女贞苷、金丝桃苷组合物及其制备药物用途的制作方法

专利名称：女贞苷、金丝桃苷组合物及其制备药物用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种女贞苷、金丝桃苷组合物及其制备药物用途。
背景技术：
目前流行性感冒病毒日益严重，并且流行性感冒病毒与呼吸道疾病及引起的全身 性疾病密切相关，我国是流感高发国家之一，不但人口众多，而且生活习惯也有利于流感病 毒的转播，每年人平均发病次数达到0. 3 0. 7次不等，重点人群达到2 4次。流感对人 类存在严重威胁，尤其是新发品种流感病毒，其不但引起继发性其它微生物感染，而且会直 接导致器官破坏和变态反应致人死亡。但目前并没有有效的治疗流行性感冒病毒及其疾病 (流感)的方法和治疗手段，如针对临床症状进行炎症反应治疗，治标不治本。目前最常见 的预防和治疗流行性感冒病毒的方法是使用流感病毒疫苗接种，非特异性抗病毒中药或西 药磷酸奥司他韦(达菲)_神经氨酸酶抑制剂。然而流感病毒疫苗预防接种弊端在于接种 人群有选择性，不是人人可以接种。此外，流感病毒疫苗保护率不高，保护时间也较短(3 6个月)。目前大多数非特异性抗病毒中药虽然宣称有抗病毒作用，但是并非针对流感病 毒，且抗病毒作用机理不清楚。在我们以往研究的许多种治疗外感风寒，西医所认为的感冒 的中药组方并没有直接抗流感病毒的作用。简单的说，不是所有的治疗感冒的中药组方都 有明确的抑制流感病毒的作用。西药“磷酸奥司他韦(达菲，(3R，4R，5S)-4-乙酰胺-5-氨 基-3(1-丙氧乙酯)-1_环己烯-1羧酸乙酯磷酸盐)”是神经氨酸酶抑制剂，对流感病毒进 入细胞有特异性抑制作用，但是不仅价格昂贵，而且有一些患者服用后出现呕吐、恶心、失 眠、头痛、腹痛、腹泻、头晕、疲劳、鼻塞、咽痛和咳嗽等副反应。达菲是在体内被位于肝脏和 肠道的酯酶转化为活性代谢产物而起着抑制神经氨酸酶作用，如果患者肝脏和肠道器官功 能不正常也将影响其药效。此外，肾功能不全患者也要慎用。传统的中医学认山香圆叶具有清热解毒，利咽消肿，活血止痛。用于乳蛾喉痹，咽 喉肿痛，疮疡肿毒，跌扑伤痛。女贞苷和金丝桃苷是山香圆叶的主要成分之一。女贞子功 能为滋补肝肾，明目乌发。主要用于眩晕耳鸣，腰膝酸软，须发早白，目暗不明，近年来多用 于治疗慢性气管炎、肝炎、高血脂症、糖尿病、更年期综合征、不孕症、动脉粥样硬化等，女贞 苷是女贞子的主要成分之一。贯叶金丝桃具有舒肝解郁，清热利湿，消肿止痛。用于情志不 畅，气滞郁闷，关节肿痛，小便不利。金丝桃苷是贯叶金丝桃的主要成分之一，金丝桃苷对心 肌缺血再灌注，脑缺血再灌注，脑梗塞都显示良好的保护作用，还具有镇痛，抗氧化，保护心 肌、肝脏作用。并未发现山香圆叶及其所含的女贞苷和金丝桃苷、女贞子及其所含的女贞 苷、贯叶金丝桃及其所含的金丝桃苷具有抑制流感病毒感染、复制的作用，也未发现其具有 抑制神经氨酸酶的作用。

发明内容
