本发明涉及用于在治疗癌症中使用的dna修复和核酸编辑机制的调节。本发明涉及用于治疗癌症的dna修复失活和机制。本发明还涉及筛选新的抗癌剂。
背景技术：
：尽管已经存在可用的广泛癌症治疗方法，但仍需要鉴定新抗癌剂的新靶标和机制，所述新抗癌剂提供了治疗癌症的增加的成功率。此外，当用抗癌靶向剂攻击转移性癌症时，几乎总是出现对药物不敏感的细胞子集。因此，在大多数情况下，靶向疗法仅在患者中短暂有效。因此，预防或克服抗性的策略对于设计新一代临床试验至关重要。克服几乎确定使用靶向剂治疗后疾病还复发的问题仍然是癌症治疗的主要问题。因此，除了用于新诊断的癌症患者的第一线治疗的新抗癌靶向剂之外，还需要鉴定新的靶标和机制以限制抗药性的出现并导致长期有效的治疗反应。技术实现要素：诸位发明人已经发现，在小鼠模型肿瘤细胞系中，通过mmr基因mlh1在本文中例示的dna修复基因的失活导致这些细胞系在注射至免疫活性同基因小鼠中时不能形成肿瘤。虽然不希望受任何理论束缚，但诸位发明人已经确定当宿主cd-8t细胞同时被抑制时肿瘤形成能力得到恢复，这表明宿主免疫系统在肿瘤生长抑制中的作用。诸位发明人已经发现，在具有失活的dna修复基因(例如mmr基因)的细胞中，dna突变(以及因此相应的新抗原)谱随时间动态地演变。这将导致宿主免疫系统的进行性和反复参与。这导致了一线肿瘤疗法的新型策略。此外，对现有抗癌剂的抗性的可能发展因此通过新t细胞库所吸引的新抗原的动态出现来抵消。虽然以dna修复基因为例，但本发明还可涉及任何基因或蛋白质产物，所述任何基因或蛋白质产物的失活或调节导致突变率或负荷增加(如动态突变负荷的增加)或导致新抗原产生的增加。例如，由于几种核酸编辑酶的功能影响呈递给免疫系统的抗原的丰度和种类，这些酶的调节也可有利地增加宿主免疫系统介导对肿瘤的抗应答的倾向。因此，在第一方面，提供了一种用于治疗癌症的方法，其包括：a)提供i)具有癌细胞的受试者，和ii)基因或其蛋白质产物的修饰物，其中所述基因是一种这样的基因，它的调节导致t细胞对肿瘤组织的基于抗原的识别在治疗上有利的增加；并且b)用所述修饰物治疗所述受试者；其中所述治疗减少所述受试者中癌细胞的数量。适当地，在以上部分(a)中定义的基因可以是参与酶机制如核酸编辑、修复或修饰的任何基因(或其蛋白质产物)。合适的编辑酶包括参与rna编辑的adar家族酶，以及编辑dna的apobec或aicda家族酶。因此，在另一方面，提供了一种用于治疗癌症的方法，包括：a)提供i)具有癌细胞的受试者，和ii)dna修复或核酸编辑基因或其蛋白质产物的修饰物；并且b)用所述修饰物治疗所述受试者；其中所述治疗减少所述受试者中癌细胞的数量。在另一方面，提供了一种用于治疗癌症的方法，包括：a)提供i)具有癌细胞的受试者，和ii)dna修复基因或其蛋白质产物的修饰物；并且b)用所述修饰物治疗所述受试者；其中所述治疗减少所述受试者中癌细胞的数量。适当地，可以通过检测肿瘤质量或大小的减少来确定受试者中癌细胞数量的减少。癌细胞数量的减少也可以通过任何指示成功的癌症疗法的临床终点来确定，例如与在没有进行所述治疗的类似个体中观察到的平均存活率相比，没有肿瘤再发或复发或者存活率增加。在一个实施例中，具有癌细胞的受试者是具有这样一种肿瘤的受试者，所述肿瘤在dna修复或核酸编辑方面无缺陷，即所述肿瘤不是已经鉴定出dna修复或核酸编辑缺陷的肿瘤。本领域技术人员通晓用于鉴定肿瘤样品中dna修复或核酸编辑缺陷的方法。因此，在具体的实施例中，具有癌细胞的受试者是具有例如没有mlh-1缺陷的肿瘤的受试者。在一个实施例中，dna修复或核酸编辑基因或其蛋白质产物的修饰物是dna修复或核酸编辑基因或其蛋白质产物的激活剂。在该实施例中，dna修复基因可以选自dna聚合酶，包括参与跨损伤合成的那些，例如dnapolη，ι和κ。核酸编辑基因可以选自以某种方式编辑或改变dna或rna的酶，所述方式导致突变基因产物的存在或表达增加。这种核酸编辑基因可以是rna编辑酶。此处合适的基因包括例如adar(rna特异性的腺苷脱氨酶)酶和apobec酶(如apobec1、apobec3a、apobec3b、aicda)。