专利名称：含有余甘根苷b的药物组合物及其药物用途的制作方法
技术领域：
本发明属于药物领域，具体地，涉及一种以从叶下 珠属药用植物余甘子中分离提取的倍半萜类余甘根苷B(PhyllaemblininB)为有效成分的药物组合物，及其在制备抗柯萨奇 病毒B3药物中和在制备治疗病毒性心肌炎药物中的应用。
背景技术：
柯萨奇病毒B3是正链RNA病毒，属于小RNA病毒 科，肠道病毒属。柯萨奇病毒B3是引起病毒性心肌炎的主要病原体， 可经呼吸道和消化道感染。病毒性心肌炎是以心肌细胞变性坏死、 间质单个核细胞浸润为主要病变的一种临床常见病，在儿童和青少 年中高发，严重危害人类健康。目前，西医临床治疗病毒性心肌炎 的主要方法是使用普通抗病毒药、免疫抑制剂、干扰素及心肌细胞 营养剂等，但疗效并不理想。近年来大量研究表明，中药在病毒性 心肌炎的临床治疗中显示出极大优势。目前临床上针对病毒性心肌 炎的中成药只有个别品种，大多为医生自拟的处方汤药或复方粗提 物，急需开发出有针对性，有效成分清楚，作用机制明确，疗效肯 定，剂型先进，服用携带方便，质量稳定可控的中药制剂。现有技 术中未见有从中药中分离出来的倍半萜类成分余甘根苷B(Phyllaemblinin B)具抗柯萨奇病毒B3及治疗病毒性心肌炎的药理 作用的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供以从叶下珠属药用植物余甘 子中分离提取的倍半萜类余甘根苷B (Phyllaemblinin B)为有效成分 的药物组合物，及其在制备抗柯萨奇病毒B3药物中和在制备治疗病 毒性心肌炎药物中的应用。为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案 药物组合物，其中含有治疗有效量的余甘根苷B，和/或药物学 上可接受的载体。化合物余甘根苷B在制备抗柯萨奇病毒B3药物中的应用。 化合物余甘根苷B在制备治疗病毒性心肌炎药物中的应用。 本发明以柯萨奇病毒B3毒株(CVB3)和HeLa细胞为实验对象 进行药效试验。在HeLa细胞上进行的体外抗病毒试验结果表明，本 发明药物的TCso为50.3(Hig/mL，对CVB3病毒的IC50为7.75貼/mL， 治疗指数(TI)为6.49，表明本发明药物体外对CVB3病毒有显著 抑制作用。采用不同给药方式观察倍半萜类成分余甘根苷B的对抗柯萨奇 病毒B3的活性。结果证明，(1)倍半萜类成分余甘根苷B对CVB3 感染的细胞具有预防作用；(2)倍半萜类成分余甘根苷B对CVB3 感染的细胞具有治疗作用；(3)倍半萜类成分余甘根苷B对CVB3 具有直接杀伤作用。基于上述研究结果，本发明证实了倍半萜类成分余甘根苷B具 有预防和治疗柯萨奇病毒B3感染引起的疾病的新用途，可用于制备 抗柯萨奇病毒B3及治疗病毒性心肌炎的药物。
图1为正常细胞对照组的显微镜图U00x); 图2为病毒对照组的显微镜图(lOOx); 图3为阳性药物病毒唑对照组的显微镜图(100x); 图4为倍半萜余甘根苷B试验组显微镜图(100x)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的实质性内容做进一步阐述，但 不以此对本发明有任何限定。实施例l:从余甘的根中提取制备甘根苷B (PhyllaemblininB)。(1) 余甘根原料去杂、洗净、烘干、粉碎成过30目筛的粗粉。(2) 上述粗粉1.77 kg用80%含水丙酮冷浸提取3次，每次浸 提取时间2天，过滤、合并滤液、减压浓缩、回收溶剂(可用于反 复提取)。(3) 上述残留水溶液，进一步浓縮至小体积后，用正丁醇 U-BuOH)萃取3次，合并正丁醇层液、减压浓縮、回收溶剂。(4)上述正丁醇萃取物(30.6 g)，以薄层层析法检测指导洗 脱(薄层层析的条件为氯仿-甲醇-水(7:3:0.5)为展开剂，10%的 硫酸水溶液为显色剂，加热显色)，通过多种柱层析手段，包括硅 胶G柱层析(氯仿-甲醇-水梯度洗脱)，以及Diaion HP20S& Sephadex LH-20、 MCI gelCHP20P、 Chromatorex ODS等反相柱层析(以不同 浓度的甲醇梯度洗脱)，从中得到余甘根苷B(PhyllaemblininB)(80 mg)。