专利名称：女贞苷的提取方法及其制备药物用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种女贞苷的提取方法及其制备药物用途。
背景技术：
目前流行性感冒病毒日益严重，并且流行性感冒病毒与呼吸道疾病及引起的全身 性疾病密切相关，我国是流感高发国家之一，不但人口众多，而且生活习惯也有利于流感病 毒的转播，每年人平均发病次数达到0. 3 0. 7次不等，重点人群达到2 4次。流感对人 类存在严重威胁，尤其是新发品种流感病毒，其不但引起继发性其它微生物感染，而且会直 接导致器官破坏和变态反应致人死亡。但目前并没有有效的治疗流行性感冒病毒及其疾病 (流感)的方法和治疗手段，如针对临床症状进行炎症反应治疗，治标不治本。目前最常见 的预防和治疗流行性感冒病毒的方法是使用流感病毒疫苗接种，非特异性抗病毒中药或西 药磷酸奥司他韦(达菲)_神经氨酸酶抑制剂。然而流感病毒疫苗预防接种弊端在于接种 人群有选择性，不是人人可以接种。此外，流感病毒疫苗保护率不高，保护时间也较短(3 6个月)。目前大多数非特异性抗病毒中药虽然宣称有抗病毒作用，但是并非针对流感病 毒，且抗病毒作用机理不清楚。在我们以往研究的许多种治疗外感风寒，西医所认为的感冒 的中药组方并没有直接抗流感病毒的作用。简单的说，不是所有的治疗感冒的中药组方都 有明确的抑制流感病毒的作用。西药“磷酸奥司他韦(达菲，(3R，4R，5S)-4-乙酰胺-5-氨 基-3(1-丙氧乙酯)-1_环己烯-1羧酸乙酯磷酸盐)”是神经氨酸酶抑制剂，对流感病毒进 入细胞有特异性抑制作用，但是不仅价格昂贵，而且有一些患者服用后出现呕吐、恶心、失 眠、头痛、腹痛、腹泻、头晕、疲劳、鼻塞、咽痛和咳嗽等副反应。达菲是在体内被位于肝脏和 肠道的酯酶转化为活性代谢产物而起着抑制神经氨酸酶作用，如果患者肝脏和肠道器官功 能不正常也将影响其药效。此外，肾功能不全患者也要慎用。传统的中医学认山香圆叶具有清热解毒，利咽消肿，活血止痛。用于乳蛾喉痹，咽 喉肿痛，疮疡肿毒，跌扑伤痛。女贞子具有滋补肝肾，明目乌发，主要用于眩晕耳鸣，腰膝酸 软，须发早白，目暗不明；近年来女贞子多用于治疗慢性气管炎、肝炎、高血脂症、糖尿病、更 年期综合征、不孕症、动脉粥样硬化等。女贞苷是山香圆叶和女贞子主要成分之一，但未发 现山香圆和女贞子及其所含的女贞苷其具有抑制流感病毒感染、复制的作用，也未发现其 具有抑制神经氨酸酶的作用。
发明内容
本发明的目的是提供女贞苷，其可以抑制流感病毒神经氨酸酶水解细胞表面唾液 酸，导致流感病毒不能与细胞表面受体结合而进入细胞内，以及减少流感病毒在细胞内的 产生，从而有效地针对性地抑制流感病毒复制，更重要地是本发明提供一种女贞苷可以克 服现有药物的副反应弊端。本发明提供的所述女贞苷的分子式=C33H4tlO18,分子量724. 2，所述女贞苷的结构 式如下
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所述女贞苷采用如下的提取方法获得取山香圆叶或女贞子，加5 15倍量的 30% 90%乙醇回流提取1 3次，每次回流提取1 3小时，滤过；合并滤液，回收乙醇， 水溶液通过大孔树脂柱洗脱，收集洗脱部分，减压浓缩，干燥，得女贞苷的混合总苷，经分 离，合并女贞苷流份，结晶，得到女贞苷纯品。优选的，其中水溶液通过大孔树脂柱，分别用水、5% 10%乙醇、30% 55%乙 醇、0. 8 1. 2%氢氧化钠溶液洗脱，收集30% 55%乙醇洗脱部分，减压浓缩，干燥。优选的，其中所述女贞苷采用如下的提取方法获得取山香圆叶，加12倍量70% 乙醇回流提取1. 