本发明涉及一种蝼蛄提取物在制备治疗三阴乳腺癌药物中的应用。
背景技术：
中国专利申请cn200410025162.7公开一种从蝼蛄中提取的抗肿瘤有效部位及制备方法，该方法是将蝼蛄整虫粉碎后，用醇溶液提取，再用低极性有机溶剂进行萃取后，得到有效部位，且该有效部位具有显著的抗肿瘤活性。由于涉及醇溶液提取过程，故生产成本较高，产业化过程较复杂，且该提取物对三阴乳腺癌细胞的抑制作用尚待提高。
中国专利申请cn201010300103.1公开一种利用高速逆流色谱分离中药蝼蛄药效学物质的方法，该方法包括了药材研碎、70％乙醇水溶液回流提取、石油醚萃取后乙酸乙酯萃取、得到的乙酸乙酯萃取物，采用高速逆流色谱分离，溶剂系统为正己烷、乙醇和水的混合溶液，混合溶液的比例为正己烷：乙醇：水＝6：5：1，分离柱体积为230ml，流动相为上相，转速为1000r/min，流速1.5ml/min，样品量400mg，固定相保留率48％，检测波长245nm，样品收集时间30-35min，测定活性为qgy7703肝癌细胞，细胞毒活性高于阴性对照30.47％。该制备方法涉及多步提取过程，制备方法繁琐、生产成本高、产业化过程复杂，且该提取物对三阴乳腺癌细胞无抑制作用。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中蝼蛄提取物对三阴乳腺癌细胞抑制活性低的缺陷，而提供一种蝼蛄提取物在制备治疗三阴乳腺癌药物中的应用。与抗肿瘤药紫杉醇和中国专利申请cn200410025162.7制得的活性部位相比，该蝼蛄提取物对三阴乳腺癌细胞具有明显体外抑制活性。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题：
本发明提供一种蝼蛄提取物在制备治疗三阴乳腺癌药物中的应用，所述蝼蛄提取物的制备方法包括如下步骤：
(1)将石油醚提取原料蝼蛄后所得提取液，减压浓缩至重量基本不变；
(2)采用高速逆流色谱分离，其中：溶剂系统为氯仿、甲醇和水的混合液，上相为固定相，下相为流动相；收集60-120min的洗脱液后，减压浓缩即可。
步骤(1)中，所述蝼蛄，一般来讲是本领域技术人员均知的中药材蝼蛄，在使用前一般将干燥的蝼蛄整虫粉碎后作为原料使用，所述原料为粉碎后的蝼蛄药材粗粉，水分含量一般在3wt％-5wt％。
步骤(1)中，所述石油醚可为本领域常规使用的石油醚，较佳地为沸程规格为30-60℃的石油醚，更佳地为沸程规格为60-90℃的石油醚。发明人在研究过程中发现，采用沸程规格为30-60℃的石油醚提取，该步骤的得率约为15％-20％；采用沸程规格为60-90℃的石油醚的提取，该步骤的得率约为18％-25％。
其中，所述石油醚的用量可为本领域常规的用量，所述石油醚的体积与所述蝼蛄的质量的比值较佳地为4-6，单位为g/ml，更佳地为6，单位为g/ml。
步骤(1)中，所述提取的操作和条件可为本领域常规的提取的操作和条件，例如回流提取，所述提取的次数较佳地为3-4次，更佳地为3次。
步骤(1)中，所述减压浓缩的操作和条件可为本领域常规的操作和条件，所述减压浓缩的温度较佳地为50-70℃，更佳地为60℃。
步骤(2)中，所述分离在高速逆流色谱仪中进行，所述高速逆流色谱仪的设备型号为tauto300b，所述高速逆流色谱仪的柱体积为300ml。
步骤(2)中，所述高速逆流色谱的转速可为本领域常规使用的转速，所述流动相的流速可为本领域常规使用的流速。较佳地，所述高速逆流色谱的转速为800-1000r/min，所述流动相的流速为1.0-1.5ml/min。更佳地，所述高速逆流色谱的转速为1000r/min，所述流动相的流速为1.5ml/min。发明人在研究过程中发现，当高速逆流色谱的转速为1000r/min，流动相的流速为1.5ml/min时，可以加快分离效率。