本发明的目的是提供女贞苷、金丝桃苷组合物，其可以抑制流感病毒神经氨酸酶 水解细胞表面唾液酸，导致流感病毒不能与细胞表面受体结合而进入细胞内，以及减少流感病毒在细胞内的产生，从而有效地针对性地抑制流感病毒复制，更重要地是本发明提供 一种女贞苷、金丝桃苷组合物可以克服现有药物的副反应弊端。本发明提供的女贞苷、金丝桃苷组合物，所述女贞苷的分子式=C33H4tlO18,分子量 724. 2，所述女贞苷的结构式如下 所述金丝桃苷的分子式=C21H2tlO12,分子量464. 38，所述金丝桃苷的结构式如下 其中所述的女贞苷、金丝桃苷组合物是由下列重量配比制成的女贞苷80% 20%、金丝桃苷20% 80%。优选的，其中所述的女贞苷、金丝桃苷组合物是由下列重量配比制成的女贞苷 75% 25%、金丝桃苷25% 75%。优选的，其中所述的女贞苷、金丝桃苷组合物是由下列重量配比制成的女贞苷 60 % 40 %、金丝桃苷40 % 60 %。优选的，其中所述的女贞苷、金丝桃苷组合物是由下列重量配比制成的女贞苷 55 % 45 %、金丝桃苷45 % 55 %。优选的，其中所述的女贞苷、金丝桃苷组合物是由下列重量配比制成的女贞苷 50%、金丝桃苷50%。另一方面，本发明还提供了女贞苷、金丝桃苷组合物的提取方法，其中所述的女贞 苷、金丝桃苷是从山香圆叶中提取获得的，所述提取方法如下取山香圆叶，加5 15倍量 的30% 90%乙醇回流提取1 3次，每次回流提取1 3小时，滤过；合并滤液，回收乙 醇，水溶液通过大孔树脂柱洗脱，收集洗脱部分，减压浓缩，干燥，得女贞苷、金丝桃苷的混 合总苷，经分离，分别合并女贞苷、金丝桃苷流份，结晶，得到女贞苷、金丝桃苷纯品。
优选的，其中所述的女贞苷、金丝桃苷采用如下的提取方法获得取山香圆叶，加 12倍量70%乙醇回流提取1. 5小时，滤过，滤渣再加10倍量70 %乙醇回流提取1. 5小时， 滤过，合并两次提取液，回收乙醇，水溶液通过大孔树脂柱洗脱，收集洗脱部分，减压浓缩，干燥。优选的，其中水溶液通过已处理好的DlOl大孔树脂柱，分别用水、5% 10%乙 醇、30 % 55 %乙醇、1 %氢氧化钠溶液洗脱，收集30 % 55 %乙醇洗脱部分，减压浓缩，干 燥，得女贞苷、金丝桃苷的混合总苷，经硅胶柱层析、Si^phadex LH-20柱层析分离，分别合并 女贞苷、金丝桃苷流份，结晶，得到女贞苷纯品和金丝桃苷的纯品。本发明的另一目的是提供了女贞苷、金丝桃苷组合物制备预防和治疗流感及其并 发症疾病的药物的用途。优选的，女贞苷、金丝桃苷组合物用于抑制流感病毒。优选的，女贞苷、金丝桃苷组合物用于抑制流感病毒FMl。优选的，女贞苷、金丝桃苷组合物用于抑制神经氨酸酶。优选的，其并发症是指肾功能衰竭。优选的，其并发症是指脾损伤或/和肺损伤。本发明所述的女贞苷、金丝桃苷可以是从含女贞苷、金丝桃苷的各种药材中如山 香圆叶、女贞子、贯叶金丝桃中提取获得女贞苷、金丝桃苷粗品或女贞苷、金丝桃苷单体化 合物。最后，本发明还提供了一种女贞苷、金丝桃苷组合物制剂，该制剂以本发明上述的 女贞苷、金丝桃苷组合物为主要活性成分。实验数据证明，本发明的女贞苷、金丝桃苷组合物是有效的抑制神经氨酸酶成分， 女贞苷、金丝桃苷组合物随着使用剂量大小变化，其抑制神经氨酸酶活性的能力，即神经氨 酸酶抑制率的高低也相应发生变化，并且成正相关，女贞苷、金丝桃苷组合物能够通过抑制 流感病毒表面神经氨酸酶，进而抑制流感病毒进入细胞里面、抑制已经进入细胞里面的流 感病毒复制、增殖，从而减少了流感病毒对细胞的感染、生长，以及预防和治疗流感及其并 发症，还可以抑制流感病毒神经氨酸酶水解细胞表面唾液酸，导致流感病毒不能与细胞表 面受体结合而进入细胞内，以及减少流感病毒在细胞内的产生，更重要地是本发明提供一 种女贞苷、金丝桃苷组合物可以克服现有药物的副反应弊端。而医学和药学研究人员无法预先在不做抑制流感病毒感染、复制，或抑制神经氨 酸酶的实验的前提下，预先得知女贞苷、金丝桃苷组合物具有预防和治疗流感病毒性感冒 的良好效果。综上所述，本发明提供的女贞苷、金丝桃苷组合物及其用途带来显著的技术效果。
