专利名称：高速逆流色谱制备特女贞苷、女贞苦苷和齐墩果酸的方法
技术领域：
本发明属于天然植物提取制备领域，涉及一种从天然植物女贞子中用高速逆流色 谱分离制备特女贞苷、女贞苦苷和齐墩果酸的方法。
背景技术：
女贞子为木犀科(Oleaceae)植物女贞Ligustrum lucidum Ait干燥成熟果实，是 我国传统的扶正固本药物。具有有养阴气、平肝火、健腰膝、壮筋骨、滋补肝肾、乌须发等功 效。近年来多用于治疗慢性气管炎、肝炎、高血脂症、糖尿病、更年期综合征、不孕症、动脉粥 样硬化等。所含化学成分主要有有机酸、苷、萜类、留类、糖类、氨基酸及微量元素、挥发油。 齐墩果酸为其主要五环三萜成分，特女贞苷和女贞苦苷是其水溶性裂环环烯醚萜苷成分。 结构如下
齐墩果酸现代药理研究表明，女贞子具有强心、激素双向调节、降血糖降血脂、调节机体免 疫功能、抗炎抗菌、抗衰老、抗动脉粥样硬化、能对化疗或放疗所致白细胞减少由升高白细 胞的作用。特女贞苷具有协同增加亚适量的ConA刺激淋巴细胞转化的作用，并在一定程度 上有拮抗Dex的抑制作用。齐墩果酸具有护肝降酶、抗血小板聚集、降血脂、对免疫系统及 对II、III、IV型变态反应具有明显抑制作用。为了对女贞子三萜及裂环环烯醚萜苷成分进 行更深入的药理活性与作用机制等研究，同时需要三萜及裂环环烯醚萜等指标性成分对女 贞类药材和相关中药制剂进行质量控制，需要大量单体化合物。因此，提供一种快速、高效 的从女贞中分离纯化特女贞苷、女贞苦苷和齐墩果酸方法，对开发具有特殊疗效的现代中 药制剂和充分利用我国药材资源等具有重要意义。采用普通色谱柱法、重结晶等传统的分离方法分离植物中的有效单体，不仅费时 费力、污染环境，且所用固定相对样品有不可逆性吸附作用，这就需要一种新型的分离技术 来解决上述问题。高速逆流色谱(HSCCC)是近年来发展起来的一种连续的无需固体支撑物 的高效、快速的液液分配色谱分离技术，具有分离量大、样品无损失、回收率高、分离环境缓 和、节约溶剂等特点，已广泛应用于生物、医药、环保等领域化学物质的制备分离和纯化。
发明内容
本发明的目的是提供高速逆流色谱制备特女贞苷、女贞苦苷和齐墩果酸的方法，以克服现有技术中存在的上述问题。本发明通过以下技术方案实现高速逆流色谱制备特女贞苷、女贞苦苷和齐墩果酸的方法，其包括以下步骤由粗提物的制备和粗提物的分离纯化两部分组成，其特征在于粗提物的分离纯化 应用高速逆流色谱，其基本工艺路线是 (1)将女贞子药材粉碎，沸水水浴加热提取，提取液趁热过滤，冷却，得到水取物和 残留物；(2)特女贞苷、女贞苦苷的富集将水提物加入大孔吸附树脂吸附，10-50%乙醇 梯度洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，得到特女贞苷、女贞苦苷混合粗提物；(3)齐墩果酸的提取将水提残留物加入沸乙醇中回流提取1-1. 5小时，提取1-3 次，过滤得提取液，再加入活性炭回流脱色，过滤，浓缩脱色液得齐墩果酸流浸膏；(4)特女贞苷、女贞苦苷的纯化将粗提物用高速逆流色谱分离法制得高纯度特 女贞苷和女贞苦苷的纯品。(5)齐墩果酸的纯化将上述齐墩果酸流浸膏用高速逆流色谱分离法制得高纯度 齐墩果酸纯品。步骤(1)中所述的水提液料比为1 8_10(kg/L)，提取时间为1. 5-2小时。步骤(2)中所述大孔吸附树脂可选非极性、弱极性或中极性大孔吸附树脂，如 DlOU AB-8、DM301、HPD100 等大孔吸附树脂。步骤(2)中所述洗脱条件为先用3-4倍柱体积10% -30%乙醇洗脱，再用4_5倍 柱体积35% -50%乙醇洗脱。步骤(3)中所述沸乙醇浓度为70% _95%，用量为残留物质量的10_20倍；所述活 性炭用量为0.5% _1%，脱色0. 5-1小时。