本发明属于临床药物技术领域，尤其涉及一种保护心肌细胞的药物及其制备方法。
背景技术：
细胞凋亡(apoptosis)又称程序性细胞死亡(programmedcelldeath，pcd)，系由局部生理性或病理性刺激引起的一种受基因调控的有序的细胞非炎症性死亡。1972年ken等首次提出这一概念，但由于凋亡过程发生短暂而不易检测，直至80年代人们才开始对各种组织器官的凋亡进行广泛的研究。对于心肌细胞凋亡的研究近几年才有了新的突破，从此为人们探索各种心脏疾病的病理机制及药物防治开拓了一条新途径。正常成年心肌细胞一般被认为是不再增殖的高度分化的终末细胞，在正常条件下心肌细胞不会产生凋亡现象。但是目前研究已经得到了证实，心肌细胞在机械牵拉、压力负荷、缺血再灌注、细胞因子等各种刺激的作用下也会发生凋亡。对于心肌细胞凋亡的研究较晚，因为心肌细胞凋亡过程短，持续的时间仅为1～3h，所以不易被发现，使人们忽略了其在心脏病中的作用。1989年neponlniash-chikh在观察饥饿性心肌萎缩超微结构时，发现了心肌细胞的凋亡；1994年gonliebl3j和kawanol用电镜和dna凝胶方法发现了免心肌细胞凋亡的直接证据。对于心肌细胞凋亡的治疗，目前临床大多采用西药。李法琦等[福辛普利对自发性高血压左心室肥厚大鼠心肌细胞凋亡的影响，重庆医学，2001年7月第30卷第4期]采用末端脱核糖核苷酸的方法末站标记(tunel)技术检测shr和wky大鼠左心空心肌细胞凋亡的变化，结果表明，福辛普利能显著改冬shr的lvh.其机制之一可能与促进心肌细胞凋亡有关。冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)一直是危害人类健康甚至生命的严重疾病，冠心病的发生，致使相当数量的患者不同程度的丧失劳动能力，既给患者造成生活上的困难，肉体上的痛苦，又给国家、社会带来一系列问题和严重损失。长期的临床研究，医生们发现冠心病心绞痛又分多种，有的分为劳动性心绞痛、中间型、变异性心绞痛，还有的分为：稳定型、不稳定型和变异型心绞痛，各类型心绞痛在治疗上也各有特殊性。
石菖蒲为天南星科多年生草本植物石菖蒲(acorustatarinowiischott)的干燥根茎。多年生草本植物，叶全缘，排成二列，肉穗花序(佛焰花序)，花梗绿色，佛焰苞叶状。生长于海拔20米至2600米的地区，多生在山涧水石空隙中或山沟流水砾石间(有时为挺水生长)。花果期2-6月。分布于亚洲，包括印度东北部、泰国北部、中国等国。始载于《神农本草经》，列为上品。气芳香，味苦、微辛。性味辛、苦、温。归心、胃经。具有开窍豁痰，醒神益智，化湿和胃之功效。临床上用于神昏癫痫，健忘失眠，耳鸣耳聋，脘痞不饥，噤口下痢的治疗。
石菖蒲的化学成分的研究一直是人们的研究重点，其结构复杂，主要包括挥发油、苯丙素(简单苯丙素、木脂素及香豆素类)、萜(单萜、倍半萜、二萜及三萜类)、生物碱、醛和酸、醌和酮类、甾醇、氨基酸及糖等。
石菖蒲的须根、叶和根茎中均含有挥发油，且以根茎中含量较高(2％)，不仅供药用，也是一种香料。《中药学》中记载本品中挥发油0.11％～0.42％，含油率随产地不同差异较大。挥发油是石菖蒲镇静、催眠、抗惊厥作用的主要有效部位，而挥发油中主要活性成分是细辛醚系列物。
石菖蒲对中枢神经系统有兴奋、抑制的双向调节作用，既镇静安神(镇静、抗惊厥)，又醒脑开窍(兴奋、抗抑郁)，对脑组织和神经细胞有很好的保护作用。此外，其对心血管也具有调节作用。对心肌细胞具有调理效果，但现有资料显示，研究较少，没有利用石菖蒲中药的优良特性。
综上所述，现有技术存在的问题是：目前治疗冠心病的药物存在副作用大，不能很好的保护心肌细胞，不利于身体康复。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种保护心肌细胞的药物及其制备方法。
