本发明涉及医药技术领域，涉及一种t7肽修饰的主动脑靶向纳米递药系统及其制备方法。
背景技术：
缺血性脑中风和脑肿瘤一直以来是导致全球人口死亡的主要疾病，特别在中老年群体中更为常见，严重危害人类的生命和健康。随着经济的快速发展和人们生活水平的提高，脑缺血性中风和脑肿瘤的患病人群呈现低龄化趋势，给整个社会和家庭带来了沉重的经济负担。但是研究发现，在治疗缺血性脑中风和脑肿瘤的过程中，由于血脑屏障（bbb）的阻碍，大约有98%的亲水性小分子和绝大多数大分子都不能通过，使药物分子难以达到病灶处，限制了对缺血性脑中风和脑肿瘤的临床疗效。因此，研究设计能够携带药物高效穿过bbb，特异性靶向脑缺血区神经细胞或脑肿瘤病变部位的纳米药物载体，具有重大的创新价值和科学意义。
随着纳米技术的快速发展，纳米材料在生物医学领域得到了广泛的应用，尤其是在医学成像、疾病诊断、药物靶向递送、癌症精准治疗、基因转染等领域。可降解纳米载体由于优良的生物相容性和可修饰性，已成为主动脑靶向递药系统研究的热点之一。
聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolicacid),plga)是由乳酸(lacticacid,la)和羟基乙酸(glycolicacid,ga)按照不同比例聚合而成的一种功能性高分子有机材料，已经通过美国的食品药品监督管理局(fda)认证。目前，已被广泛用于制备人工导管，药物缓释载体(微球、纳米粒、微丸)，埋植剂以及膜剂等制剂中。但是由于plga嵌段结晶性较强，且有疏水性，所以极易被网状内皮系统（res）清除，聚乙二醇(peg)具有优良的亲水性，且无毒，无免疫原性。采用亲水性的双功能聚乙二醇（nh2-peg-mal）对plga进行表面修饰，不仅能够降低plga的细胞毒性，而且可以进一步提高plga载体系统的亲水性，增大对难溶性药物的载药量，显著降低细胞毒性，有效延缓res的清除，延长纳米药物载体的体循环时间，能够实现药物的长时间缓释（数周或数月），明显减少了用药频率；并且研究发现，peg-plga表面经过特异性靶向配体修饰后，可携载药物分子透过血脑屏障，显著提高药物在脑组织病变部位的有效浓度，达到精准治疗脑部疾病的目的。降低其它非病变部位的药物浓度，减少对机体的毒副作用
研究发现，bbb的渗透性取决于脑毛细血管内皮细胞(bcecs)之间的紧密连接，研究表明，组成bbb的bcecs上有许多受体，包括转铁蛋白受体、胰岛素受体、低密度脂蛋白受体相关蛋白(lrp)受体等，其中转铁蛋白(transferrin，tf)为转铁蛋白受体的特异性配体(transferrinreceptortfr),将其修饰于纳米载体表面可以达到靶向bbb靶向效果。然而,内源性的tf能竞争性抑制tf修饰的纳米粒与tfr特异性结合【hanl,lijf,huangsx,etal.peptide-conjugatedpolyamidoaminedendrimerasananoscaletumor-targetedt1magneticresonanceimagingcontrastagent[j].biomaterials,2011,32:2989-2998】，且蛋白构象的改变容易导致其功能的丧失,从而不利于发挥靶向作用【mahmoudim,shokrgozarma,sardaris,etal.irreversiblechangesinproteinconformationduetointeractionwithsuperparamagneticironoxidenanoparticles[j].nanoscale,2011,3:1127-1138】。近期的研究发现一种新型多肽-t7肽(序列chaiyprh)，能够与tfr特异性结合,结合常数高达10nmol·l-1,并且由于结合位点的不同,内源性tf不会抑制反而会促进t7修饰的纳米粒与tfr特异性结合【袁端锋,宗太丽,高会乐,何勤.穿膜肽tat和脑肿瘤靶向肽t7双修饰脂质体的制备和体外靶向性评价[j].药学学报,2015,(01):104-110】。此外，t7为小分子多肽，可化学合成，稳定性好，作为主动脑靶向头基空间位阻小，靶向效率高，临床应用前景好。