5小时，滤过，滤渣再加10倍量70%乙醇回流提取1. 5小时，滤过，合并两 次提取液，回收乙醇，水溶液通过大孔树脂柱，分别用水、10%乙醇、45%乙醇、氢氧化钠 溶液洗脱，收集45%乙醇洗脱部分，减压浓缩，干燥。优选的，其中所述女贞苷采用如下的提取方法获得取山香圆叶，加10倍量65% 乙醇回流提取2小时，滤过，滤渣再加8倍量65%乙醇回流提取1. 5小时，滤过，合并两次提 取液，回收乙醇，水溶液通过大孔树脂柱，分别用水、8%乙醇、40%乙醇、1. 氢氧化钠溶 液洗脱，收集40%乙醇洗脱部分，减压浓缩，干燥。优选的，其中所述女贞苷采用如下的提取方法获得取山香圆叶，加15倍量60% 乙醇回流提取2小时，滤过，滤渣再加12倍量60%乙醇回流提取2小时，滤过，合并两次提 取液，回收乙醇，水溶液通过大孔树脂柱，分别用水、6%乙醇、35%乙醇、1.2%氢氧化钠溶 液洗脱，收集35%乙醇洗脱部分，减压浓缩，干燥。优选的，其中所述女贞苷采用如下的提取方法获得取山香圆叶，加9倍量65%乙 醇回流提取2. 5小时，滤过，滤渣再加8倍量65%乙醇回流提取2小时，滤过，合并两次提取 液，回收乙醇，水溶液通过大孔树脂柱，分别用水、5%乙醇、40%乙醇、0.9%氢氧化钠溶液 洗脱，收集40%乙醇洗脱部分，减压浓缩，干燥。优选的，其中所述女贞苷采用如下的提取方法获得取女贞子，加12倍量70%乙 醇回流提取1. 5小时，滤过，滤渣再加10倍量70%乙醇回流提取1. 5小时，滤过，合并两次 提取液，回收乙醇，水溶液通过大孔树脂柱，分别用水、10%乙醇、45%乙醇、1 %氢氧化钠溶 液洗脱，收集45%乙醇洗脱部分，减压浓缩，干燥。优选的，其中所述女贞苷采用如下的提取方法获得取女贞子，加10倍量65%乙 醇回流提取2小时，滤过，滤渣再加8倍量65%乙醇回流提取1. 5小时，滤过，合并两次提取 液，回收乙醇，水溶液通过大孔树脂柱，分别用水、8%乙醇、40%乙醇、0.8%氢氧化钠溶液洗脱，收集40%乙醇洗脱部分，减压浓缩，干燥。优选的，其中所述女贞苷采用如下的提取方法获得取女贞子，加15倍量60%乙 醇回流提取2小时，滤过，滤渣再加12倍量60%乙醇回流提取2小时，滤过，合并两次提取 液，回收乙醇，水溶液通过大孔树脂柱，分别用水、6%乙醇、35%乙醇、1.2%氢氧化钠溶液 洗脱，收集35%乙醇洗脱部分，减压浓缩，干燥。优选的，其中所述女贞苷采用如下的提取方法获得取女贞子，加9倍量65%乙醇 回流提取2. 5小时，滤过，滤渣再加8倍量65%乙醇回流提取2小时，滤过，合并两次提取 液，回收乙醇，水溶液通过大孔树脂柱，分别用水、5%乙醇、40%乙醇、1 %氢氧化钠溶液洗 脱，收集40%乙醇洗脱部分，减压浓缩，干燥。优选的，其中水溶液通过已处理好的DlOl大孔树脂柱洗脱，混合总苷经硅胶柱层 析、Sephadex LH-20柱层析分离，合并女贞苷流份，结晶，得到女贞苷纯品。本发明还提供了女贞苷用于制备预防和治疗流感及其并发症疾病的药物的用途。优选的，女贞苷用于抑制流感病毒。优选的，女贞苷用于抑制流感病毒FM1。
优选的，女贞苷用于抑制神经氨酸酶。优选的，其并发症是指肾功能衰竭。优选的，其并发症是指脾损伤或/和肺损伤。本发明所述的女贞苷可以是从含女贞苷的各种药材中如山香圆叶、女贞子中提取 获得女贞苷粗品或女贞苷单体化合物。最后，本发明还提供了一种女贞苷制剂，该制剂以本发明上述的女贞苷为主要活 性成分。