具体实施例方式实施例1本发明提供的所述女贞苷的分子式=C33H4tlO18,分子量724. 2，所述女贞苷的结构
式如下
6 本发明提供的所述金丝桃苷的分子式=C21H2tlO12,分子量464. 38，所述金丝桃苷的
结构式如下 其中所述的女贞苷、金丝桃苷是从山香圆叶中提取获得的，所述提取方法如下取 山香园叶lOOOOOg，加12倍量70%乙醇回流提取1. 5小时，滤过，滤渣再加10倍量70%乙醇 回流提取1. 5小时，滤过，合并两次提取液，回收乙醇，水溶液通过已处理好的DlOl大孔树 脂柱，分别用水、10%乙醇、45%乙醇、1 %氢氧化钠溶液洗脱，收集45%乙醇洗脱部分，减压 浓缩，干燥，得30%以上女贞苷、金丝桃苷的混合总苷，经硅胶柱层析、S^hadex LH-20柱层 析分离，分别合并女贞苷、金丝桃苷流份，结晶，得到女贞苷(320g，纯度98.8% )和金丝桃 苷(65g，纯度98.6% )纯品，经分别与女贞苷、金丝桃苷标准品的UV、IR, ESI-MS^iH-NMR, 13C-NMR比较，确定了上述二个化合物的结构。另外，本发明提供的女贞苷、金丝桃苷也可以分别提取获得，如以下列举的实施 例。实施例2取女贞子1000g，W 12倍量70%乙醇回流提取1. 5小时，滤过，滤渣再加10倍 量70%乙醇回流提取1. 5小时，滤过，合并两次提取液，回收乙醇，水溶液通过已处理好的 DlOl大孔树脂柱，分别用水、10 %乙醇、45 %乙醇、1 %氢氧化钠溶液洗脱，收集45%乙醇洗 脱部分，减压浓缩，干燥，得30%以上女贞苷的混合总苷，经硅胶柱层析、S^hadex LH-20柱 层析分离，合并女贞苷流份，结晶，得到女贞苷(18. 5g，纯度98.7% )纯品，经分别与女贞 苷标准品的UV、IR、ESI-MS^H-WRJ3C-WR比较，确定了女贞苷的结构。实施例3取贯叶金丝桃lOOOg，加12倍量70%乙醇回流提取1. 5小时，滤过，滤渣再加10倍量70%乙醇回流提取1. 5小时，滤过，合并两次提取液，回收乙醇，水溶液通过已处理好的 D101大孔树脂柱，分别用水、10 %乙醇、45 %乙醇、1 %氢氧化钠溶液洗脱，收集45 %乙醇洗 脱部分，减压浓缩，干燥，得30%以上金丝桃苷的混合总苷，经硅胶柱层析、S^hadex LH-20 柱层析分离，合并金丝桃苷流份，结晶，得到金丝桃苷(8. 5g，纯度98. 6% )纯品，经分别与 金丝桃苷标准品的UV、IR, ESI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR比较，确定了金丝桃苷的结构。实施例4取女贞子lOOOg，加10倍量65%乙醇回流提取2小时，滤过，滤渣再加8倍量65% 乙醇回流提取1. 5小时，滤过，合并两次提取液，回收乙醇，水溶液通过已处理好的DlOl大 孔树脂柱，分别用水、8 %乙醇、40 %乙醇、1 %氢氧化钠溶液洗脱，收集40 %乙醇洗脱部分， 减压浓缩，干燥，得30%以上女贞苷的混合总苷，经硅胶柱层析、Sephadex LH-20柱层析分 离，合并女贞苷流份，结晶，得到女贞苷(19. 2g，纯度98.6% )纯品，经分别与女贞苷标准 品的uv、IR、ESI-MSJH-WRJ3C-WR比较，确定了女贞苷的结构。