在另一个实施例中，dna修复或核酸编辑基因或其蛋白质产物的调节剂是该基因或其蛋白质产物的失活剂。本文给出了dna修复基因的实例。在一个实施例中，dna修复基因是mmr基因，例如mutl同源物。合适的mutl同源物包括例如mlh1、mutlα、mutlβ、mutlγ、pms1、pms2或mlh3。在一个实施例中，dna修复基因是mlh1。在另一个实施例中，dna修复基因可以是校正dna聚合酶(例如，pole、pold或polq)或者同源重组酶(如brca1或brca2)。本文给出了核酸编辑基因的实例。适当地，根据本发明的任何方面或实施例使用的“修饰物”是多肽、多核苷酸、抗体、肽或小分子化合物。在本发明任何方面的一个实施例中，dna修复或核酸编辑基因的修饰物可以是通过在通过改变其遗传密码来修饰所述基因表达的层面上改变所述基因来进行调节的分子。用于修饰基因表达的合适方法是本领域技术人员已知的，并且包括使用基因组编辑方法。例如，可以使用基于crispr的基因组编辑途径敲除或调节基因。本文描述了用于基因组编辑的合适方法。在一个实施例中，本文描述的那些特定基因组编辑构建体可用于根据本发明的方法。用于从特定基因敲除或修饰基因表达的其他方法包括使用干扰rna途径。在本发明任何方面的一个实施例中，dna修复基因的失活剂可以是一种分子，所述分子通过在使所述基因的表达沉默或敲除的层面上失活所述基因来提供失活。用于敲除基因表达的合适方法是本领域技术人员已知的，并且包括使用基因组编辑方法。例如，可以使用基于crispr的基因组编辑途径敲除基因。本文描述了用于基因组编辑的合适方法。在一个实施例中，本文描述的那些特定基因组编辑构建体可用于根据本发明的方法。用于从特定基因敲除或减少基因表达的其他方法包括使用干扰rna途径。在一个实施例中，根据本发明治疗的癌症是mmr+ve癌症。在一个实施例中，本发明提供了用于治疗癌症的方法，其中dna修复或核酸编辑基因或其蛋白质产物的修饰物作为治疗的一部分与另一种不同的或第二癌症治疗组合提供。因此，提供了治疗有需要的受试者的癌症的方法，包括向所述受试者给予治疗有效量的a)dna修复基因或其蛋白质产物的修饰物，和b)不同的(即另外的或第二)癌症治疗。可以单独地、同时或依次提供不同的/其他(即另外的/第二)癌症治疗。适当地，不同的癌症治疗是使其他dna修复机制失活的治疗，例如通过使mmr基因失活。本领域技术人员通晓使mmr基因失活的化合物，并且所述化合物包括例如替莫唑胺(tmz)或mnu或其衍生物。在替莫唑胺和其他类似化合物的情况下，可以认识到它不直接使dna修复失活，但是获得的对tmz暴露的抗性导致dna修复的失活。在另一个实施例中，所述不同的癌症治疗可以是免疫疗法，即使用免疫系统治疗癌症的疗法。本领域技术人员已知多种免疫疗法途径。特别地，充当免疫检查点即影响免疫系统发挥功能的化合物(例如，肽、抗体、小分子等)可以与根据本发明的治疗方法组合使用。例如，免疫检查点疗法可以阻断抑制性检查点以恢复免疫系统功能。作用于免疫检查点的化合物的合适靶标包括，例如，程序性细胞死亡1蛋白(pdcd1，pd-1；也称为cd279)及其配体，pd-1配体1(pd-l1，cd274)。pd-l1在t细胞活性中发挥关键的调节作用，并且已经观察到细胞表面上癌症介导的pd-l1上调抑制了原本可能攻击癌细胞的t细胞。已经开发出治疗性抗体，其与pd-1或pd-l1结合，以允许t细胞通过阻断这种抑制作用来攻击肿瘤。因此，与根据本发明的治疗方法组合使用的合适化合物包括抑制pd-1途径的治疗性抗体，如抗pd1抗体(例如，纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab))和抗pdl-1抗体。其他抗体包括靶向ctla-4的那些抗体，例如，抗ctla-4抗体。可以开发其他免疫检查点疗法以用于类似的免疫检查点靶标。在一个实施例中，与dna修复的修饰物组合使用的免疫疗法可以是靶向免疫系统的分子的组合，例如，抗pd1与抗ctla-4或抗pdl-1等的组合。