实验数据证明，本发明的女贞苷是有效的抑制神经氨酸酶成分，女贞苷随着使用 剂量大小变化，其抑制神经氨酸酶活性的能力，即神经氨酸酶抑制率的高低也相应发生变 化，并且成正相关，女贞苷能够通过抑制流感病毒表面神经氨酸酶，进而抑制流感病毒进入 细胞里面、抑制已经进入细胞里面的流感病毒复制、增殖，从而减少了流感病毒对细胞的感 染、生长，以及预防和治疗流感及其并发症，还可以抑制流感病毒神经氨酸酶水解细胞表面 唾液酸，导致流感病毒不能与细胞表面受体结合而进入细胞内，以及减少流感病毒在细胞 内的产生，更重要地是本发明提供一种女贞苷可以克服现有药物的副反应弊端。而医学和药学研究人员无法预先在不做抑制流感病毒感染、复制，或抑制神经氨 酸酶的实验的前提下，预先得知女贞苷具有预防和治疗流感病毒性感冒的良好效果。综上所述，本发明提供的女贞苷及其用途带来显著的技术效果。
具体实施例方式实施例1取山香圆叶1000g，W 12倍量70%乙醇回流提取1. 5小时，滤过，滤渣再加10倍 量70%乙醇回流提取1. 5小时，滤过，合并两次提取液，回收乙醇，水溶液通过已处理好的 DlOl大孔树脂柱，分别用水、10%乙醇、45%乙醇、1 %氢氧化钠溶液洗脱，收集45 %乙醇洗 脱部分，减压浓缩，干燥，得30%以上女贞苷的混合总苷，经硅胶柱层析、S^hadex LH-20柱 层析分离，合并女贞苷流份，结晶，得到女贞苷(3. 5g，纯度98. 7% )纯品，经分别与女贞苷
6标准品的UV、IR、ESI-MS、1H-WK13C-WR比较，确定了女贞苷的结构。实施例2取山香圆叶lOOOg，加10倍量65%乙醇回流提取2小时，滤过，滤渣再加8倍 量65%乙醇回流提取1. 5小时，滤过，合并两次提取液，回收乙醇，水溶液通过已处理好的 DlOl大孔树脂柱，分别用水、8%乙醇、40%乙醇、1. 氢氧化钠溶液洗脱，收集40%乙醇 洗脱部分，减压浓缩，干燥，得30%以上女贞苷的混合总苷，经硅胶柱层析、S^hadex LH-20 柱层析分离，合并女贞苷流份，结晶，得到女贞苷(3. 2g，纯度98.6%)纯品，经分别与女贞 苷标准品的UV、IR、ESI-MS^H-WRJ3C-WR比较，确定了女贞苷的结构。实施例3取山香圆叶lOOOg，加15倍量60%乙醇回流提取2小时，滤过，滤渣再加12倍量 60 %乙醇回流提取2小时，滤过，合并两次提取液，回收乙醇，水溶液通过已处理好的DlOl 大孔树脂柱，分别用水、6%乙醇、35%乙醇、1. 2%氢氧化钠溶液洗脱，收集35%乙醇洗脱部 分，减压浓缩，干燥，得30%以上女贞苷的混合总苷，经硅胶柱层析、S^hadex LH-20柱层析 分离，合并女贞苷流份，结晶，得到女贞苷(2. 9g，纯度98. 8%)纯品，经分别与女贞苷标准 品的uv、IR、ESI-MSJH-WRJ3C-WR比较，确定了女贞苷的结构。实施例4取山香圆叶lOOOg，加9倍量65%乙醇回流提取2. 5小时，滤过，滤渣再加8倍量 65%乙醇回流提取2小时，滤过，合并两次提取液，回收乙醇，水溶液通过已处理好的DlOl 大孔树脂柱，分别用水、5%乙醇、40%乙醇、0.9%氢氧化钠溶液洗脱，收集40%乙醇洗脱部 分，减压浓缩，干燥，得30%以上女贞苷的混合总苷，经硅胶柱层析、S^hadex LH-20柱层析 分离，合并女贞苷流份，结晶，得到女贞苷(2. 7g，纯度98. 7%)纯品，经分别与女贞苷标准 品的uv、IR、ESI-MSJH-WRJ3C-WR比较，确定了女贞苷的结构。实施例5取女贞子lOOOg，加12倍量70%乙醇回流提取1. 5小时，滤过，滤渣再加10倍 量70%乙醇回流提取1. 5小时，滤过，合并两次提取液，回收乙醇，水溶液通过已处理好的 DlOl大孔树脂柱，分别用水、10 %乙醇、45 %乙醇、1 %氢氧化钠溶液洗脱，收集45%乙醇洗 脱部分，减压浓缩，干燥，得30%以上女贞苷的混合总苷，经硅胶柱层析、S^hadex LH-20柱 层析分离，合并女贞苷流份，结晶，得到女贞苷(18. 