和左旋多巴都能够改善pd小鼠的抑郁样症状。

在行为学实验中我们观察到虽然左旋多巴能够改善mptp-pd小鼠运动能力，增加小鼠肌张力，但是小鼠呈现躁动状态，而女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物在改善小鼠运动功能障碍的同时不会引起小鼠躁动状态，与左旋多巴相比没有副作用。综上所述，基本确定女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物对小鼠帕金森病具有较好改善的作用。

申请人通过实验证明，女贞苷、野漆树苷、金丝桃苷组合物还对肌萎缩性侧索硬化症、脑中风或心脑血管性痴呆等神经退行性疾病具有良好的治疗或预防作用。