本发明是这样实现的，一种保护心肌细胞的药物，所述保护心肌细胞的药物由黄芪30g、黄精15g、炙甘草10g、生地15g、麦冬10g、玄参10g、党参20g、桂枝3g、五味子15g、山楂20g、地黄15g、当归10g、黄连5g、醋延胡索6g、灵芝9g、丹参4g、三七3g、冰片5g、石菖蒲提取物20mg、天麻10g、钩藤10g、莲子心5g、黄芩5g、柴胡50g组成。
本发明的另一目的在于提供一种保护心肌细胞的药物的制备方法，包括以下步骤：
步骤一，取原料药中的黄连、醋延胡索、山楂与一半量的黄芪，粉碎成细粉；
步骤二，其余原料药与剩余黄芪加水煎煮2次，第一次3小时，第二次1.8小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩，放冷，加一倍量乙醇使沉淀；
步骤三，取上清液，回收乙醇，并浓缩至80℃时相对密度为1.0～1.2的清膏；备用；
步骤四，石菖蒲提取物提取后，备用；
步骤五，天麻、钩藤、莲子心、黄芩、柴胡混合后进行超声波提取，将提取后的混合物，与步骤四提取的石菖蒲提取物、步骤三得到的清膏，共同与细粉混合；制得保护心肌细胞的药物。
进一步，所述步骤二中滤液浓缩至80℃时相对密度为1.0～1.2，放冷，加一倍量乙醇使沉淀。
进一步，所述保护心肌细胞的药物一天3次，10天为一疗程。
进一步，步骤四中石菖蒲提取物提取方法包括：
(a)将石菖蒲的干燥根茎粉碎，用90％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；
(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱8个柱体积，再用85％乙醇洗脱10个柱体积，收集85％乙醇洗脱液，减压浓缩得85％乙醇洗脱物浸膏；
(c)步骤(b)中85％乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1、35:1、15:1、10:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；
(d)步骤(c)中组分用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为35:1、25:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；
(e)步骤(d)中组分用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为80％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的石菖蒲提取物。
进一步，所述大孔树脂为ab-8型大孔吸附树脂。
进一步，步骤五中，天麻、钩藤、莲子心、黄芩、柴胡混合后进行超声波提取方法包括：
(1)采用超微粉碎技术将天麻、钩藤、莲子心、黄芩、柴胡粉碎成细粉，备用；
(2)将步骤(1)粉碎的天麻、钩藤、莲子心、黄芩、柴胡细粉加入8-10倍药材重量的水超声提取，提取后滤过，收集滤液；
(3)将步骤(2)中的滤液浓缩至相对密度为1.05-1.25的清膏；
(4)将步骤(3)中的清膏加入乙醇至含醇量为70％,低温静置18h后过滤，收集滤液；
(5)将步骤(4)中的滤液减压浓缩，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.35-1.45的稠膏。
进一步，步骤(1)所述的超微粉碎是指将天麻、钩藤、莲子心、黄芩、柴胡粉碎成粒径为10-20微米的细粉。
进一步，步骤(2)所述的超声提取次数为3次，每次1-1.5h，超声波功率为40-50kw，温度为25摄氏度。
进一步，所述保护心肌细胞的药物制成中药散剂、胶囊剂或片剂。