5g，纯度98.7% )纯品，经分别与女贞 苷标准品的UV、IR、ESI-MS^H-WRJ3C-WR比较，确定了女贞苷的结构。实施例6取女贞子lOOOg，加10倍量65%乙醇回流提取2小时，滤过，滤渣再加8倍量65% 乙醇回流提取1. 5小时，滤过，合并两次提取液，回收乙醇，水溶液通过已处理好的DlOl大 孔树脂柱，分别用水、8 %乙醇、40 %乙醇、0. 8 %氢氧化钠溶液洗脱，收集40 %乙醇洗脱部 分，减压浓缩，干燥，得30%以上女贞苷的混合总苷，经硅胶柱层析、S^hadex LH-20柱层析 分离，合并女贞苷流份，结晶，得到女贞苷(19. 2g，纯度98.6%)纯品，经分别与女贞苷标 准品的uv、IR、ESI-MSJH-WRJ3C-WR比较，确定了女贞苷的结构。实施例7取女贞子lOOOg，加15倍量60%乙醇回流提取2小时，滤过，滤渣再加12倍量60% 乙醇回流提取2小时，滤过，合并两次提取液，回收乙醇，水溶液通过已处理好的DlOl大孔
7树脂柱，分别用水、6%乙醇、35%乙醇、1. 2%氢氧化钠溶液洗脱，收集35%乙醇洗脱部分， 减压浓缩，干燥，得30%以上女贞苷的混合总苷，经硅胶柱层析、Sephadex LH-20柱层析分 离，合并女贞苷流份，结晶，得到女贞苷(17.98，纯度98.8%)纯品，经分别与女贞苷标准 品的uv、IR、ESI-MSJH-WRJ3C-WR比较，确定了女贞苷的结构。实施例8取女贞子lOOOg，加9倍量65%乙醇回流提取2. 5小时，滤过，滤渣再加8倍量65% 乙醇回流提取2小时，滤过，合并两次提取液，回收乙醇，水溶液通过已处理好的DlOl大孔 树脂柱，分别用水、5 %乙醇、40%乙醇、1 %氢氧化钠溶液洗脱，收集40 %乙醇洗脱部分，减 压浓缩，干燥，得30%以上女贞苷的混合总苷，经硅胶柱层析、S^hadex LH-20柱层析分离， 合并女贞苷流份，结晶，得到女贞苷(16. 7g，纯度98. 7% )纯品，经分别与女贞苷标准品的 uv、ir、Esi-MsJh-WrJ3C-Wr比较，确定了女贞苷的结构。实验数据1 女贞苷对神经氨酸酶活性的抑制作用取实施例1制备方法所获得的女贞苷，加适量水使溶解，应用神经氨酸酶抑制剂 鉴定试剂盒测定女贞苷抑制神经氨酸酶(Ni)的效价见表1。(1).标准曲线准备a.在96孔荧光酶标板内每孔加入70 μ 1神经氨酸酶检测缓 冲液；b.每孔再分别加入0、1、2、5、7. 5、10μ 1 H5m神经氨酸酶；c.每孔再加入0 20 μ 1 Milli-Q 水。(2).样品检测的准备a.在96孔荧光酶标板内每孔加入70 μ 1神经氨酸酶检测 缓冲液；b.每孔再加入10 μ 1 Η5Ν1神经氨酸酶；C.每孔再加入0 10 μ 1女贞苷样品； d.每孔再加入0 10 μ 1 Milli-Q水。(3).检测步骤a.振动混勻约Imin ；b. 37°C孵育2min使抑制剂和H5W神经氨酸酶充分相互作用，做标准曲线的样品 也一起孵育；c.每孔加入10 μ 1神经氨酸酶荧光底物；d.再振动混勻约Imin ；e. 37°C孵育20 30min后进行荧光测定。激发波长为360nm，发射波长为440nm。(4).根据标准曲线计算出样品对于H5W神经氨酸酶的抑制百分比，以及做浓度 曲线后计算出女贞苷对于H5m神经氨酸酶的IC50。女贞苷达到对神经氨酸酶的抑制率 IC50 为 0. 33g/L。见表 1。表1.女贞苷抑制神经氨酸酶的活性
化合物检测靶酶靶酶底物 化合物浓度酶抑制率(效价)
神经氨酸3.30g/L83.6%神经氨酸n
女贞苷 酶荧光底0-33g/L50.0% 酶(Ni)