技术实现要素：
针对上述在治疗缺血性脑中风或脑肿瘤过程中，存在药物分子bbb透过率低和脑靶向性不足等技术问题，本发明的目的在于提供一种t7肽修饰的主动脑靶向纳米递药系统的制备方法。
本发明使用新型多肽-t7肽作为特异性脑靶向配体，功能性高分子有机材料plga作为基础载体，包载难溶性药物丹参酮iia(tanshinoneiia，tsiia)制成高效主动的脑靶向纳米递药系统。制备的t7肽修饰的主动脑靶向纳米递药系统是以受体介导方式透过bbb，提高药物对脑缺血或脑肿瘤病变组织部位的靶向能力，达到精确治疗缺血性脑中风或脑肿瘤的目的。
本发明具有转铁蛋白作为脑靶向头基的优点，并且有效避免内源性转铁蛋白的干扰，靶向和治疗效率高、制备方法简单，并且可以应用于其它中枢神经系统疾病（如：阿尔茨海默症、老年痴呆等）的精准靶向治疗。
为达到上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供一种t7肽修饰的主动脑靶向纳米递药系统，主要是由高分子共聚物plga、聚乙二醇（peg）、t7肽和难溶性药物组成，是以t7肽作为高效脑靶向配体，以plga高分子共聚物为基础纳米药物载体材料，采用乳化溶剂挥发法包载难溶性药物分子，再通过双功能nhs-peg-mal共价连接t7肽，构建主动脑靶向纳米递药系统。
本发明中所述的高分子共聚物plga末端基团分别为羧基（-cooh）和羟基（-oh），其分子量为10000～30000；其中，合成plga过程中乙交酯与丙交酯的比例为1/100～99/100。
本发明中所述的聚乙二醇（peg）分子量1000～5000，末端基团分别为氨基（-nh2)和马来酰亚胺（mal）。
本发明中所述的多肽序列为chaiyprh的t7肽，所述的纳米粒径的范围为100～400nm，所述的难溶性药物为丹参酮iia，所述的脑靶向纳米递药系统中载药量为1%～40%，包封率50%～95%。
本发明按下述方法制备t7肽修饰的主动脑靶向纳米递药系统:
首先利用dcc缩合法制备peg-plga二嵌段共聚物；称取一定量的peg-plga聚合物和药物丹参酮iia溶于混合有机溶剂中，采用液下滴加的方式，加入到一定浓度的乳化剂溶液中，冰水浴下超声，搅拌挥发溶液中含有的有机溶剂，高速离心用超纯水反复清洗三次，去除混悬溶液中的乳化剂，用微孔滤膜过滤后进行冻干，空白的peg-plga纳米粒制备如同上述方法；称取载丹参酮iia的peg-plga纳米粒用pbs（ph=7.0）溶液复溶，加入t7肽避光搅拌反应24h，未反应的t7肽通过透析袋（mwco：5kda）在pbs(ph7.0)缓冲液中除去，将透析后的溶液冻干，即可得到t7肽修饰的主动脑靶向纳米递药系统。
本发明中所述的高分子共聚物plga与聚乙二醇（peg）的摩尔比为1:1～1:40，t7肽与peg-plga二嵌段共聚物的摩尔比为1:1～1:5，纳米药物载体与难溶性药物分子的摩尔比为1:1～1:20。
本发明中所述的乳化溶剂挥发法中所用的混合有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、无水乙醇中任意两种混合；所用的乳化剂类型为吐温-80、聚乙烯醇（pva）、泊洛沙姆188，大豆磷脂或卵磷脂其中的一种或几种的混合物，乳化剂的质量分数为0.1%～10%。