本发明的优点及积极效果为：能显著促进心肌细胞的生长；能显著降低tnf-α和il-1β的表达；能显著降低心肌细胞ldh含量；本发明药物含药血清可抑制缺氧/复氧损伤乳鼠心肌细胞分泌炎症因子tnf-α、il-1β；减少乳酸脱氢酶的合成，保护心肌细胞缺氧/复氧损伤。将48只8周龄雄性自发性高血压大鼠(shr)随机分为6组，给药。测左室肥厚指数；放免法测局部心肌/血浆血管紧张素ii(angii)、血浆醛固酮(ald)浓度，结果表明本药物组合物及其与福辛普利联用可降低shr心肌细胞凋亡及减轻左室肥厚。
本发明的石菖蒲的有效成分可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。
该石菖蒲的有效成分药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒的其他药物组份。
将本发明的石菖蒲的有效成分以单位体重服用量的形式使用。可通过口服的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等。
本发明的天麻，兰科植物的干燥块茎，具有一定的平肝、止痉等效果。现代药理发现天麻中天麻素是主要有效成分，对于心肌缺血、血栓、感染等具有一定的效果。对心肌细胞的生长具有调理作用。
钩藤为茜草科，钩藤属，植物钩藤、大叶钩藤、毛钩藤、华钩藤和白钩藤的带钩茎枝，具有清热平肝、活血通经、息风定惊等传统功效。现代药理实验表明，钩藤属植物所含化学成分具有降压、镇痛、抗炎、抗肿瘤、镇静、抗氧化等多种作用。对心肌细胞的生长具有调理作用。
莲子心为睡莲科，莲属，植物莲的成熟种子中间的绿色胚根，具有清心、去热、止血、涩精，平和五脏之气的作用。生物碱的药理作用广泛，对心血管系统具有较强的活性，具有抗心律不齐和降压作用。对心肌细胞的生长具有调理作用。
黄芩，唇形科，黄芩属，黄芩的根部。黄芩也具有清热解毒、润肺止咳的功效。现代药理研究表明黄芩抗菌、抗病毒，抗炎、抗过敏，抗肿瘤，抗氧化，对肝脏，神经中枢系统，心血管具有保护作用。对心肌细胞的生长具有调理作用。
本发明药物组合物，配方精当，可以显著地改善血管重构，从而保护血管和心肌细胞的作用，为临床治疗心肌炎症提供一种的选择，应用前景良好。
本发明的柴胡具有清热消炎等功效，可辅助心肌的消炎和恢复，对保护心肌细胞的作用起到良好效果。
本发明通过超微粉碎和超声波提取等现代提取制备技术，有利于天麻、钩藤、莲子心、黄芩、柴胡药材的充分利用,能够节约生产成本，克服传统的直接用水高温煎煮提取的缺陷，提取效率更高，能够有效避免中药材中热敏性成分的降解，提高产品的品质和药效,且工艺相对简便，适于工业化大生产。
附图说明
图1是本发明实施例提供的保护心肌细胞的药物的制备方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
本发明实施例提供的保护心肌细胞的药物由黄芪30g、黄精15g、炙甘草10g、生地15g、麦冬10g、玄参10g、党参20g、桂枝3g、五味子15g、山楂20g、地黄15g、当归10g、黄连5g、醋延胡索6g、灵芝9g、丹参4g、三七3g、冰片5g、石菖蒲提取物20mg、天麻10g、钩藤10g、莲子心5g、黄芩5g、柴胡50g组成。
如图1所示，本发明实施例提供的保护心肌细胞的药物的制备方法包括以下步骤：
s101：取原料药中的黄连、醋延胡索、山楂与一半量的黄芪，粉碎成细粉；
s102：其余原料药与剩余黄芪加水煎煮2次，第一次3小时，第二次1.8小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至80℃时相对密度为1.0～1.2，放冷，加一倍量乙醇使沉淀；
s103：取上清液，回收乙醇，并浓缩至80℃时相对密度为1.0～1.2的清膏；备用；
s104：石菖蒲提取物提取后，备用；