步骤(4) (5)中所述高速逆流色谱法对粗提物进行纯化，先配制构成固定相、流动 相的溶剂体系，使逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使柱子转动，再将流动相泵入柱内， 由进样阀进入制备好的粗提物，两相溶剂体系以上相为固定相，下相为流动相，根据检测谱 图接收目标成份。步骤(4)中所述高速逆流色谱法对特女贞苷、女贞苦苷进行纯化，溶剂体系由四 个组分构成，A组分可选自氯仿、二氯甲烷等卤代烃，B、C组分可选自甲醇、乙醇、丙醇、丙 酮、正丁醇、异丁醇等脂肪醇或脂肪酮，D组分为水，优选氯仿-甲醇-正丁醇-水体系，A、 B、C、D 的体积比为 1-5 2-10 0.5-5 2-10。步骤(4)中所述高速逆流色谱法对特女贞苷、女贞苦苷进行纯化，溶剂体系由三 个组分构成，A组分可选自乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸正丁酯等脂肪酯类，B组分可选自甲 醇、乙醇、丙醇、丙酮、正丁醇、异丁醇等脂肪醇或脂肪酮，C组分为水，优选乙酸乙酯-正丁 醇-水体系，A、B、C的体积比为1-4 1-2 2-5。步骤(5)所述高速逆流色谱法对齐墩果酸进行纯化，溶剂体系由四个组分构成，A 组分可选自乙醚、氯仿、丙酮、正己烷或庚烷，B组分可选自乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异丙酯 等脂肪酯类，C组分可选自乙醇或甲醇，D组分为水，优选氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水体系， A、B、C、D 体积比为 1-10 1-20 1-10 I-IO0所述的主机转速为500-1000r/min，所述的流动相的流速为1. 0-5ml/min。
综上所述，本发明存在以下优点(1)本分离过程可连续进行，操作简便，效率高；(2)采用高速逆流色谱法制备，不存在不可逆吸附，避免了样品的损耗，具有分离 效果好，溶剂用量少，无污染，高效、快速等特点。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步的说明。实施例1 1.取500g女贞子药材粉碎成粗粉投入提取罐中，加8倍量沸水水浴加热提取2h， 提取3次，趁热过滤，冷却，得到水提物和残留物。 2.将水提物上AB-8大孔树脂柱饱和吸附lh，先用4倍柱体积20%乙醇洗脱，再用 4倍柱体积50%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，干燥得到特女贞苷和女贞苦苷混合 粗提物；将水提残留物加入15倍量的95%沸乙醇回流提取lh，提取2次，趁热过滤得提取 液，加入2. 5g活性炭加热回流脱色0. 5h，趁热过滤，减压浓缩得齐墩果酸流浸膏。3.应用高速逆流色谱分离纯化粗提物。A.采用氯仿甲醇正丁醇水(2 8 1 7)的溶剂系统，转速为750r/min， 上相为固定相，下相为流动相，流速5ml/min。具体操作步骤是按上述体积比配制溶剂系统置于分液漏斗中，摇勻后，静置分 层，等平衡一段时间后，将上、下相分开。接着，先用上相作为固定相，充满整个柱子，调整 主机正转，将下相流动相从柱子的首端泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进 样；然后根据检测器的谱图收集目标成分。B.将A分离得到的部分应用高速逆流色谱仪再次分离纯化。采用乙酸乙酯正丁醇水(2 1 3)的溶剂系统，转速为750r/min，上相为固 定相，下相为流动相，流速5ml/min，具体操作同A，将目标成分分别用甲醇重结晶即得特女 贞苷和女贞苦苷。C.采用氯仿乙酸乙酯甲醇水(3 15 5 5)的溶剂系统，转速为750r/ min，上相为固定相，下相为流动相，流速5ml/min，具体操作同A，将目标成分用无水乙醇重 结晶即得到齐墩果酸。按上述条件得到特女贞苷、女贞苦苷和齐墩果酸的纯度用HPLC进行检测，结果都 彡 96%。