在本发明的一个实施例中，错配修复基因的失活剂是替莫唑胺、mnu或其衍生物。在另一方面，本发明提供用于筛选抗癌化合物的方法，所述方法包括a)提供表达dna修复基因的细胞，b)在测试化合物的存在下孵育所述细胞，c)在测试化合物的存在下测量dna突变率；d)其中与在不存在测试化合物情况下测量的细胞中dna突变率相比，在测试化合物的存在下细胞中dna突变率的增加表明测试化合物是抗癌化合物。本发明还提供用于筛选抗癌化合物的方法，所述方法，包括包括a)提供表达dna修复或核酸编辑基因的细胞，b)在测试化合物的存在下孵育所述细胞，c)在测试化合物的存在下测量dna突变率；d)其中与在不存在测试化合物情况下测量的细胞中dna突变率相比，在测试化合物的存在下细胞中dna突变率的增加表明测试化合物是抗癌化合物。适当地，在根据这些方面的方法中，如步骤a)中所述的表达dna修复或核酸编辑基因的细胞可以进一步包含在简单核苷酸序列下游的构建体中框外放置的报告物构建体。在一个实施例中，与不存在测试化合物的情况下的读出相比，增加的突变率被鉴定为来自报告物构建体的增加的读出。在另一方面，因此提供了用于筛选dna修复或核酸编辑基因或其蛋白质产物的修饰物的方法，所述方法包括：a)提供构建体，其中包含在报告物编码序列上游的经克隆的简单核苷酸序列，使得所述报告物编码序列在框外；b)用a)所述的构建体与包含dna修复或核酸编辑基因的构建体组合转染细胞c)在测试化合物的存在下孵育所述细胞；d)测量来自报告物构建体的信号；e)其中，与不存在所述测试化合物的情况下的信号相比，在所述测试化合物的存在下来自所述报告物构建体的信号的增加表明所述测试化合物是所述dna修复或核酸编辑基因或其蛋白质产物的修饰物。适当地，“简单核苷酸序列”可以是任何基因组重复序列，其已知是复制错误的位点，例如，已知在dna复制过程中积累错配的位点。合适的基因组重复序列包括被鉴定为微卫星区的那些序列，例如微卫星重复序列或与复制修复缺陷相关的或指示复制修复缺陷的序列。合适的此类序列包括聚a序列，如a(17)。在另一个实施例中，可以使用二核苷酸重复序列，例如ca或gt，特别是ca(n)，其中n可以是任何数。在一个实施例中，二核苷酸重复序列是ca(14)或ca(20)，也称为ca(n)重复“段”序列。还设想了其他重复序列，如三核苷酸重复序列。适当地，报告物编码序列是编码报告物部分的核酸序列。合适的报告物部分是本领域技术人员通晓的，并且包括可选择性标志物。报告物部分的实例包括β-半乳糖苷酶、等。有利地，报告物部分是具有大的且呈线性的动态范围的报告物，使得表达的框内报告物部分的数量的小变化产生阳性信号，从而允许灵敏的测定。合适的可选择性标志物是本领域技术人员通晓的，并且包括抗生素抗性基因和药物选择标志物，例如编码抗生素(如嘌呤霉素、g418、潮霉素、杀稻瘟素、嘌呤霉素、博莱霉素或新霉素)抗性的那些基因。有利地，使用可选择性标志物允许检测到存活信号，即当在抗生素存在下生长时仅以下这些细胞将会存活，在所述这些细胞中测试化合物充当dna修复或核酸编辑基因或其蛋白质产物的修饰物。适当地，用于在根据本发明的筛选方法中使用的细胞是哺乳动物细胞系。合适的哺乳动物细胞系包括hek293细胞，如hek293a、ft或t细胞，但也设想了其他细胞系。用于根据本发明的筛选方法的合适的dna修复或核酸编辑基因描述于本文中，并且包括例如编码参与复制后dna修复的dna修复酶的那些基因，如编码mmr酶的那些基因(包括例如mlh-1)。在这些方面，测试化合物可以是候选抗癌化合物，因为它有效地减少或修饰dna修复或核酸编辑基因的表达，或者有效地充当dna修复基因的蛋白质产物的抑制剂或修饰物，以抑制或改变dna修复活性，或以其他方式动态产生增加的细胞突变负载。本文描述了合适的筛选方法的实例以及在实例部分中用于测量dna突变率的合适方法的实例。dna突变可以测量为dna的突变/兆碱基(mb)数。例如，dna错配修复或核酸编辑酶的功能性失活可以通过对重复dna元件或cdna进行测序来确定。与未处理的细胞相比，用测试化合物处理的细胞的外显子组测序可用于测量突变负荷。