物0.033g/L30.7%根据上述实验结果可以清楚地看到(1).女贞苷能够提取出有效的抑制神经氨酸酶成分；
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(2).女贞苷随着使用剂量大小变化，其抑制神经氨酸酶活性的能力，即神经氨酸 酶抑制率的高低也相应发生变化，并且成正相关；(3).由上述实验可见，女贞苷能够通过抑制流感病毒表面神经氨酸酶，进而抑制 流感病毒进入细胞里面、抑制已经进入细胞里面的流感病毒复制、增殖，从而减少了流感病 毒对细胞的感染、生长，以及预防和治疗流感及其并发症。医学和药学研究人员无法预先在 不做抑制流感病毒感染、复制，或抑制神经氨酸酶的实验的前提下，预先得知女贞苷具有预 防和治疗流感病毒性感冒的良好效果。实验数据2 女贞苷对流感病毒感染鸡胚的抑制作用取实施例1制备方法所获得的女贞苷，应用流感病毒亚甲型鼠肺适应株(FMl) (HlNl)鉴定女贞苷抑制FMl流感病毒在鸡胚中复制和抑制的能力。(1).将FMl流感病毒 液接种于IOd龄无特定病原体鸡胚尿囊腔内，每胚0. 2ml，37°C孵育72h，观察并计算半数鸡 胚感染量(EID50)。(2).女贞苷对鸡胚的毒性作用采用，无菌生理盐水对女贞苷作系列稀 释后接种于IOd龄无特定病原体鸡胚尿囊腔内，每胚0. 2ml，每个浓度接种6胚，37°C孵育， 观察鸡胚生长发育情况，以鸡胚可存活96h的最大浓度作为药物的TD。(3).女贞苷在鸡胚 中对流感病毒的抑制作用采用，0. Iml的流感病毒液和不同稀释度的女贞苷混合，37°C作用 2h，接种于IOd龄无特定病原体鸡胚尿囊腔，每组接种6胚，37°C孵育72h。病毒攻击量为 50EID50，同时设病毒对照、无菌生理盐水正常对照，计算女贞苷对病毒抑制作用的半数有 效剂量(ED50)。(1). FMl流感病毒对鸡胚的毒力经Reed-Muench法计算，其EID50为10_5_°7。(2).女贞苷接种于鸡胚后，其生长发育与正常对照组基本一致。96h鸡胚均存活。 鸡胚给予女贞苷原液未见鸡胚死亡，所以可认为TDO为3. 2g/L。(3).女贞苷在鸡胚中对流 感病毒的抑制作用见表2。表2.女贞苷对流感病毒感染鸡胚的抑制作用 由表2可知，女贞苷在0. 4 1. 6g/L对流感病毒有显著的抑制作用(P < 0. 05)， ED50 为 0. 63g士0. 026g/L, TI 为 29. 68 士 2. 85。
实验数据3 女贞苷对FMl流感病毒影响取实施例1制备方法所获得的女贞苷，应用流感病毒亚甲型鼠肺适应株(FMl) (HlNl)鉴定女贞苷抑制FMl流感病毒毒力的能力。(1). FMl对狗肾传代细胞(MDCK)的毒 力测定采用细胞半数感染量(TCID50)微量法。(2).女贞苷对MDCK细胞的毒性测定采用无 血清的DMEM对女贞苷作系列稀释后接种于已形成单层的MDCK细胞孔中，每孔100 μ 1，每 个稀释度重复4个孔，同时设正常细胞对照。将培养板置37°C、5%C02培养箱内培养，每日 观察细胞病变(CPE)，连续观察3d，以“+ ++++”记录结果，按Reed-Muench法计算药物半 数中毒浓度(TD50)和最大无毒浓度(TDO)。(3).女贞苷抑制FMl流感病毒作用测定MDCK 细胞5X105/ml，每孔100μ 1，分别于96孔板中，37°C、5% C02培养箱内培养，次日吸去孔 中培养液，加入100TCID50流感病毒液，每孔100μ 1，37°C吸附Ih后吸去上清液。