上述余甘根苷B (Phyllaemblinin B)的物理常数和光谱数据 余甘根苷B (Phyllaemblinin B):分子式C33H44019分子量744结构式性状淡黄色粉末；易溶于甲醇、乙醇、丙酮、水。旋光[a]D26 10.4° (c 0.58, MeOH) 红外光谱v咖x(KBr)cm":3206, 2933, 1778, 1718, 1604, 1452, 1294, 1124， 1012. 紫外光谱Xmax (MeOH) nm (log s):279 (2.91), 272 (2,99). 质谱(FAB+-MS): 767 [M+Na]+, 745 [M+H]+ 元素分析for C33H44019'5/2 H20,计算值C 50.13%, H 5.91%;实测值C 50.19%, H 6.25%. & NMR (氖代甲醇中，500 MHz):s 8.16 (2H, dd, / = 7.5, 1.5 Hz, H-3',7'), 7.66 (IH, br t, J = 7.5 Hz, H-5'), 7.57 (2H, br t, / = 7.5 Hz, H曙4',6'), 5.36 (1H, q, J= 3.0 Hz, H國IO), 4.29 (IH, br s, H-5)， 4.03 (IH, t /= 11.0 Hz, H國12a), 3.93 (IH, br s, H-l), 3.58 (IH, br d, J = 11.0 Hz, H-12b), 2.94 (IH, tt,/- 13.5, 2.5 Hz, H-3)， 2.36 (IH, br d,13.5 Hz,H-4a), 2.28 (1H, dd， / = 15.0, 3.0 Hz, H-9a), 2.18 (1H, m, H-ll), 2.01 (1H, dd, J = 15.0, 3.0 Hz, H-9b), 2.04 (1H, br d, J = 13.5 Hz, H-2a), 1.90 (1H， dt, / = 13.5, 4.0 Hz, H國4b), 1.77 (1H, dt, J = 13.5, 2.5 Hz, H-2b), 0.89 (3H, d, / = 7.0 Hz, H誦14); inner glucose: 5.59 (1H, d, J = 8.0 Hz, glc H-l), 4.08 (IH, dd, </ = 9.0, 8.0, glc H画2), 3.89 (IH, dd, J = 12.0, 2.5 Hz, glc H-6a), 3.75 (IH, dd, J = 12.0, 5.0 Hz, glc H-6b), 3.62 (IH, t, / = 9.0 Hz, glc H-3), 3.46 (IH, dd, J = 9,5, 9.0 Hz, glc H-4), 3.39 (IH, m, glc H-5); terminal glucose: 4.18 (IH, d, / = 8.0 Hz, glc H-l), 3.62 (IH, dd, / = 12.0, 2.5 Hz, glc H画6a), 3.56 (IH, dd, J = 12.0, 4.5 Hz, glc H-6b), 3.25 (IH, dd, J = 9.5, 9.0 Hz, glc H-4), 3.23 (IH, dd, /= 9.5, 9.0 Hz, glc H-4), 3.11 (IH, dd, J= 9.0, 8.0, glc H-2), 2.76 (IH, m, glc H-5).13C NMR (氖代甲醇中，125 MHz): S 213.7 (C-7), 175.8 (C-13), 167.8 (C-l'), 134.4 (C-5'), 132.1 (C國2'), 130.8 (C國3', 7'), 129.9 (C-4', 6'): 100.5 (C-8), 76.3 (C-5), 75.4 (C-6), 71.5 (C-l), 70.9 (C-10), 63.4 (C-12), 34.3 (C-ll), 32.7 (C-9), 32.2 (C-2, 3), 29.3 (C-4), 13.1 (C陽14); inner glucose: 93.7 (glc C-1) 83.1 (glc C-2), 78.9 (glc C-5), 77.8 (glc C-3), 70.8 (glc C-4), 62.3 (glc C画6); terminal glucose: 105.9 (glc C-1), 77.7 (glc C-3), 77.6 (glc C-5), 75.9 (glc C-2), 70.7 (glc C-4), 62.0 (glc C-6);下述的制剂实施例是按实施例1的方法先制得化合物余甘根苷B，按常规制成注射液、粉针剂、口服液以及加入赋形剂的粉剂、制粒压片、胶囊。