例如，可以进行在不同时间点纵向收集的细胞的外显子组测序。重要的是，dna突变或cdna表观突变的增加速率不仅导致突变和抗原数量的增加，而且还导致由于dna修复失活或修饰或核酸编辑修饰而随时间获得新突变。这导致动态超突变状态。因此，突变(以及因此相应的新抗原)谱优选随时间动态地发展，使得基因组景观随着新抗原的不断出现而快速且动态地演变。在一个实施例中，可以在处理的细胞中观察到高突变负荷，从而表明测试化合物是候选抗癌剂。适当地，高突变负荷可以表示为突变率，其中增加的dna突变率位于dna的10-100个突变/兆碱基的区域中。在另一个实施例中，增加的突变负载可以位于dna的超过100个突变/兆碱基的区域中。例如参考图4a描述了用于测定突变率的方法。rnaseq分析也可用于鉴定转录的且因此可以充当新抗原的突变基因的比例。也可以使用微卫星不稳定性测定。在根据本发明的筛选方法的一个实施例中，表达dna修复基因的细胞可以是人肿瘤细胞系，例如结直肠癌、乳腺癌细胞。适当地，dna修复基因是mlh1。在该实施例中，例如通过由于候选抗癌化合物的处理而抑制基因表达或蛋白质活性而丧失mlh1表达或mlh1活性的细胞对如图5a所示的抑制剂不敏感。因此，例如，mmr缺陷型细胞不受影响或对许多抗癌剂(如表2中列出的那些)具有更强的抗性。在一个实施例中，dna突变率是增加的动态突变负荷率。适当地，这种增加的比率表示新抗原的表达。在另一方面，提供了一种鉴定具有适合于通过免疫疗法治疗的肿瘤的患者的方法，所述方法包括：a)取得所述肿瘤的样品，b)分析所述样品以确定dna修复基因的序列；c)将肿瘤样品中所述dna修复基因的序列与非肿瘤样品中的序列进行比较；其中肿瘤样品中所述dna修复基因的序列与非肿瘤样品中所述基因的序列相比的缺陷表明所述患者具有适合于通过免疫疗法治疗的肿瘤。在一个实施例中，检测到dna修复基因中的突变。这种“突变”可以是dna修复基因的全部或部分缺失或点突变以使其失活。在另一方面，用于鉴定具有适合于通过免疫疗法治疗的肿瘤的患者的方法包括通过测量高突变率来检测功能失调的dna修复。特别地，提供了一种方法，其允许从患者的样品中确定是否存在突变状态的动态变化。在另一方面，本发明提供了治疗个体的癌症的方法，包括基于突变率的高度测量来诊断该个体中的癌症亚型；以及用免疫治疗组合物治疗所述个体。在另一方面，提供了dna修复或核酸编辑基因的失活剂，其中所述失活剂包含干扰所述dna修复或核酸编辑基因表达的构建体。合适的失活剂包括crispr构建体，如作为mlh-1的失活剂的如本文所述的crispr构建体。其他合适的失活剂包括载体编码的sirna或反义寡核苷酸。具体实施方式癌症基因通常分为两大类：癌基因和肿瘤抑制基因。大多数癌基因控制信号传导途径的关键节点，并被点突变改变，这些点突变组成性地激活其蛋白质对应物，从而导致细胞增殖增加。1肿瘤抑制基因通常具有失活其功能的分子改变，如缺失或丧失功能突变。2许多肿瘤抑制基因参与修正细胞分裂过程中发生的dna复制错误。4dna修复基因的改变不直接促进细胞增殖，但被认为通过增加突变率推动肿瘤发生，从而加速癌症进展。5控制dna错配修复(mmr)的基因中的种系突变是癌症综合征的原因，如遗传性非息肉病性结肠癌(hnpcc)。受hnpcc影响的个体发生早期肿瘤，并且具有增加的结肠直肠、子宫内膜、泌尿道、卵巢和胰腺肿瘤的寿命。6当体细胞突变时mmr基因也促进肿瘤进展。3,6,7约20％散发性结直肠癌、29％卵巢癌和28％子宫内膜癌携带mmr基因的体细胞改变。8,9在人类细胞中，复制后dna错配修复由蛋白质复合物进行，所述蛋白质复合物包括mlh1、msh2、msh6和pms2。10当mmr机构有缺陷时，细胞以增加的速率积累突变并显示特征性微卫星不稳定性(msi)。mmr缺陷型结直肠肿瘤具有特殊的临床特征，其包括早发和快速进展但良好的预后。11这些明显矛盾的临床特征的分子基础以前知之甚少。在癌症患者中，对靶向化学治疗剂的反应通常是剧烈但短暂的，并且大多数患者在数周或数月内复发，这可能以对化学治疗剂的部分抗性为特征。