实施例5取贯叶金丝桃lOOOg，加15倍量60%乙醇回流提取2小时，滤过，滤渣再加9倍量 60%乙醇回流提取2小时，滤过，合并两次提取液，回收乙醇，水溶液通过已处理好的DlOl 大孔树脂柱，分别用水、8%乙醇、40%乙醇、氢氧化钠溶液洗脱，收集40%乙醇洗脱部 分，减压浓缩，干燥，得30%以上金丝桃苷的混合总苷，经硅胶柱层析、S^hadex LH-20柱层 析分离，合并金丝桃苷流份，结晶，得到金丝桃苷(9. 2g，纯度98. 5% )纯品，经分别与金丝 桃苷标准品的UV、IR, ESI-MS^iH-NMR, 13C-NMR比较，确定了金丝桃苷的结构。实施例6按实施例1的提取方法将女贞苷(14g)与金丝桃苷(6g)以7 3的比例混合，搅 拌、研磨、混合均勻后得女贞苷、金丝桃苷组合物。实施例7按实施例1的提取方法，将提取的女贞苷(IOg)与金丝桃苷(IOg)以5 5的比 例混合，搅拌、研磨、混合均勻后得女贞苷、金丝桃苷组合物。实施例8按实施例1的提取方法，将提取的女贞苷(6g)与金丝桃苷(14g)以3 7的比例 混合，搅拌、研磨、混合均勻后得女贞苷、金丝桃苷组合物。实施例9按实施例1的提取方法，将提取的女贞苷(8g)与金丝桃苷(12g)以4 6的比例 混合，搅拌、研磨、混合均勻后得女贞苷、金丝桃苷组合物。实施例10按实施例1的提取方法，将提取的女贞苷(12g)与金丝桃苷(8g)以6 4的比例 混合，搅拌、研磨、混合均勻后得女贞苷、金丝桃苷组合物。下面结合表1给出本发明女贞苷与金丝桃苷质量百分比的一些优选实施例，但本 发明二者的组成成份的含量不局限于该表中所列数值，对于本领域的技术人员来说，完全 可以在表中所列数值范围的基础上进行合理概括和推理。表1 女贞苷、金丝桃苷占组合物 重量百分比(％ ) 实验数据1 女贞苷、金丝桃苷组合物对神经氨酸酶活性的抑制作用取实施例6制备方法所获得的女贞苷、金丝桃苷组合物，加适量水使溶解，应用神 经氨酸酶抑制剂鉴定试剂盒测定女贞苷、金丝桃苷组合物抑制神经氨酸酶(Ni)的效价见 表2。(1).标准曲线准备a.在96孔荧光酶标板内每孔加入70 μ 1神经氨酸酶检测缓 冲液；b.每孔再分别加入0、1、2、5、7. 5、10μ 1 H5m神经氨酸酶；c.每孔再加入0 20 μ 1 Milli-Q 水。(2).样品检测的准备a.在96孔荧光酶标板内每孔加入70 μ 1神经氨酸酶检测 缓冲液；b.每孔再加入10 μ 1 Η5Ν1神经氨酸酶；C.每孔再加入0 10 μ 1女贞苷、金丝桃 苷组合物样品；d.每孔再加入0 10 μ 1 Milli-Q水。(3).检测步骤a.振动混勻约Imin;b. 37°C孵育2min使抑制剂和H5W神经氨酸酶充分相互作用，做标准曲线的样品 也一起孵育；c.每孔加入10 μ 1神经氨酸酶荧光底物；d.再振动混勻约Imin ；e. 37°C孵育20 30min后进行荧光测定。激发波长为360nm，发射波长为440nm。(4).根据标准曲线计算出样品对于H5W神经氨酸酶的抑制百分比，以及做浓度 曲线后计算出女贞苷、金丝桃苷组合物对于H5m神经氨酸酶的IC50。女贞苷、金丝桃苷组 合物达到对神经氨酸酶的抑制率IC50为0. 338g/L。见表2。表2.女贞苷、金丝桃苷组合物抑制神经氨酸酶的活性化合物检测靶酶靶酶底物 化合物浓度酶抑制率(效价)