[制剂实施例1]片剂按照本领域已知的方法制备片剂，每片含有下述成分化合物余甘根苷B 50mg乳糖 70mg硬脂酸镁 3mg聚乙烯吡咯烷酮 7mg合计 130mg若需要，片剂可用羟丙基甲基纤维素、滑石和着色剂进行膜包覆。[制剂实施例2]胶囊按照本领域已知的方法制备胶囊剂，每个胶囊中含有下述成分-化合物余甘根苷B 50mg乳糖 70mg玉米淀粉 25mg硬脂酸镁 1mg聚乙烯吡咯垸酮 4mg合计 150mg[制剂实施例3]注射剂按实施例1-8的方法先制得本发明化合物余甘根苷B，取余甘根 苷B按本领域已知的方法制备注射剂，加注射用水，精滤，灌封灭菌 制成注射液。[制剂实施例4]粉针剂按实施例1的方法先制得余甘根苷B，将其溶于无菌注射用水 中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于2安瓿中， 低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。[制剂实施例5]粉剂将所分离得到的余甘根苷B与赋形剂重量比为9:1的比例加入赋 形剂，制成粉剂。[制剂实施例6]口服液按实施例1的方法先制得余甘根苷B，按常规口服液制法制成口 服液。[制剂实施例7]:按实施例1的方法先制得余甘根苷B按其与赋形剂重量比为5:1 的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂或冲剂。下述的试验例可进一步说明本发明所述倍半萜类成分余甘根苷B 及其药物组合物的有益效果，试验例包括了本发明的药效学试验等。试验例h倍半萜类成分余甘根苷B对柯萨奇病毒B3 (CVB3)感染HeLa 细胞的影响试验。 细胞毒性试验将培养生长良好的HeLa细胞经胰酶消化后，加入96孔培养板中 待其贴壁，24小时后弃去培养液。分组如下正常对照组每孔加入细胞维持液lOOpL;阳性药物病毒唑对照组每孔加入梯度稀释的病毒唑溶液10(HlL，每个稀释度四个复孔；给药组加入梯度稀释的倍半萜余甘根苷B溶液10(HlL/孔，每个 稀释度四个复孔；在倒置相差显微镜下观察细胞生存情况，按照四甲基偶氮唑蓝 (MTT)法计算本发明药物对HeLa细胞的TCso。抗柯萨奇病毒B3试验将培养生长良好的HeLa细胞经胰酶消化后，加入96孔培养板中 待其贴壁，24小时后弃去培养液。分组如下正常对照组每孔加入细胞维持液10(HlL;病毒对照组每孔加入CVB3病毒液100pL，设四个复孔；阳性药物病毒唑对照组每孔加入梯度稀释的病毒唑溶液和CVB3 病毒液各50pL，每个稀释度四个复孔；给药组每孔加入梯度稀释的倍半萜余甘根苷B溶液和CVB3病 毒液各50pL，每个稀释度四个复孔。培养48小时后在倒置相差显微镜下观察，HeLa细胞被CVB3病毒感染后，呈现典型的细胞皱縮、变圆、碎裂、脱落等细胞病变现象， 给药后如药物有效，就可以降低被病毒感染细胞的死亡率。按照四甲基偶氮唑蓝(MTT)法计算本发明药物对HeLa细胞的IC50。结果倍半萜类成分余甘根苷B和病毒唑的TC5Q分别为50.30貼/mL和425.97貼/mL，对CVB3病毒的ICso分别为7.75pg/mL 和20.30pg/mL，治疗指数(TI)分别为6.49和20.98，表明本发明药 物体外对CVB3病毒有显著抑制作用。 试验例2.:倍半萜类成分余甘根苷B不同加药方式对柯萨奇病毒B3 (CVB3) 感染HeLa细胞的影响试验。倍半萜类成分余甘根苷B对细胞的保护作用将培养生长良好的HeLa细胞经胰酶消化后，加入96孔培养板中 待其贴壁，24小时后弃去培养液。分组如下正常对照组每孔加入细胞维持液10(HlL;病毒对照组每孔加入细胞维持液100pL，孵育1小时，弃去上清，用PBS溶液清洗三次，加入CVB3病毒液100pL/孔培养，设四个复孔；阳性药物病毒唑对照组每孔加入梯度稀释的病毒唑溶液100pL，孵育l小时，弃去上清，用PBS溶液清洗三次，加入CVB3病毒液100tiL/孔，每个稀释度四个复孔；给药组每孔加入梯度稀释的倍半萜余甘根苷B溶液10(HiL，'孵 育1小时，弃去上清，用PBS溶液清洗三次，加入CVB3病毒液100pL/ 孔，每个稀释度四个复孔。