与使用靶向剂的化学疗法相比，免疫疗法的最显著特征是反应的时间长短，其通常持续数年。因此，这降低了疾病复发和发病以及推动在原发病诊断的部位进行广泛手术的可能性。因此，召集患者免疫系统以攻击肿瘤细胞的抗癌疗法策略是针对靶向化学治疗剂的改进。然而，肿瘤细胞仍可能对免疫调节剂产生抗性。这可通过一种策略来规避，该策略促进被新的t细胞库吸引的新肿瘤抗原的不断出现，从而不断重新吸引患者的免疫应答来攻击肿瘤细胞。因此，dna修复或核酸编辑机制的失活或调节导致作为免疫监视的核心的动态超突变状态，或诱导对免疫监视敏感的突变体表型，是抗癌疗法的新策略。修饰物术语修饰物是指这样的测试化合物，与在不存在该化合物的情况下的活性相比，在该化合物存在下改变dna修复或核酸编辑基因或其蛋白质产物的活性。适当地，“修饰物”可以是dna修复或核酸编辑基因或其蛋白质产物的激活剂或失活剂。例如，激活剂可以是增强dna修复或核酸编辑基因或其蛋白质产物的活性的激活剂，而失活剂可以这样一种失活剂，其通过抑制dna修复或核酸编辑基因编码的蛋白质的酶活性，或通过稳定共价酶-dna复合物使得不能进行修复来减少dna修复或核酸编辑活性。如上定义的修饰物是用于通过在基因、rna或蛋白质水平上起作用来修饰组分的化合物。特别地，对如本文所述的肿瘤抑制“基因”如dna修复或核酸编辑“基因”的提及是指基因本身以及该基因编码的蛋白质(即其蛋白质产物)。用于确定化合物是否是dna修复或核酸编辑基因/蛋白质的修饰物的方法包括用于检测与特定的感兴趣dna修复或核酸编辑基因的结合的方法，本领域技术人员通晓的特定dna修复或核酸编辑基因/蛋白质的功能测定以及通过测量突变增加来检测dna修复或核酸编辑基因/蛋白质的缺陷的方法。本文描述了用于检测突变增加的合适方法，并且所述方法包括用于测量随时间的微卫星移位的方法。在本发明的其他方面或实施例中，提供了用于治疗的dna修复或核酸编辑基因的修饰物。在其他方面或实施例中，本发明提供了用于治疗癌症的修饰物。在其他方面或实施例中，本发明提供了dna修复或核酸编辑基因的修饰物在制造用于治疗癌症的药物中的用途。在一些实施例中，所述修饰物可以用于组合疗法中。dna修复机制在本发明任何方面的一个实施例中，本发明提供修饰肿瘤抑制基因，如参与dna修复的那些基因。适当地，本发明可以涉及其失活会导致突变率或负荷增加(如动态突变负荷的增加)的任何基因。在细胞中，dna易受可导致突变的许多化学变化的影响，并且存在参与dna修复机制的基因及其蛋白质产物的网络以纠正受损或不适当的碱基，使得突变不会积累。“dna修复基因”是编码参与dna修复机制的蛋白质的那些基因。如本文所用，术语“dna修复基因”是指基因以及它们编码的蛋白质。dna修复机制包括1)损伤的直接化学逆转和2)切除修复。在切除修复中，去除受损的碱基或多个碱基，然后在dna合成的局部区域中替换/纠正。切除修复包括碱基切除修复(ber)、核苷酸切除修复(ner)和错配修复(mmr)，每种修复都使用特定的酶组。据报道，大量基因参与dna修复机制。这些基因可以根据功能广泛地分组，例如，非同源末端接合(nhej)基因，包括xrcc4、lig4、dna-pk；微同源介导的末端接合(mmej)基因，包括mreii、xrcc1、lig3；同源重组(hr)基因，包括brca1、brca2、rad51、lig1；错配修复(mmr)基因，包括mlh1、msh2、pms2；碱基切除修复(ber)基因，包括尿嘧啶dna-糖基化酶、ap-内切核酸酶；核苷酸切除修复(ner)基因，包括xpc、xpd、xpa；dna交联修复基因，包括fanca、fancb、fancc；dna修复检查点基因，包括atm、atr和p53。其他基因包括编码dna聚合酶的基因。有两类可能参与dna修复的聚合酶：1)通读错误的那些聚合酶，允许它们保留，以及2)验证读取的那些聚合酶。验证读取的那些聚合酶是参与跨损伤合成的聚合酶，包括dna-polη，ι和κ。在本发明的实施例中，其中dna修复基因是参与跨损伤合成的聚合酶，提供了所述dna修复基因和/或它们编码的蛋白质的激活剂。