本发明中所述的t7肽与peg-plga共聚物连接的方式，是通过t7肽的疏基与peg链一端的马来酰亚胺基团反应连接制得。
本发明采用氢核磁共振氢谱对合成的t7-peg-plga脑靶向载体进行结构鉴定，结果显示，所述的高分子共聚物plga与含有双功能双功能nhs-peg-mal反应后在δ=3.646ppm和δ=7.002ppm处出现peg的特征吸收峰，表明mal-peg-nh2已经成功地接到了plga分子链的末端；peg-plga进一步与t7肽反应后，在δ=6.589ppm、6.617ppm以及δ=8.077ppm~8.945ppm出现了t7肽的特征质子峰，并且δ=7.002ppm处peg末端的马来酰亚胺基团（mal）特征质子峰消失，充分证明了t7肽中疏基与mal-peg-plga末端的mal基团反应，已经成功的制备了t7-peg-plga纳米载体。
本发明还提供所述t7肽修饰脑靶向纳米递药系统作用于脑部的荧光探针追踪剂的应用。将包含荧光探针追踪剂dir的t7肽修饰脑靶向载药纳米颗粒注入icr小鼠，并将其置入多光谱活体成像系统中成像，观察包载荧光分子的纳米颗粒在小鼠体内的分布。随后解剖小鼠并取出其脑部，进行脑部荧光成像，观察纳米载药颗粒在小鼠脑部的聚集程度。其中可观察到t7肽修饰脑靶向载药纳米颗粒在脑部富集程度加强。
本发明的优点及特征是：
本发明选用具有毒性低、亲水性和生物降解性较好的peg-plga二嵌段共聚物作为纳米药物载体。其中，peg-plga共聚物在人体内降解时,最终的降解产物为二氧化碳(co2)和水(h2o),不会在体内聚集。因此，生物相容性好，无免疫原性，安全性高。并且peg的亲水基团能够减少血液对纳米粒的调理作用，从而延长药物的血液半衰期；且不需要使用辅助溶剂，可以避免对正常组织器官产生副作用，增加患者适应性。
本发明采用可特异性结合血脑屏障表面转铁蛋白受体的新型多肽t7肽与peg-plga二嵌段共聚物相结合，制备脑靶向纳米递药系统，提高药物bbb的穿透效率，极大提高了纳米载体药物跨越血脑屏障的效率，使药物富集于病灶组织，提高了药物的生物利用度，降低药物的毒副作用以及有效控制药物释放，在治疗和诊断缺血性脑卒中和脑肿瘤疾病方面具有极好的应用前景。
附图说明
图1为t7肽修饰peg-plga脑靶向纳米递药系统的合成流程图。
图2为实施例1合成的peg-plga共聚物的核磁共振氢谱图。
图3为实施例3制备的纳米载体t7-peg-plga的核磁共振氢谱图。
图4为t7肽修饰的主动脑靶向纳米递药系统粒径分布图。
图5为t7肽修饰的主动脑靶向纳米递药系统电位分布图。
图6为t7肽修饰的主动脑靶向纳米递药系统的扫描电镜图。
图7为t7肽修饰的主动脑靶向纳米递药系统体外药物释放曲线图。
图8为t7肽修饰的主动脑靶向纳米递药系统荧光活体成像分布图，其中a为小鼠活体荧光分布图，b为体内器官荧光分布图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。
实施例1载体peg-plga的制备
称取250mgplga-cooh溶解于2ml二氯甲烷中，然后加入10.78mgdmap(plga:dmap1:6，摩尔比)、10.15mgnhs（plga:nhs1：6，摩尔比）和18.2mgdcc（plga:dcc1：6，摩尔比），在氮气n2保护下室温搅拌24h。反应结束后，过滤除去二环己基脲（dcu），将滤液缓慢滴加到10ml冰无水乙醚中，析出的沉淀plga-nhs用冰乙醚和甲醇的混合液洗3次，去除未反应的nhs和dcc。溶剂在温度60℃真空干燥下4小时，得到聚合物重新用2ml二氯甲烷溶解，然后在加入33.2mgmal-peg-nh2（1：1.3plga:peg摩尔比）和3滴n，n-二异丙基乙基胺（dpiea），在氮气n2保户条件下搅拌反应12h，将溶液缓慢滴加到10ml冰的无水乙醚中，析出的白色絮状沉淀用冷的甲醇洗涤，去除未反应的mal-peg-nh2，最后的产物mal-peg-plga用乙醚沉淀析出，然后真空干燥4小时进行核磁共振氢谱表征，结果如图2所示。