女贞苷、神经氨酸 3.38g/L79.6%金丝桃神经氨酸 根据上述实验结果可以清楚地看到(1).女贞苷、金丝桃苷组合物能够提取出有效的抑制神经氨酸酶成分；(2).女贞苷、金丝桃苷组合物随着使用剂量大小变化，其抑制神经氨酸酶活性的 能力，即神经氨酸酶抑制率的高低也相应发生变化，并且成正相关；(3).由上述实验可见，女贞苷、金丝桃苷组合物能够通过抑制流感病毒表面神经 氨酸酶，进而抑制流感病毒进入细胞里面、抑制已经进入细胞里面的流感病毒复制、增殖， 从而减少了流感病毒对细胞的感染、生长，以及预防和治疗流感及其并发症。医学和药学研究人员无法预先在不做抑制流感病毒感染、复制，或抑制神经氨酸 酶的实验的前提下，预先得知女贞苷、金丝桃苷组合物具有预防和治疗流感病毒性感冒的 良好效果。实验数据2 女贞苷、金丝桃苷组合物对流感病毒感染鸡胚的抑制作用取实施例6制备方法所获得的女贞苷、金丝桃苷组合物，应用流感病毒亚甲型鼠 肺适应株(FMl) (HlNl)鉴定女贞苷、金丝桃苷组合物抑制FMl流感病毒在鸡胚中复制和抑 制的能力。(1).将FMl流感病毒液接种于IOd龄无特定病原体鸡胚尿囊腔内，每胚0.2ml， 37°C孵育72h，观察并计算半数鸡胚感染量(EID50)。(2).女贞苷、金丝桃苷组合物对鸡胚 的毒性作用采用，无菌生理盐水对女贞苷、金丝桃苷组合物作系列稀释后接种于IOd龄无 特定病原体鸡胚尿囊腔内，每胚0. 2ml，每个浓度接种6胚，37°C孵育，观察鸡胚生长发育情 况，以鸡胚可存活96h的最大浓度作为药物的TD。(3).女贞苷、金丝桃苷组合物在鸡胚中 对流感病毒的抑制作用采用，0. Iml的流感病毒液和不同稀释度的女贞苷、金丝桃苷组合物 混合，37°C作用2h，接种于IOd龄无特定病原体鸡胚尿囊腔，每组接种6胚，37°C孵育72h。 病毒攻击量为50EID50，同时设病毒对照、无菌生理盐水正常对照，计算女贞苷、金丝桃苷组 合物对病毒抑制作用的半数有效剂量(ED50)。(1).FM1流感病毒对鸡胚的毒力经Reed-Muench法计算，其EID50为10_5_°7。(2). 女贞苷、金丝桃苷组合物接种于鸡胚后，其生长发育与正常对照组基本一致。96h鸡胚均存 活。鸡胚给予女贞苷、金丝桃苷组合物原液未见鸡胚死亡，所以可认为TDO为4. 6g/L。(3). 女贞苷、金丝桃苷组合物在鸡胚中对流感病毒的抑制作用见表3。表3.女贞苷、金丝桃苷组合物对流感病毒感染鸡胚的抑制作用
10 与病毒对照组比较*P < 0. 05由表3可知，女贞苷、金丝桃苷组合物在0. 2875 2. 3g/L对流感病毒有显著的抑 制作用(P < 0. 05)，ED50 为 0. 38g士0. 16mg/ml, TI 为 21. 84士 3. 91。实验数据3 女贞苷、金丝桃苷组合物对FMl流感病毒影响取实施例6制备方法所获得的女贞苷、金丝桃苷组合物，应用流感病毒亚甲型鼠 肺适应株(FMl) (HlNl)鉴定女贞苷、金丝桃苷组合物抑制FMl流感病毒毒力的能力。(1). FMl对狗肾传代细胞(MDCK)的毒力测定采用细胞半数感染量(TCID50)微量法。(2).女贞 苷、金丝桃苷组合物对MDCK细胞的毒性测定采用无血清的DMEM对女贞苷、金丝桃苷组合物 作系列稀释后接种于已形成单层的MDCK细胞孔中，每孔100 μ 1，每个稀释度重复4个孔，同 时设正常细胞对照。将培养板置37°C、5% CO2培养箱内培养，每日观察细胞病变(CPE)，连 续观察3d，以“+ ++++”记录结果，按Reed-Muench法计算药物半数中毒浓度(TD50)和最 大无毒浓度(TDO)。