培养48小时后在倒置相差显微镜下观察，HeLa细胞被CVB3病 毒感染后，呈现典型的细胞皱縮、变圆、碎裂、脱落等细胞病变现象， 给药后如药物有效，就可以降低被病毒感染细胞的死亡率。CPE法观察记录结果。CPE (cytopathic effect,细胞病变效应)，是指常规于倒置显微镜下观察试验细胞病变状态。倍半萜类成分余甘根苷B对柯萨奇病毒B3增殖的影响 将培养生长良好的HeLa细胞经胰酶消化后，加入96孔培养板中待其贴壁，24小时后弃去培养液。分组如下正常对照组每孔加入细胞维持液lOOpiL;病毒对照组每孔加入CVB3病毒液100pL，孵育1小时，弃去上 清，用PBS溶液清洗三次，加入细胞维持液100pL/孔培养，设四个复 孔；阳性药物病毒唑对照组每孔加入CVB3病毒液100nL，孵育1 小时，弃去上清，用PBS溶液清洗三次，加入梯度稀释的病毒唑溶液 100pL/孔，每个稀释度四个复孔；给药组每孔加入CVB3病毒液100pL，孵育1小时，弃去上清， 用PBS溶液清洗三次，加入梯度稀释的倍半萜余甘根苷B溶液lOOpL/ 孔，每个稀释度四个复孔。培养48小时后在倒置相差显微镜下观察，HeLa细胞被CVB3病 毒感染后，呈现典型的细胞皱縮、变圆、碎裂、脱落等细胞病变现象， 给药后如药物有效，就可以降低被病毒感染细胞的死亡率。CPE法观 察记录结果。倍半萜类成分余甘根苷B对柯萨奇病毒B3的直接杀伤作用 将培养生长良好的HeLa细胞经胰酶消化后，加入96孔培养板中 待其贴壁，24小时后弃去培养液。分组如下正常对照组每孔加入细胞维持液lO(HlL;病毒对照组细胞维持液与CVB3病毒液各50ul混合后，置37'C作用1小时后，将孵育液加入细胞孔中培养，设四个复孔；阳性药物病毒唑对照组梯度稀释的病毒唑溶液与CVB3病毒液各50ul混合后，置37'C作用1小时后，将孵育液加入细胞孔中培养，每个稀释度四个复孔；给药组梯度稀释的倍半萜余甘根苷B溶液与CVB3病毒液各50ul混合后，置37'C作用1小时后，将孵育液加入细胞孔中培养，每个稀释度四个复孔。培养48小时后在倒置相差显微镜下观察，HeLa细胞被CVB3病 毒感染后，呈现典型的细胞皱縮、变圆、碎裂、脱落等细胞病变现象， 给药后如药物有效，就可以降低被病毒感染细胞的死亡率。CPE法观 察记录结果。结果倍半萜类成分余甘根苷B不同加药方式均能降低HeLa细 胞由柯萨奇病毒B3引起的细胞病变，见表l。表1:倍半萜类成分余甘根苷B不同加药方式抗柯萨奇病毒B3的活性实验结果浓度 预防作用 治疗作用 直接杀伤作用(ug/ml)余甘根苷B病毒唑余甘根苷B病毒唑余甘根苷B 病毒挫病毒对照组++++，正常对照组一注"ND"为没设的浓度；CPE等级"+"为细胞病变25%以下;"++"为细胞病变25 % 50 % "+++"为细胞病变50 % 75 % "++++ 为细胞病变75 %以上。25 +12.5 ++6.25 +++3.13 +++1.56 ++++0.78 ++++++ N++ N+++ N++++ +++++ ++++++ ++ND ++ND +++ ND+++ +++++ +++++ ++ND +++ND +++ND +++++ +++ +++ ++++ ++++D D DN N ND D DN N N+ ++D D DD D DN N N
权利要求
1、药物组合物，其中含有治疗有效量的余甘根苷B和/或药物学上可接受的载体。
2、 权利要求1化合物余甘根苷B在制备抗柯萨奇病毒B3药物 中的应用。
3、 权利要求1化合物余甘根苷B在制备治疗病毒性心肌炎药物 中的应用。
全文摘要
本发明提供一种以倍半萜类化合物余甘根苷B(Phyllaemblinin B)为活性成分的药物组合物，该化合物可从叶下珠属药用植物余甘子中提取分离，本发明还提供该药物活性成分在制备抗柯萨奇病毒B3药物中的应用，以及在制备治疗病毒性心肌炎药物中的应用。
文档编号A61P31/12GK101229179SQ200810058110
公开日2008年7月30日 申请日期2008年2月22日 优先权日2008年2月22日
发明者哲 任, 张美英, 张颖君, 朱宏涛, 杨崇仁, 东 王, 王一飞, 王亚峰, 王晓燕 申请人:中国科学院昆明植物研究所