s105：天麻、钩藤、莲子心、黄芩、柴胡混合后进行超声波提取，将提取后的混合物，与步骤四提取的石菖蒲提取物、步骤三得到的清膏，共同与细粉混合；制得保护心肌细胞的药物。
所述s102中滤液浓缩至80℃时相对密度为1.0～1.2，放冷，加一倍量乙醇使沉淀。
所述保护心肌细胞的药物一天3次，10天为一疗程。
s104中石菖蒲提取物提取方法包括：
(a)将石菖蒲的干燥根茎粉碎，用90％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；
(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱8个柱体积，再用85％乙醇洗脱10个柱体积，收集85％乙醇洗脱液，减压浓缩得85％乙醇洗脱物浸膏；
(c)步骤(b)中85％乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1、35:1、15:1、10:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；
(d)步骤(c)中组分用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为35:1、25:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；
(e)步骤(d)中组分用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为80％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的石菖蒲提取物。
所述大孔树脂为ab-8型大孔吸附树脂。
s105中，天麻、钩藤、莲子心、黄芩、柴胡混合后进行超声波提取方法包括：
(1)采用超微粉碎技术将天麻、钩藤、莲子心、黄芩、柴胡粉碎成细粉，备用；
(2)将步骤(1)粉碎的天麻、钩藤、莲子心、黄芩、柴胡细粉加入8-10倍药材重量的水超声提取，提取后滤过，收集滤液；
(3)将步骤(2)中的滤液浓缩至相对密度为1.05-1.25的清膏；
(4)将步骤(3)中的清膏加入乙醇至含醇量为70％,低温静置18h后过滤，收集滤液；
(5)将步骤(4)中的滤液减压浓缩，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.35-1.45的稠膏。
步骤(1)所述的超微粉碎是指将天麻、钩藤、莲子心、黄芩、柴胡粉碎成粒径为10-20微米的细粉。
步骤(2)所述的超声提取次数为3次，每次1-1.5h，超声波功率为40-50kw，温度为25摄氏度。
所述保护心肌细胞的药物制成中药散剂、胶囊剂或片剂。
下面结合实验对本发明的应用效果作详细的描述。
1实验材料与仪器
给药组按本发明制备。dmem培养基，胰蛋白酶，四甲基偶氮唑蓝(mtt)购于美国gibco公司。胎牛血清为杭州四季青公司产品。二甲基亚砜(dmso)购于amresco公司。细胞因子检测试剂盒及乳酸脱氢酶检测试剂盒购自bd公司。
酶标仪(multiskanmk3)购于上海雷勃分析仪器有限公司。紫外可见分光光度计(uv-2501pc)为日本岛津公司产品，细胞培养箱为thermo产品。
2实验方法
2.1含药血清的制备
将20只sd大鼠随机分为5组，以便制作含药血清。a组灌服等量生理盐水；b组灌胃复方丹参片组混悬液563mg/kg体重(112.6mg/只/200g，相当于成人一倍临床等效剂量)，每日1次，连续给药3d；c灌胃本发明实施例1片混悬液563mg/kg体重(112.6mg/只/200g，相当于成人一倍临床等效剂量)，每日1次，连续给药3d；d组灌胃本发明实施例1片混悬液2815mg/kg体重(相当于成人五倍临床等效剂量)每日1次，连续给药3d；e组灌胃本发明实施例1片混悬液5630mg/kg体重(相当于成人十倍临床等效剂量)每日1次，连续给药3d。末次给药后1h，清醒状态下行颈动脉分离插管采血，无菌分离血清，即得含药血清和空白血清，56℃，30min灭活，-20℃存放备用。