(3).女贞苷、金丝桃苷组合物抑制FMl流感病毒作用测定MDCK细胞 5X 105/ml，每孔100 μ 1，分别于96孔板中，37°C、5% C02培养箱内培养，次日吸去孔中培养 液，加入100TCID50流感病毒液，每孔100μ 1，37°C吸附Ih后吸去上清液。用磷酸盐缓冲 液(PBS)洗2次，以药物的TDO为第1孔，再用无血清的DMEM液对女贞苷、金丝桃苷组合物 作系列稀释，分别加入上述已感染病毒的细胞中，同时设病毒对照和正常对照组，37°C、5% CO2温箱内培养，每日观察流感病毒产生的MDCK细胞病变特征，即单层细胞变性变圆等，连 续3d，计算出药物的50%抑制病变浓度(IC50)及治疗指数(Tl)。TI的计算TI = TD50/ IC50，TI值越大，表明药物的安全范围越大。以Kruskal-Walis和Mann-Whitney检验法比 较试验组与病毒对照组细胞病变的差异，对药物剂量和对病毒感染细胞避免发生细胞病变 (CPE)的抑制率进行相关性分析，判断是否存在量效反应关系。(1). FMl流感病毒对MDCK细胞的毒力经Reed-Muench法计算，其TCID50为10_4 81。 (2).女贞苷、金丝桃苷组合物MDCK细胞的TDO分别为1.2g士0. llg/L。(3).将女贞苷、金 丝桃苷组合物作系列稀释后，对100TCID50流感病毒进行抑制试验，计算药物的半数有效 量IC50及TI值大小，结果见表4。表4.女贞苷、金丝桃苷组合物对FMl流感病毒的IC5tl (g/L)及TI(x 士 s)
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苷组合物由表4可知，女贞苷、金丝桃苷组合物的IC50低，TI高。女贞苷、金丝桃苷组合物 抑制FMl流感病毒致细胞病变的作用均随着药物剂量的增加而增强。对药物剂量和药物对 CPE的抑制率进行的相关性分析表明，女贞苷、金丝桃苷组合物的剂量与药物对CPE抑制率 之间呈明显的正相关。实验数据4:女贞苷、金丝桃苷组合物对小鼠体内感染流感病毒FMl株的脾指数和 肺指数的影响取实施例6制备方法所获得的女贞苷、金丝桃苷组合物，应用流感病毒亚甲型鼠 肺适应株(FMl) (HlNl)鉴定女贞苷、金丝桃苷组合物对小鼠体内感染流感病毒FMl株的 死亡保护作用。(1).流感病毒FMl株病毒做10倍倍比稀释后分别接种每组10只BALB/ C小鼠，雌雄各半。乙醚轻度麻醉后，每组分别给与不同稀释度的病毒，每只小鼠滴鼻接种 20 μ 1。观察IOd的小鼠死亡情况，按Reed-Muench法计算LD50为10_136。故确定实验所用 的造模浓度为10LD50。(2).女贞苷、金丝桃苷组合物对小鼠体内感染流感病毒FMl株的死 亡保护作用正常对照组、流感病毒FMl株病毒对照组、女贞苷、金丝桃苷组合物5. Omg/ml、 10. Omg/ml,20. Omg/ml,40. Omg/ml剂量组等分别灌胃，灌胃容量均为0. 4ml/只。3d后，除 正常对照组外各组在乙醚轻度麻醉下用10LD50流感病毒FMl株滴鼻感染小鼠20 μ 1/只。 同时正常对照组给予同体积的生理盐水。给药的4组继续给药，正常对照组和流感病毒FMl 株病毒对照组给生理盐水8天，剂量同上。逐日观察动物发病和记录死亡数，共观察14天， 计算死亡率(死亡率=每组死亡数/每组小鼠总数X 100%)，结果见表5。