HPLC分析条件色谱柱C18，流动相为MeOH H2O (40 60)；检测波长224nm。实施例2 1.取200g女贞子药材粉碎成粗粉投入提取罐中，加10倍量沸水水浴加热提取 1. 5h，提取2次，趁热过滤，冷却，得到水提物和残留物。2.将水提物上AB-8大孔树脂柱饱和吸附1. 5h，先用3倍柱体积10%乙醇洗脱，再 用4倍柱体积45%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，干燥得到特女贞苷和女贞苦苷混 合粗提物；将水提残留物加入13倍量的85%沸乙醇回流提取1. 5h，提取3次，趁热过滤得 提取液，加入2. 5g活性炭加热回流脱色lh，趁热过滤，减压浓缩得齐墩果酸流浸膏。3.应用高速逆流色谱分离纯化粗提物。
A.采用氯仿甲醇正丁醇水(4 8 2 7)的溶剂系统，上相作为固定相， 下相为流动相，转速为560r/min，流速2. 5ml/min。具体操作步骤基本同“实施例1”。B.将A分离得到的部分应用高速逆流色谱仪再次分离纯化。采用乙酸乙酯正丁醇水(3 2 4)的溶剂系统，转速为560r/min，上相为固 定相，下相为流动相，流速2. 5ml/min,具体操作步骤基本同“实施例1 ”。采用氯仿乙酸乙酯甲醇水(2 17 3 6)的溶剂系统，上相作为固定相， 下相为流动相，转速为560r/min，流速2. 5ml/min。具体操作步骤基本同“实施例1”。所得产品经液相色谱分析表明纯度均> 97 %。实施例3 1.取IOOOg女贞子药材粉碎成粗粉投入提取罐中，加9倍量沸水水浴加热提取 2h，提取2次，趁热过滤，冷却，得到水提物和残留物。 2.将水提物上DM301大孔树脂柱饱和吸附2h，先用4倍柱体积10%乙醇洗脱，再 用5倍柱体积40%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，干燥得到特女贞苷和女贞苦苷混 合粗提物；将水提残留物加入16倍量的80%沸乙醇回流提取3h，提取2次，趁热过滤得提 取液，加入9g活性炭加热回流脱色0. 5h，趁热过滤，减压浓缩得齐墩果酸流浸膏。3.应用高速逆流色谱分离纯化粗提物。A.采用氯仿甲醇正丁醇水(5 3 0.5 8)的溶剂系统，上相作为固定 相，下相为流动相，转速为lOOr/min，流速2.5ml/min。具体操作步骤基本同“实施例1”。B.将A分离得到的部分应用高速逆流色谱仪再次分离纯化。采用乙酸乙酯正丁醇水(4 1.5 5)的溶剂系统，转速为560r/min，上相为 固定相，下相为流动相，流速4ml/min，具体操作步骤基本同“实施例1 ”。采用氯仿乙酸乙酯甲醇水(2 17 3 6)的溶剂系统，上相作为固定相， 下相为流动相，转速为lOOOr/min，流速4ml/min。具体操作步骤基本同“实施例1”。所得产品经液相色谱分析表明纯度均> 96. 5%。
权利要求
高速逆流色谱制备特女贞苷、女贞苦苷和齐墩果酸的方法，由粗提物的制备和粗提物的分离纯化两部分组成，其特征在于粗提物的分离纯化应用高速逆流色谱，其基本工艺路线是(1)将女贞子药材粉碎，沸水水浴加热提取，提取液趁热过滤，冷却，得到水提物和残留物；(2)特女贞苷、女贞苦苷的富集将水提物加入大孔吸附树脂吸附，10 50％乙醇梯度洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，得到特女贞苷、女贞苦苷混合粗提物；(3)齐墩果酸的提取将水提残留物加入沸乙醇中回流提取1 1.5小时，提取1 3次，过滤得提取液，再加入活性炭回流脱色，过滤，浓缩脱色液得齐墩果酸流浸膏；(4)特女贞苷、女贞苦苷的纯化将粗提物用高速逆流色谱分离法制得高纯度特女贞苷和女贞苦苷的纯品。(5)齐墩果酸的纯化将上述齐墩果酸流浸膏用高速逆流色谱分离法制得高纯度齐墩果酸纯品。
2.根据权利要求1所述的高速逆流色谱制备特女贞苷、女贞苦苷和齐墩果酸的方法， 其特征在于步骤(1)中所述的水提液料比为1 8-10 (kg/L)，提取时间为1.5-2小时。