对于那些验证读取的聚合酶，其包括例如pole、pold和polq，本发明提供了这些基因和/或它们编码的蛋白质的失活剂。可能参与dna修复机制的基因列于以下表1中：表1续在本发明的一个实施例中，dna修复基因是mmr基因，即其蛋白质产物参与错配修复(mmr)的基因。合适的基因包括mlh1、msh2和pms2。在一个实施例中，dna修复基因可以是msh3、msh6、atr、rad50、pole、pold、fancm、atm、prkdc、polq或dnmt1。适当地，修饰dna修复基因/蛋白质以使其失活导致dna突变(以及因此相应的新抗原)谱随时间动态地演变。在一个实施例中，修饰导致新抗原(肿瘤抗原)的产生。在一个实施例中，本发明涉及可通过失活dna修复基因/蛋白质实现的“动态”突变负荷的增加。可以在许多不同水平下测量dna修复基因的修饰。在一个实施例中，可以进行功能测定以分析，例如测试化合物与dna修复基因编码的蛋白质结合的能力和/或该测试化合物抑制该基因功能的能力。本领域技术人员通晓参与dna修复的特定类型的蛋白质的合适测定。例如，可利用非同源末端接合(nhej)、微同源介导的末端结合(mmej)、同源重组(hr)、错配修复(mmr)、碱基切除修复(ber)、核苷酸切除修复(ner)、dna交连修复、dna修复检查点和dna聚合酶的测定。在另一个实施例中，dna修复基因的修饰可以通过测量dna突变，以及特别是通过测量突变率来测定。本文描述了用于测定突变积累或突变率的合适方法。在一个实施例中，可以通过测量新抗原的数量来测定增加的突变率。适当地，在根据本发明的治疗中，以治疗有效量提供dna修复基因或蛋白质的修饰物。术语“治疗有效量”是指所给予的化合物的量，所述化合物将在一定程度上缓解所治疗的疾病或病症的一种或多种症状。在一个实施例中，治疗可以相对延长，例如，超过几个月。在本文中，术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓或逆转疾病或病症的进展，基本上改善疾病或病症的临床症状或基本上预防疾病或病症的临床症状的出现。在给予作为根据本发明的治疗的一部分的修饰物之前，可以筛选患者以确定患者患有或可能患有的癌症是否是以活性形式的dna修复基因或酶的存在为特征的癌症。例如，癌症可以被鉴定为mmr+ve癌症，即一种癌症，其中参与mmr的那些基因作为肿瘤发展的一部分是活性的和/或存在的或没有丢失。可以使用本领域技术人员通晓的方法检测参与dna修复过程(如mmr)的基因的存在，并且所述方法包括例如pcr方法。短语“药物的制造”包括直接作为药物的上述化合物，以及它在其他活性剂的筛选程序中或在制造这种药物的任何阶段中的使用。核酸编辑机制在本发明任何方面的一个实施例中，本发明提供修饰基因，如参与核酸编辑的那些基因。适当地，本发明可涉及任何基因，所述基因调节导致dna突变率或负荷或rna水平的表观突变的增加。除了诱导蛋白质产物(其编码种系编码基因的突变体变体)改变的表达的外在因素如辐射或化学诱变剂，还存在可逆或不可逆地改变编码蛋白质补体的多种内在机制。在核酸编辑的内源过程中，某些核苷酸碱基根据酶活性转换为备选碱基。可能参与核酸编辑机制的基因列于以下表2中：基因符号基因idadar103adarb1104adarb2105adarb2-as1642394apobec3d140564apobec3b9582apobec3c27350apobec3g60489apobec3f200316apobec3a200315apobec3h164668apobec1339a1cf29974apobec210930apobec4403314apobec3ap1105377532apobec3b-as1100874530在本发明的一个实施例中，核酸编辑基因是激活诱导的胞苷脱氨酶基因(aid或aicda)，其被免疫系统的体细胞用于通过诱导igg体细胞超突变和类切换重组不可逆地修饰免疫球蛋白基因的编码组成和多样性。虽然内源性aicda基因及其同源物用于拓宽健康体细胞的遗传多样性，但该基因的活性还可在b细胞恶性肿瘤(包括一些显现呈现新型抗原的b细胞恶性肿瘤)中引入致癌体细胞突变。