(3).女贞苷、 金丝桃苷组合物对小鼠体内感染流感病毒FMl株肺指数的影响正常对照组、流感病毒FMl 株病毒对照组、女贞苷、金丝桃苷组合物20. Omg/ml,40. Omg/ml,80. Omg/ml,160. Omg/ml剂 量组等分别灌胃，灌胃容量均为0. 4ml/只。3天后，除正常对照组外各组在乙醚轻度麻醉下 用1. 0LD50流感病毒FMl株滴鼻感染小鼠20 μ 1/只。同时正常对照组给予同体积的生理盐 水。给药的4组继续给药，正常对照组和流感病毒FMl株病毒对照组给生理盐水8天，剂量 同上。于病毒感染后第8天处死小鼠，称体重，取肺称肺重，计算肺指数(肺指数=肺质量 /体质量X100% )；此外，取脾称脾重，计算脾指数(脾指数=脾质量/体质量X 100% )， 结果见表6。表5.女贞苷、金丝桃苷组合物对小鼠体内感染流感病毒FMl株的死亡保护结果
12 注※※P < 0. OlVS流感病毒模型组表6.女贞苷、金丝桃苷组合物对小鼠体内感染流感病毒FMl株的脾指数和肺指数 的影响

注:#P < 0. 05VS正常对照组 ※※？ < 0. 001VS流感病毒模型组 ※口 < 0. 05VS流感病毒模型组(1).由表5可知，女贞苷、金丝桃苷组合物在1. 15 2. 3g/L对流感病毒感染小鼠 有显著的保护作用(ρ <0.01)。(2).由表6可知，女贞苷、金丝桃苷组合物在2. 3g/L对流感病毒感染小鼠的肺指数抑制率有显著的作用(P < 0.01)。实验数据5 女贞苷、金丝桃苷组合物对肾功能损伤的影响1) SD大鼠，200 240g，上海西普尔-必凯实验动物责任有限公司，动物合格证号 SCXK(沪)2003-00022)试剂及药物腺嘌呤，腺嘌呤，(含量> 98%，为进口分装，中国上海，批号 20010520)，实施例6制备方法所获得的女贞苷、金丝桃苷组合物；3)试验方法雄性SD大鼠，体重220g左右，先用普通饲料喂养10天正常生长后， 按体重随机分为正常对照组、给药实验组和造模对照组，每组13 15只。给药实验组和造 模对照组用腺嘌呤灌胃制作慢性肾功能衰竭(CRF)模型，以腺嘌呤320mg/(kg*d)灌胃，用 蒸馏水制成混悬液约2ml/只，共20天；20天后给药，给药实验组以女贞苷、金丝桃苷组合 物3. 4g/(kg.d)灌胃，女贞苷、金丝桃苷组合物以蒸馏水制成混悬溶液(0. 44g/ml)，每次 约2ml/只，分次灌胃，正常对照组和造模对照组以等体积水灌胃，给药35天后将大鼠用乙 醚麻醉，鼠尾动脉采血观察各项指标。4)结果表7.女贞苷、金丝桃苷组合物对CRF大鼠肾功能的影响 注经T检验，女贞苷、金丝桃苷组合物实验组与造模对照组比较“*”表示P < 0. 05，“**” 表示 P < 0.01本实验用腺瞟呤灌胃建立大鼠CRF模型后，造模对照组大鼠精神萎靡，体重明显 降低，血清BuruSer明显升高，Hb明显下降，Ret明显升高，表明大鼠肾功能受损，经给予女 贞苷、金丝桃苷组合物后大鼠与正常对照组差异不显著，而与模型组比较差异十分显著，故 女贞苷、金丝桃苷组合物对肾脏无毒性作用。
权利要求
女贞苷、金丝桃苷组合物，所述女贞苷的分子式C33H40O18，分子量724.2，所述女贞苷的结构式如下所述金丝桃苷的分子式C21H20O12，分子量464.38，所述金丝桃苷的结构式如下其中所述的女贞苷、金丝桃苷组合物是由下列重量配比制成的女贞苷80％～20％、金丝桃苷20％～80％。FSA00000229910500011.tif,FSA00000229910500012.tif