用磷酸盐 缓冲液(PBS)洗2次，以药物的TDO为第1孔，再用无血清的DMEM液对女贞苷作系列稀释， 分别加入上述已感染病毒的细胞中，同时设病毒对照和正常对照组，37°C、5% 0)2温箱内培 养，每日观察流感病毒产生的MDCK细胞病变特征，即单层细胞变性变圆等，连续3d，计算出 药物的50%抑制病变浓度(IC50)及治疗指数(Tl)。TI的计算TI = TD50/IC50, TI值越 大，表明药物的安全范围越大。以Kruskal-Walis和Marm-Whitney检验法比较试验组与病 毒对照组细胞病变的差异，对药物剂量和对病毒感染细胞避免发生细胞病变(CPE)的抑制 率进行相关性分析，判断是否存在量效反应关系。(1). FMl流感病毒对MDCK细胞的毒力经Reed-Muench法计算，其TCID50为10_4 81。 (2).女贞苷MDCK细胞的TDO分别为1.4g士0.09g/L。(3).将女贞苷作系列稀释后，对 100TCID50流感病毒进行抑制试验，计算药物的半数有效量IC50及TI值大小，结果见表3。表3.女贞苷对FMl流感病毒的IC5tl (g/L)及TI (χ士 s) 由表3可知，女贞苷的IC50低，TI高。女贞苷抑制FMl流感病毒致细胞病变的作 用均随着药物剂量的增加而增强。对药物剂量和药物对CPE的抑制率进行的相关性分析表 明，女贞苷的剂量与药物对CPE抑制率之间呈明显的正相关。实验数据4 女贞苷对小鼠体内感染流感病毒FMl株的脾指数和肺指数的影响取实施例1制备方法所获得的女贞苷，应用流感病毒亚甲型鼠肺适应株(FMl) (HlNl)鉴定女贞苷对小鼠体内感染流感病毒FMl株的死亡保护作用。(1).流感病毒FMl 株病毒做10倍倍比稀释后分别接种每组10只BALB/C小鼠，雌雄各半。乙醚轻度麻醉后， 每组分别给与不同稀释度的病毒，每只小鼠滴鼻接种20μ 1。观察IOd的小鼠死亡情况，按 Reed-Muench法计算LD50为ΙΟ—1·36。故确定实验所用的造模浓度为10LD50。(2).女贞苷对 小鼠体内感染流感病毒FMl株的死亡保护作用正常对照组、流感病毒FMl株病毒对照组、 女贞苷0. 25g/L、0. 5mg/L、l. 0g/L、2. 0g/L剂量组等分别灌胃，灌胃容量均为0. 4ml/只。3d 后，除正常对照组外各组在乙醚轻度麻醉下用10LD50流感病毒FMl株滴鼻感染小鼠20μ 1/ 只。同时正常对照组给予同体积的生理盐水。给药的4组继续给药，正常对照组和流感病毒FMl株病毒对照组给生理盐水8天，剂量同上。逐日观察动物发病和记录死亡数，共观察 14天，计算死亡率(死亡率=每组死亡数/每组小鼠总数X100%)，结果见表4。(3).女 贞苷对小鼠体内感染流感病毒FMl株肺指数的影响正常对照组、流感病毒FMl株病毒对照 组、女贞苷0. 25g/L、0. 5mg/L、l. 0g/L、2. Og/L剂量组等分别灌胃，灌胃容量均为0. 4ml/只。 3天后，除正常对照组外各组在乙醚轻度麻醉下用1. 0LD50流感病毒FMl株滴鼻感染小鼠 20 μ 1/只。同时正常对照组给予同体积的生理盐水。给药的4组继续给药，正常对照组和 流感病毒FMl株病毒对照组给生理盐水8天，剂量同上。于病毒感染后第8天处死小鼠，称 体重，取肺称肺重，计算肺指数(肺指数=肺质量/体质量χιοο%)；此外，取脾称脾重，计 算脾指数(脾指数=脾质量/体质量X 100%)，结果见表5。
表4.女贞苷对小鼠体内感染流感病毒FMl株的死亡保护结果 注※※P < 0. OlVS流感病毒模型组表5.女贞苷对小鼠体内感染流感病毒FMl株的脾指数和肺指数的影响 注:#Ρ < 0. 05VS正常对照组 注##Ρ < 0. OlVS正常对照组※※p < 0. 001VS流感病毒模型组 ※？ < 0. 05VS流感病毒模型组(1).由表4可知，女贞苷在1. 0 2. Og/L对流感病毒感染小鼠有显著的保护作用