步骤(2)中，所用的溶剂系统在本领域常规的转速下即分为两相系统，上相为固定相，下相为流动相，在分离过程中，蝼蛄提取物进入流动相，收集60-120min的洗脱液，经减压浓缩除去洗脱液中的有机溶剂后，即得本发明的目标产物蝼蛄提取物。
步骤(2)中，所述混合液中氯仿、甲醇和水的体积比较佳地为(5-7):6:6，更佳地为1:1:1。
步骤(2)中，所述固定相的保留率较佳地为54％。
步骤(2)中，所述减压浓缩的操作和条件可为本领域常规的操作和条件，所述减压浓缩的温度较佳地为50-70℃，更佳地为60℃。
本领域技术人员知晓，乳腺癌可以根据肿瘤细胞的镜下特点分为不同类型，如：来源于上皮细胞的肿瘤，来源于肌肉、脂肪或结缔组织的肉瘤；乳腺癌还可以根据癌细胞表面或细胞内的蛋白质来分类，如激素受体阳性或三阴性。
本发明中，所说的三阴乳腺癌指的是雌激素受体(er)、孕激素受体(pr)及人表皮生长因子受体2(her-2)均为阴性表达的乳腺癌，其占全部乳腺癌患者总数的10-15％，具有发病年龄较早、高侵袭性、预后差、早期发生局部复发和远处转移等特点，且内脏转移的几率高于骨转移，易发生脊髓、脑膜、脑、肝和肺转移。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明提供一种蝼蛄提取物在制备治疗三阴乳腺癌药物中的应用。与抗肿瘤药紫杉醇和中国专利申请cn200410025162.7制得的活性部位相比，该蝼蛄提取物对三阴乳腺癌细胞具有明显体外抑制活性。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例中，“原料”指的是“粉碎后的蝼蛄干燥药材粗粉”。
实施例1
(1)50g原料，以300ml石油醚(沸程为60-90℃)回流提取三次，60℃下减压浓缩，至无溶剂味并重量不减失。
(2)采用tauto300b型高速逆流色谱仪进行分离，溶剂系统为氯仿、甲醇和水的混合液，该混合液中氯仿、甲醇和水的体积比为1:1:1，上相为固定相，下相为流动相，转速为1000r/min，流速为1.5ml/min，固定相保留率54％，并采用蒸发光散射检测器(elsd)检测流动相，收集60-120min的洗脱液，60℃下减压浓缩即得。
对比例1
50g原料，以400ml的95％乙醇回流提取三次，60℃下减压浓缩，至无溶剂味并重量不减失，以300ml的石油醚(沸程为60-90℃)回流提取三次，60℃下减压浓缩至重量不减失即得。
对比例2
50g原料，以300ml70％乙醇水溶液回流提取三次、石油醚(沸程为60-90℃)萃取后乙酸乙酯萃取、得到的乙酸乙酯萃取物，采用高速逆流色谱分离，溶剂系统为正己烷、乙醇和水的混合溶液，混合溶液的比例为正己烷：乙醇：水＝6：5：1，分离柱体积为230ml，流动相为上相，转速为1000r/min，流速1.5ml/min，样品量400mg，固定相保留率48％，检测波长245nm，样品收集时间30-35min即得。
对比例3
50g原料，以400ml的95％乙醇回流提取三次，60℃下减压浓缩，至无溶剂味并重量不减失，以300ml的石油醚(沸程为60-90℃)回流提取三次，60℃下减压浓缩至重量不减失，采用高速逆流色谱分离，溶剂系统为正己烷、乙醇和水的混合溶液，混合溶液的比例为正己烷：乙醇：水＝6：5：1，分离柱体积为230ml，流动相为上相，转速为1000r/min，流速1.5ml/min，样品量400mg，固定相保留率48％，检测波长245nm，样品收集时间30-35min即得。
对比例4