2.2大鼠乳鼠心肌细胞原代培养
取出生1—3d的乳鼠，进行心肌细胞的原代培养：无菌条件下取出乳鼠心尖部组织，以0.125％胰酶：0.08％胶原酶＝1：1混和消化液分次消化，用含10％fbs的mem终止消化，200目筛网过滤，800rpm、5min离心2次；沉淀的细胞以dmem重悬后常规孵育1.5h，以差速贴壁培养法纯化细胞；调整细胞浓度为2*106cells/ml接种于6孔或96孔板，常规培养，24h换液1次，4d后细胞成片融合，长满视野90％以上用于实验。
2.3缺氧/复氧模型的建立
预先用高纯氮气(999ml/l)饱和无糖hanks液，通气持续时间40min左右，即为低氧液；用高纯氧(999ml/l)饱和hanks液(通气持续时间40min左右)，即为复氧液。用低氧液置换正常培养液，并将培养板置于密封保鲜袋中，充入高纯氮气造成心肌细胞低氧，封口培养2h；2h后以复氧液置换低氧液，排出氮气并充以高纯氧，继续培养4h即为心肌细胞复氧。
2.4实验分组
取搏动良好的细胞，随机分为正常细胞培养组(正常对照组，即a组，培养于普通细胞培养箱)，缺氧/复氧模型组，置于培养箱中培养，依照“2.1含药血清的制备”中的血清获取情况进行分组：a组：空白组，采用a组大鼠血清(占10％，下同)培养，细胞培养于普通培养箱；m组：模型组，采用a组大鼠血清培养，细胞培养于缺氧/复氧装置中；b组：阳性对照组，采用b组大鼠血清培养，细胞培养于缺氧/复氧装置中；c组：本发明实施例1低剂量组，采用c组大鼠血清培养，细胞培养于缺氧/复氧装置中；d组：本发明实施例1中剂量组，采用d组大鼠血清培养，细胞培养于缺氧/复氧装置中；e组：本发明实施例1高剂量组，采用e组大鼠血清培养，细胞培养于缺氧/复氧装置中。
2.5观察指标及检测方法
elisa法检测tnf-α及il-1β的含量；比色法检测乳酸脱氢酶(ldh)的含量。
2.6统计学分析
所有数据以均数±标准差表示(x±s)，两组间均数比较用t检验，多组间均数比较用单因素方差分析(one-wayanova)，各组间两两比较采用snk-q检验。采用spss17.0统计分析软件进行处理，p<0.05有统计学意义。
3实验结果
3.1mtt法检测本发明对心肌细胞的影响
mtt实验结果发现，与正常对照组比较，缺氧损伤的心肌细胞增殖受到明显影响(p<0.01)。阳性药物和本发明实施例1均能显著促进细胞的生长(p<0.01)，见附图1。
3.2elisa法检测tnf-α及il-1β的含量
取培养上清液，以elisa法检测炎症因子tnf-α、il-1β含量，与正常组相比，模型组心肌细胞tnf-α和il-1β表达显著上升(p<0.01)。与模型组相比，复方丹参组及本发明实施例1各剂量组均能显著降低tnf-α和il-1β的表达(p<0.01，p<0.05)。见表1
表1本发明对缺氧/复氧损伤乳鼠心肌细胞细胞因子表达的影响
注：与正常组比较，*p<0.05，**p<0.01；与缺氧模型组比较，δp<0.05，δδp<0.01。n为重复孔数。
3.3比色法检测乳酸脱氢酶(ldh)的含量变化
取培养上清液，按照试剂盒的要求，采用比色法检测检测ldh含量。预先绘制标准曲线，用以对od值进行定量与正常组相比，模型组心肌细胞ldh含量显著上升(p<0.01)；与模型组相比复方丹参组及本发明实施例1各剂量组均能显著降低心肌细胞ldh含量(p<0.01)。见表2
表2本发明对缺氧/复氧损伤乳鼠心肌细胞ldh的影响
注：与正常组比较，*p<0.05，**p<0.01；与缺氧模型组比较，δp<0.05，δδp<0.01。n为重复孔数。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。