实施例2包载丹参酮iiapeg-plga纳米粒的制备
称取30mgpeg-plga和2mg丹参酮iia溶解于2.0ml二氯甲烷和丙酮（丙酮：二氯甲烷=1:9v/v）的混合有机相中，采用液下滴加的方式，加入到20ml质量分数为0.5%pva的水溶液中，冰水浴下250w超声10s间歇10s，超声15min，600r/min搅拌5h挥发溶液中含有的有机溶剂，然后14000r/min高速离心30min
用超纯水反复清洗三次，去除纳米粒混悬溶液中的乳化剂，用0.22μm微孔滤膜过滤后进行冻干,制得包载丹参酮iiapeg-plga纳米粒，空白的peg-plga纳米粒(peg-plga-nps）制备如同上述方法。
实施例3t7肽修饰peg-plga脑靶向纳米载体的制备
将20mg空白的peg-plga纳米粒用pbs（ph=7.0）溶液复溶，加入1mgt7肽，t7肽与peg-plga的摩尔比为1:1，避光搅拌反应24h，未反应的t7肽通过透析袋（mwco：5kda）在pbs(ph7.0)缓冲液中除去，将透析后的溶液冻干，即可制得t7-peg-plga脑靶向纳米载体，进行核磁共振氢谱表征，结果如图3所示。
实施例4t7肽修饰的主动脑靶向纳米递药系统的制备
将25mg载丹参酮iiapeg-plga纳米粒用pbs（ph=7.0）溶液复溶，加入1mgt7肽，t7肽与peg-plga的摩尔比为1:1，避光搅拌反应24h，未反应的t7肽通过透析袋（mwco：5kda）在pbs(ph7.0)缓冲液中除去，将透析后的溶液冻干，即可制得t7肽修饰的主动脑靶向纳米递药系统。
实施例5t7肽修饰的主动脑靶向纳米递药系统纳米粒径和电位的测定。
将实施例4制备的t7肽修饰的peg-plga丹参酮iia纳米粒(t7-peg-plga-tsiianps）冻干粉溶于蒸馏水中，制备成1mg/ml的溶液，经过0.22um微孔滤膜过滤后，置于zeta-sizer电位粒度分析仪中检测粒径分布和电位分布，每个样品测试重复三次，取平均值，测得t7-peg-plga-tsiianps的粒径为158.6±0.263nm，zeta电位为-35.6±0.82mv，结果如图4和图5所示。
实施例6t7肽修饰的主动脑靶向纳米递药系统扫描电镜的表征。
将实施例4制备的t7-peg-plga-tsiianps，用导电胶固定到金属片上，真空下镀金，利用扫描电镜sem观察纳米粒的外观形貌及分散性，结果如图5所示，从图中可以看出制备的纳米粒，具有较规整的球形，大小均一，分散性良好。
实施例7t7肽修饰的主动脑靶向纳米递药系统载药量及包封率的测定。
采用高效液相色谱测定丹参酮iia的含量:色谱柱：watersc18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相：甲醇：水=75:25（v/v）柱温：25℃流速：1.0ml/min紫外检测波长：268～270nm，进样量：20μl。