多种附加的核酸编辑酶显现影响天然和致癌的dna改变。在本发明的另一个实施例中，核酸编辑基因是载脂蛋白b编辑胞苷脱氨酶(apobec)基因家族的成员；这些基因被正常细胞用于将信使rna中的胞苷碱基编辑和转换为尿嘧啶，所述尿嘧啶诱导天然基因的新的转录后同种型。此外，apobec家族的酶活性显现在沉默和限制人类病毒和内源性逆转录病毒二者的活性中发挥原始作用。与aicda基因一样，apobec酶活性好像同样影响致癌dna突变：人类癌症的一个主要子集显示出与升高和假性apobec活性一致的突变模式。此处，apobec酶很可能修饰dna复制和dna损伤期间间歇存在的单链dna末端的碱基。因此，多种人类癌症和人类癌症抗原很可能是由过量的apobec酶活性引起的。在本发明的另一个实施例中，核酸编辑酶是rna编辑腺苷脱氨酶酶家族(adar)基因之一，其显现也在蛋白质表达的正常和致癌转录后改变中发挥作用。同样，在几种情况下，adar基因在dsrna病毒应答中的天然功能显现被破坏，其中酶活性引入腺苷以进行肌苷碱基改变，其改变内源mrna的编码潜力。在癌细胞如肝细胞癌以及自身免疫性疾病中，可观察到改变的adar酶活性和随后mrna含量的变化超过其种系dna编码配置。可以编辑核酸的其他分子包括剪接因子。还可以设想用于trna修饰的adat。适当地，核酸编辑机制的修饰将导致dna突变或rna表观突变谱随时间动态地演变，并因此相应地改变新抗原向免疫系统的表达和呈递。在一个实施例中，修饰导致新抗原(肿瘤抗原)的产生。在一个实施例中，本发明涉及可通过失活dna修复基因/蛋白质实现的“动态”突变负荷的增加。在另一个实施例中，核酸编辑基因的修饰可以通过测量dna或rna突变，特别是通过测量突变率来确定。此类突变可包括点突变、移码突变和由于同源重组而产生的突变。本文描述了用于测定突变积累或突变率的合适方法。在一个实施例中，可以通过测量新抗原的数量来测定增加的突变率。适当地，在根据本发明的治疗中，以治疗有效量提供核酸编辑基因或蛋白质的修饰物。术语“治疗有效量”是指所给予的化合物的量，所述化合物将在一定程度上缓解所治疗的疾病或病症的一种或多种症状。在一个实施例中，治疗可以相对延长，例如，超过几个月。在本文中，术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓或逆转疾病或病症的进展，基本上改善疾病或病症的临床症状或基本上预防疾病或病症的临床症状的出现。在给予作为根据本发明的治疗的一部分的修饰物之前，可以筛选患者以确定患者患有或可能患有的癌症是否是以改变形式的核酸编辑基因或酶的存在为特征的癌症。例如，癌症可以被鉴定为显示出aicda-apobec依赖性或“kataegis”dna超突变的癌症，即这样一种癌症，其中参与核酸酶aicda或apobec的那些基因作为肿瘤发展的一部分被改变。可以使用本领域技术人员通晓的方法检测参与核酸编辑过程的基因的存在，并且所述方法包括例如pcr方法。短语“药物的制造”包括直接作为药物的上述化合物，以及它在其他活性剂的筛选程序中或在制造这种药物的任何阶段中的使用。测试化合物在根据本发明任何实施例的任何方面的测定中使用的测试化合物可以是蛋白质或多肽、多核苷酸、抗体、肽或小分子化合物。在一个实施例中，该测定可以包括筛选测试化合物的文库，例如蛋白质、多肽、多核苷酸、抗体、肽或小分子化合物的文库。测试化合物还可以包含核酸构建体，如crispr构建体、sirna分子、反义核酸分子等。合适的高通量筛选方法是本领域技术人员已知的。用于鉴定可用作根据本发明的任何方面或实施例的dna修复或核酸编辑基因或蛋白质的修饰物的合适测试化合物的其他方法包括合理设计化合物。在该途径中，用于筛选的化合物文库可以基于从以下这些化合物开始，所述化合物已知结合和/或抑制/失活或者增强/激活与感兴趣的dna修复或核酸编辑基因具有结构相似性或同源性的分子。例如，mlh1的结构分析表明它与细菌酶dna旋转酶具有结构同源性。