2.根据权利要求1所述的女贞苷、金丝桃苷组合物，其中所述的女贞苷、金丝桃苷组合 物是由下列重量配比制成的女贞苷75% 25%、金丝桃苷25% 75%。
3.根据权利要求2所述的女贞苷、金丝桃苷组合物，其中所述的女贞苷、金丝桃苷组合 物是由下列重量配比制成的女贞苷60% 40%、金丝桃苷40% 60%。
4.根据权利要求3所述的女贞苷、金丝桃苷组合物，其中所述的女贞苷、金丝桃苷组合 物是由下列重量配比制成的女贞苷55 % 45 %、金丝桃苷45 % 55 %。
5.根据权利要求4所述的女贞苷、金丝桃苷组合物，其中所述的女贞苷、金丝桃苷组合 物是由下列重量配比制成的女贞苷50 %、金丝桃苷50 %。
6.权利要求1、2、3、4或5所述的组合物用于制备预防和治疗流感及其并发症疾病的药 物的用途。
7.如权利要求6的用途，其特征在于所述的组合物用于抑制流感病毒。
8.如权利要求7的用途，其特征在于所述的组合物用于抑制流感病毒FM1。
9.如权利要求6的用途，其特征在于所述的组合物用于抑制神经氨酸酶。
10.如权利要求6的用途，其并发症是指肾功能衰竭。
11.如权利要求6的用途，其并发症是指脾损伤或/和肺损伤。
12.—种女贞苷、金丝桃苷组合物制剂，其中该制剂以权利要求1 5任一项所述的女 贞苷、金丝桃苷组合物为主要活性成分。
13.权利要求1、2、3、4或5所述的女贞苷、金丝桃苷组合物的提取方法，其中所述的女 贞苷、金丝桃苷是从山香圆叶中提取获得的，所述提取方法如下取山香圆叶，加5 15倍 量的30% 90%乙醇回流提取1 3次，每次回流提取1 3小时，滤过；合并滤液，回收 乙醇，水溶液通过大孔树脂柱洗脱，收集洗脱部分，减压浓缩，干燥，得女贞苷、金丝桃苷的 混合总苷，经分离得到女贞苷、金丝桃苷纯品。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述的女贞苷、金丝桃苷采用如下的提取方法获 得取山香圆叶，加12倍量70%乙醇回流提取1. 5小时，滤过，滤渣再加10倍量70%乙醇 回流提取1. 5小时，滤过，合并两次提取液，回收乙醇，水溶液通过大孔树脂柱洗脱，收集洗 脱部分，减压浓缩，干燥。
15.如权利要求13或14所述的方法，其中水溶液通过已处理好的大孔树脂柱，分别用 水、5 % 10 %乙醇、30 % 55 %乙醇、1 %氢氧化钠溶液洗脱，收集30 % 55 %乙醇洗脱部 分，减压浓缩，干燥，得女贞苷、金丝桃苷的混合总苷，经硅胶柱层析、Sephadex LH-20柱层 析分离，分别合并女贞苷、金丝桃苷流份，结晶，得到女贞苷纯品和金丝桃苷的纯品。
全文摘要
本发明涉及一种女贞苷、金丝桃苷组合物，其是通过按女贞苷20％～80％、金丝桃苷80％～20％的重量配比制成的组合物，该组合物可作神经氨酸酶抑制剂用在预防和治疗流感，制成药学上可以接受的剂型。
文档编号A61P11/00GK101890037SQ20101025375
公开日2010年11月24日 申请日期2010年8月16日 优先权日2010年8月16日
发明者刘地发, 叶劲英, 吕武清, 李志勇, 杨小玲, 王燕平, 程帆, 蔡永红, 谢宁 申请人:江西山香药业有限公司;江西青峰药物研究有限公司