分别取浓度为1、5、10.0、25.0、50、80、100μg/ml的丹参酮iia标准品溶液，按照色谱条件进行测试，以峰面积对丹参酮iia浓度进行拟合，建立回归方程。精密称取冻干好的2mgt7-peg-plga-tsiia-nps，置于10ml容量瓶中，用甲醇稀释后摇匀定容；0.22μm微孔滤膜过滤后，进样3次每次20μl；用hplc检测，以峰面积a为纵坐标，丹参酮iia浓度c为横坐标，进行线性回归，线性回归方程为：a=1.5178c+4.8852(r2=0.9998)。根据标准曲线回归方程，计算丹参酮iia的含量。根据以下公式，可以求得t7肽修饰的peg-plga丹参酮iia纳米粒中载药量和包封率(丹参酮iia高效液相色谱图如图6所示)；包封率%=（纳米载体中所含的药量/投入的总药量）×100%，载药量%=（纳米载体中所含的药量/投入的总药量）×100%，最终测得t7-peg-plga-tsiianps的载药量为14.3%±1.02，包封率为82.7%±1.34。
实施例8t7肽修饰的主动脑靶向纳米递药系统体外释药的测定。
精密称量丹参酮iia和冷冻干燥后的t7-peg-plga-tsiianps各6mg，分别置于5ml0.01mol/l的ph=7.4pbs缓冲液中，再放入50ml的离心管，立即置于37±1℃恒温水浴摇床中，100r/min匀速搅拌，并保持漏槽条件。分别于0、15min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h规定的时间点取样1ml，同时补充等量等温的新鲜介质。样品经15000r/min离心25min后，取出上清液用0.22μm微孔滤膜过滤后，加一倍量的甲醇稀释后进样20μl，记录峰面积，代入标准曲线，计算溶液中丹参酮iia的浓度液，计算规定时间内的药物累计释放率。每个样品平行操作3份，以累积释放率的平均值对时间绘制体外累计释放曲线（如图7所示）。通常由高分子载体材料包载药物分子，其释放药物的速度主要受高分子材料降解的速度影响，从释药曲线中可以看出载药纳米粒随着时间的延长能够将药物逐步释放出来，丹参酮iia（tsiia）和t7-peg-plga-tsiianps在72h累积释放量分别为90.46%和70.31%。
实施例9t7肽修饰的主动脑靶向纳米递药系统荧光活体成像分布的评价。
使用本发明的方法制备空白plganps、peg-plganps、和t7-peg-plganps，然后配制dirdmso溶液（浓度1mg/ml）。精确量取100μldir的dmso溶液，置于3个棕色瓶中，然后分别加入plga、plga-peg和t7-peg-plga的pbs（ph=7.0）溶液中，避光搅拌过夜，经pd-10柱纯化纳米粒，去除未包载的dir，制得包载dir荧光探针的plganps、包载dir的peg-plganps、包载dir的t7-peg-plganps。
选取雄性icr小鼠9只，体重20±2g，随机分为三组，即plganps组、peg-plganps组和t7-peg-plgnps组，分别尾静脉注射负载dir荧光探针的plganpspeg-plganps、和t7-peg-plgnps，给药剂量100mg/kg，在给药后30min、1h、3h的三个时间点，分别丛每组中随机抽取一只，腹腔注射0.2ml10%的水合氯醛溶液进行麻醉，然后放进活体成像仪中，观察负载荧光探针纳米载体在小鼠体内的分布情况(如图8所示)。
图8为icr小鼠活体荧光成像图，其中a和a分别为注射负载dir的plganps组的小鼠活体和体内器官荧光分布图，b和b分别为注射负载dir的peg-plganps组的小鼠活体和体内器官荧光分布图，c和c分别为注射负载dir的t7-peg-plganps小鼠和体内器官荧光分布图，由图中可见，t7-peg-plganps进入到icr小鼠脑组织中的荧光强度显著高于plganps和peg-plganps，该实验结果表明，经过t7肽修饰的主动脑靶向纳米递药系统，能显著提高纳米粒穿越血脑屏障的能力，具有优良的主动脑靶向性。