(P < 0. 01)。(2).由表5可知，女贞苷在2. Og/L对流感病毒感染小鼠的肺指数抑制率有显著的 作用(P < 0.01)。实验数据5 女贞苷对肾功能损伤的影响1) SD大鼠，200 240g，上海西普尔-必凯实验动物责任有限公司，动物合格证号SCXK(沪)2003-00022)试剂及药物腺嘌呤，腺嘌呤，(含量> 98%，为进口分装，中国上海，批号 20010520)，实施例1制备方法所获得的女贞苷；3)试验方法雄性SD大鼠，体重220g左右，先用普通饲料喂养10天正常生长后， 按体重随机分为正常对照组、给药实验组和造模对照组，每组13 15只。给药实验组和造 模对照组用腺嘌呤灌胃制作慢性肾功能衰竭(CRF)模型，以腺嘌呤320mg/(kg*d)灌胃，用 蒸馏水制成混悬液约2ml/只，共20天；20天后给药，给药实验组以女贞苷4. Og/ (kg -d)灌 胃，女贞苷以蒸馏水制成混悬溶液(0. 5g/ml)，每次约2ml/只，分次灌胃，正常对照组和造 模对照组以等体积水灌胃，给药35天后将大鼠用乙醚麻醉，鼠尾动脉采血观察各项指标。4)结果表6.女贞苷对CRF大鼠肾功能的影响 注经T检验，给药女贞苷与造模对照组和正常对照组比较“*”表示P < 0.05， “**” 表示 P < 0. 01本实验用腺瞟呤灌胃建立大鼠CRF模型后，造模对照组大鼠精神萎靡，体重明显 降低，血清BuruSer明显升高，Hb明显下降，Ret明显升高，表明大鼠肾功能受损，经给予女 贞苷后大鼠与正常对照组差异不显著，而与模型组比较差异十分显著，故女贞苷对肾脏无 毒性作用。
1权利要求
一种女贞苷的提取方法，其中所述女贞苷的分子式C33H40O18，分子量724.2，所述女贞苷的结构式如下所述女贞苷采用如下的提取方法获得取山香圆叶或女贞子，加5～15倍量的30％～90％乙醇回流提取1～3次，每次回流提取1～3小时，滤过；合并滤液，回收乙醇，水溶液通过大孔树脂柱，洗脱，收集洗脱部分，减压浓缩，干燥，得女贞苷的混合总苷，经分离，合并女贞苷流份，结晶，得到女贞苷纯品。FSA00000229915100011.tif
2.如权利要求1所述的方法，其中水溶液通过大孔树脂柱，分别用水、5% 10%乙醇、 30% 55%乙醇、0. 8 1. 2%氢氧化钠溶液洗脱，收集30% 55%乙醇洗脱部分，减压浓 缩，干燥。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述女贞苷采用如下的提取方法获得取山香 圆叶，加12倍量70%乙醇回流提取1. 5小时，滤过，滤渣再加10倍量70%乙醇回流提取1. 5 小时，滤过，合并两次提取液，回收乙醇，水溶液通过大孔树脂柱，分别用水、10%乙醇、45% 乙醇、氢氧化钠溶液洗脱，收集45%乙醇洗脱部分，减压浓缩，干燥。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述女贞苷采用如下的提取方法获得取山香 圆叶，加10倍量65%乙醇回流提取2小时，滤过，滤渣再加8倍量65%乙醇回流提取1. 5 小时，滤过，合并两次提取液，回收乙醇，水溶液通过大孔树脂柱，分别用水、8 %乙醇、40 % 乙醇、1. 氢氧化钠溶液洗脱，收集40%乙醇洗脱部分，减压浓缩，干燥。
5.如权利要求1或2所述的方法，其中所述女贞苷采用如下的提取方法获得取山香 圆叶，加15倍量60%乙醇回流提取2小时，滤过，滤渣再加12倍量60%乙醇回流提取2小 时，滤过，合并两次提取液，回收乙醇，水溶液通过大孔树脂柱，分别用水、6 %乙醇、35 %乙 醇、1. 2%氢氧化钠溶液洗脱，收集35%乙醇洗脱部分，减压浓缩，干燥。