50g原料，以400ml的95％乙醇回流提取三次，60℃下减压浓缩，至无溶剂味并重量不减失，以300ml的石油醚(沸程为60-90℃)回流提取三次，60℃下减压浓缩至重量不减失，采用tauto300b型高速逆流色谱仪进行分离，溶剂系统为氯仿、甲醇和水的混合液，该混合液中氯仿、甲醇和水的体积比为1:1:1，上相为固定相，下相为流动相，转速为1000r/min，流速为1.5ml/min，固定相保留率54％，并采用蒸发光散射检测器(elsd)检测流动相，收集60-120min的洗脱液，60℃下减压浓缩即得。
对比例5
50g原料，以300ml70％乙醇水溶液回流提取三次、石油醚(沸程为60-90℃)萃取后乙酸乙酯萃取、得到的乙酸乙酯萃取物，采用tauto300b型高速逆流色谱仪进行分离，溶剂系统为氯仿、甲醇和水的混合液，该混合液中氯仿、甲醇和水的体积比为1:1:1，上相为固定相，下相为流动相，转速为1000r/min，流速为1.5ml/min，固定相保留率54％，并采用蒸发光散射检测器(elsd)检测流动相，收集60-120min的洗脱液，60℃下减压浓缩即得。
对比例6
发明人在研发过程中发现，若将实施例1步骤(2)中的溶剂系统替换为二氯甲烷-甲醇-水体系时，分离效果不好，使得提取物中的有效成分受到影响，进而对三阴乳腺癌细胞的体外抑制活性降低；若将实施例1步骤(2)中的溶剂系统替换为氯仿-乙醇-水体系时，溶液分层时间太长，极大地影响分离效果，使得提取物中的有效成分受到影响，进而对三阴乳腺癌细胞的体外抑制活性大大降低。
效果实施例1
将实施例1所得提取物、对比例1-5所得提取物以及对照药紫杉醇分别制成下表中的浓度，接种三阴乳腺癌细胞mda-mb-231于96孔板上，并用对应浓度的提取物、对照药，处理细胞48h后。每孔加入75μl1％冰醋酸配制的磺酰罗丹明b(srb)染色液(0.4％)，室温下染色10min；弃去各孔内染色液后，用1％醋酸冲洗3遍，洗去多余的srb染料，每孔加入100μl10mmtris-base(三羟甲基胺基甲烷，ph＝10.5)溶液，在孔板振荡器上低速振荡5-10分钟，充分溶解srb后，使用酶标仪在490/630nm波长下测吸光度od值。其中：实施例1和对比1-2均重复三批。
根据酶标仪测定的od值，按下列公式计算细胞存活率：存活率(％)＝处理组od/对照组od×100％。抑制率(％)＝100％-存活率(％)。
注：上表中的对照药紫杉醇购自上海同田生物技术股份有限公司，纯度为≥98％(hplc)。
实施例2
(1)50g原料，以200ml的石油醚(沸程为60-90℃)回流提取三次，60℃下减压浓缩，至无溶剂味并重量不减失。
(2)采用tauto300b型高速逆流色谱仪进行分离，溶剂系统为氯仿、甲醇和水的混合液，该混合液中氯仿、甲醇和水的体积比为5:6:6，上相为固定相，下相为流动相，转速为1000r/min，流速为1.5ml/min，固定相保留率54％，并采用蒸发光散射检测器(elsd)检测流动相，收集60-120min的洗脱液，60℃下减压浓缩即得。
实施例3
(1)50g原料，以300ml的石油醚(沸程为60-90℃)回流提取三次，60℃下减压浓缩，至无溶剂味并重量不减失。
(2)采用tauto300b型高速逆流色谱仪进行分离，溶剂系统为氯仿、甲醇和水的混合液，该混合液中氯仿、甲醇和水的体积比为7:6:6，上相为固定相，下相为流动相，转速为1000r/min，流速为1.5ml/min，固定相保留率54％，并采用蒸发光散射检测器(elsd)检测流动相，收集60-120min的洗脱液，60℃下减压浓缩即得。
效果实施例2
按照效果实施例1的测试方法，测定实施例2和实施例3所得提取物的对三阴乳腺癌细胞mda-mb-231的抑制率，所得抑制率的数值与实施例1相当。