3.根据权利要求1所述的高速逆流色谱制备特女贞苷、女贞苦苷和齐墩果酸的方法， 其特征在于步骤(2)中所述大孔吸附树脂可选非极性、弱极性或中极性大孔吸附树脂，如 D101、AB-8、DM301、HPD100 等大孔吸附树脂。
4.根据权利要求1所述的高速逆流色谱制备特女贞苷、女贞苦苷和齐墩果酸的方法， 其特征在于步骤(2)中所述洗脱条件为先用3-4倍柱体积10% -30%乙醇洗脱，再用4-5 倍柱体积35% -50%乙醇洗脱。
5.根据权利要求1所述的高速逆流色谱制备特女贞苷、女贞苦苷和齐墩果酸的方法， 其特征在于步骤(3)中所述沸乙醇浓度为70% -95%，用量为残留物质量的10-20倍；所 述活性炭用量为0. 5% -1%，脱色0. 5-1小时。
6.根据权利要求1所述的高速逆流色谱制备特女贞苷、女贞苦苷和齐墩果酸的方法， 其特征在于步骤(4) (5)中所述高速逆流色谱法对粗提物进行纯化，先配制构成固定相、 流动相的溶剂体系，使逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使柱子转动，再将流动相泵入柱 内，由进样阀进入制备好的粗提物，两相溶剂体系以上相为固定相，下相为流动相，根据检 测谱图接收目标成份。
7.根据权利要求1所述的高速逆流色谱制备特女贞苷、女贞苦苷和齐墩果酸的方法， 其特征在于步骤(4)中所述高速逆流色谱法对特女贞苷、女贞苦苷进行纯化，溶剂体系由 四个组分构成，A组分可选自氯仿、二氯甲烷等卤代烃，B、C组分可选自甲醇、乙醇、丙醇、丙 酮、正丁醇、异丁醇等脂肪醇或脂肪酮，D组分为水，优选氯仿-甲醇-正丁醇-水体系，A、 B、C、D 的体积比为 1-5 2-10 0.5-5 2-10。
8.根据权利要求1所述的高速逆流色谱制备特女贞苷、女贞苦苷和齐墩果酸的方法， 其特征在于步骤(4)中所述高速逆流色谱法对特女贞苷、女贞苦苷进行纯化，溶剂体系由 三个组分构成，A组分可选自乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸正丁酯等脂肪酯类，B组分可选自甲 醇、乙醇、丙醇、丙酮、正丁醇、异丁醇等脂肪醇或脂肪酮，C组分为水，优选乙酸乙酯-正丁 醇-水体系，A、B、C的体积比为1-4 1-2 2-5。
9.根据权利要求1所述的高速逆流色谱制备特女贞苷、女贞苦苷和齐墩果酸的方法， 其特征在于步骤(5)所述高速逆流色谱法对齐墩果酸进行纯化，溶剂体系由四个组分构 成，A组分可选自乙醚、氯仿、丙酮、正己烷或庚烷，B组分可选自乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸 异丙酯等脂肪酯类，C组分可选自乙醇或甲醇，D组分为水，优选氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水 体系，A、B、C、D 体积比为 1-10 1-20 1-10 I-IO0
10.根据权利要求1所述的高速逆流色谱制备特女贞苷、女贞苦苷和齐墩果酸的方法， 其特征在于所述的主机转速为500-1000r/min，所述的流动相的流速为1. 0-5ml/min。
全文摘要
本发明涉及的是一种应用高速逆流色谱法从天然植物女贞子中分离制备高纯度特女贞苷、女贞苦苷和齐墩果酸的方法，其特点是不存在不可逆吸附，避免了样品的损耗，具有分离效果好，溶剂用量少，无污染，高效、快速和大制备量分离的优点。该方法适用于以各种途径获得的各种含特女贞苷、女贞苦苷和齐墩果酸中的一种或几种成分的天然产物、天然产物的提取物为原料制备高纯度单体，简便易行。
文档编号C07H1/08GK101955504SQ201010182759
公开日2011年1月26日 申请日期2010年5月26日 优先权日2010年5月26日
发明者刘东锋, 杨成东, 郭琴 申请人:南京泽朗医药科技有限公司