6.如权利要求1或2所述的方法，其中所述女贞苷采用如下的提取方法获得取山香 圆叶，加9倍量65%乙醇回流提取2. 5小时，滤过，滤渣再加8倍量65%乙醇回流提取2小 时，滤过，合并两次提取液，回收乙醇，水溶液通过大孔树脂柱，分别用水、5 %乙醇、40 %乙 醇、0.9%氢氧化钠溶液洗脱，收集40%乙醇洗脱部分，减压浓缩，干燥。
7.如权利要求1或2所述的方法，其中所述女贞苷采用如下的提取方法获得取女贞 子，加12倍量70%乙醇回流提取1.5小时，滤过，滤渣再加10倍量70%乙醇回流提取1.5 小时，滤过，合并两次提取液，回收乙醇，水溶液通过大孔树脂柱，分别用水、10%乙醇、45% 乙醇、1 %氢氧化钠溶液洗脱，收集45%乙醇洗脱部分，减压浓缩，干燥。
8.如权利要求1或2所述的方法，其中所述女贞苷采用如下的提取方法获得取女贞子，加10倍量65%乙醇回流提取2小时，滤过，滤渣再加8倍量65%乙醇回流提取1. 5小 时，滤过，合并两次提取液，回收乙醇，水溶液通过大孔树脂柱，分别用水、8 %乙醇、40 %乙 醇、0.8%氢氧化钠溶液洗脱，收集40%乙醇洗脱部分，减压浓缩，干燥。
9.如权利要求1或2所述的方法，其中所述女贞苷采用如下的提取方法获得取女贞 子，加15倍量60%乙醇回流提取2小时，滤过，滤渣再加12倍量60%乙醇回流提取2小时， 滤过，合并两次提取液，回收乙醇，水溶液通过大孔树脂柱，分别用水、6 %乙醇、35 %乙醇、 1.2%氢氧化钠溶液洗脱，收集35%乙醇洗脱部分，减压浓缩，干燥。
10.如权利要求1或2所述的方法，其中所述女贞苷采用如下的提取方法获得取女贞 子，加9倍量65%乙醇回流提取2. 5小时，滤过，滤渣再加8倍量65%乙醇回流提取2小时， 滤过，合并两次提取液，回收乙醇，水溶液通过大孔树脂柱，分别用水、5%乙醇、40%乙醇、 1 %氢氧化钠溶液洗脱，收集40 %乙醇洗脱部分，减压浓缩，干燥。
11.如权利要求1或2所述的方法，其中水溶液通过已处理好的大孔树脂柱，洗脱，混合 总苷经硅胶柱层析、Sephadex LH-20柱层析分离，合并女贞苷流份，结晶，得到女贞苷纯品。
12.女贞苷用于制备预防和治疗流感及其并发症疾病的药物的用途。
13.如权利要求12所述的用途，其中所述女贞苷用于抑制流感病毒。
14.如权利要求13所述的用途，其中所述女贞苷用于抑制流感病毒FM1。
15.如权利要求12所述的用途，其中所述女贞苷用于抑制神经氨酸酶。
16.如权利要求12所述的用途，其中所述并发症是指肾功能衰竭。
17.如权利要求12所述的用途，其中所述并发症是指脾损伤或/和肺损伤。
18.一种女贞苷制剂，该制剂以权利要求1所述的方法获得的女贞苷为主要活性成分。
全文摘要
本发明涉及一种女贞苷及其制备药物用途，所述女贞苷采用如下的提取方法获得取山香圆叶或女贞子，加5～15倍量的30％～90％乙醇回流提取1～3次，每次回流提取1～3小时，滤过；合并滤液，回收乙醇，水溶液通过大孔树脂柱，洗脱，收集洗脱部分，减压浓缩，干燥，得女贞苷的混合总苷，经硅胶柱层析、Sephadex LH-20柱层析分离，合并女贞苷流份，结晶，得到女贞苷纯品，女贞苷可作神经氨酸酶抑制剂用在预防和治疗流感，制成药学上可以接受的剂型。
文档编号A61P13/12GK101899078SQ20101025375
公开日2010年12月1日 申请日期2010年8月16日 优先权日2010年8月16日
发明者刘地发, 叶劲英, 吕武清, 李志勇, 杨小玲, 程帆, 蔡永红, 谢宁 申请人:江西山香药业有限公司;江西青峰药物研究有限公司