因此，合理的药物设计途径可以从以下开始：将已知的dna旋转酶的抑制剂作为基础来衍生化合物文库以在根据本发明的筛选方法中进行测试。该方法的合适起点描述于例如，collin等人,applmicrobiolbiotechnol(2011)92:479-497。组合在本发明任何方面的一个实施例中，使用用于修饰例如，激活或失活dna修复或核酸编辑基因或蛋白质的化合物进行治疗可以作为单独的疗法例如作为单一疗法提供。在其他实施例中，用于修饰dna或核酸编辑修复基因的化合物可以与另一种不同的癌症疗法组合使用。因此，可以采用用于修饰所给予的dna修复或核酸编辑基因的化合物给予患有癌症的个体初始治疗，如化学疗法，以在治疗后的快速抗性生长期中有效。特别地，本发明包括dna修复或核酸编辑基因的修饰物与免疫检查点抑制剂的组合。如本文所述，化学治疗剂或天然产物例如mnng、6tg、替莫唑胺可有效地选择用于癌细胞，在所述癌细胞中mmr基因将会失活。癌症的类型可以治疗的癌症(及其良性对应物)的实例包括但不限于上皮源肿瘤(腺瘤和各种类型的癌，包括腺癌、鳞状细胞癌、移行细胞癌和其他癌)，如膀胱癌和泌尿道癌、乳腺癌、胃肠道(包括食道、胃(胃部)、小肠、结肠、直肠和肛门)癌、肝癌(肝细胞癌)、胆囊和胆系统癌、外分泌胰腺癌、肾癌、肺癌(例如腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、支气管肺泡癌和间皮瘤)、头颈癌(例如舌癌、口腔癌、喉癌、咽癌、鼻咽癌、扁桃体癌、唾液腺癌、鼻腔癌和鼻窦癌)、卵巢癌、输卵管癌、腹膜癌、阴道癌、外阴癌、阴茎癌、宫颈癌、子宫肌层癌、子宫内膜癌、甲状腺癌(例如甲状腺滤泡癌)、肾上腺癌、前列腺癌、皮肤和附属器官癌(例如黑素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、角化棘皮瘤、异常增生痣)；血液系统恶性肿瘤(即白血病、淋巴瘤)和恶化前血液病以及边缘恶性肿瘤，包括血液系统恶性肿瘤和淋巴系的相关病况(例如急性淋巴细胞白血病[all]、慢性淋巴细胞白血病[cll]、b细胞淋巴瘤(如弥漫性大b细胞淋巴瘤[dlbcl])、滤泡性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤和白血病、自然杀伤[nk]细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、毛细胞白血病、原因不明的单克隆丙种球蛋白病、浆细胞瘤、多发性骨髓瘤和移植后淋巴组织增生性疾病)，以及血液系统恶性肿瘤及髓系相关病况(例如急性髓性白血病[aml]、慢性髓性白血病[cml]、慢性粒单核细胞白血病[cmml]、嗜酸性粒细胞增多症、骨髓增生性疾病(如真性红细胞增多症、原发性血小板增多症和原发性骨髓纤维化、骨髓增生综合征、骨髓增生异常综合征)和早幼粒细胞白血病)；间充质来源的肿瘤，例如软组织、骨或软骨的肉瘤，如骨肉瘤、纤维肉瘤、软骨肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、尤文氏肉瘤、滑膜肉瘤、上皮样肉瘤、胃肠道间质瘤、良性和恶性组织细胞瘤和皮肤纤维肉瘤突起；中枢或周围神经系统肿瘤(例如星形细胞瘤、胶质瘤和胶质母细胞瘤、脑膜瘤、室管膜瘤、松果体瘤和神经鞘瘤)；内分泌肿瘤(例如垂体肿瘤、肾上腺肿瘤、胰岛细胞瘤、甲状旁腺肿瘤、类癌肿瘤和甲状腺髓样癌)；眼和附属肿瘤(例如视网膜母细胞瘤)；生殖细胞和滋养细胞肿瘤(例如畸胎瘤、精原细胞瘤、无性细胞瘤、葡萄胎和绒毛膜癌)；以及小儿和胚胎肿瘤(例如成神经管细胞瘤、神经母细胞瘤、肾母细胞瘤和原始神经外胚层肿瘤)；或先天性的或使患者易患恶性肿瘤的其他综合征(例如着色性干皮症)。在一个实施例中，用于根据本发明的治疗的肿瘤可以是在dna修复或核酸编辑基因中具有突变的肿瘤。例如，遗传性非息肉病性结肠癌(hnpcc)是包含控制mmr的基因的种系突变的遗传性癌症综合征。因此，hnpcc是可以根据本发明或使用根据本发明的筛选方法鉴定的化合物治疗的一种癌症综合征。本领域技术人员通晓具有dna修复基因的突变的其他合适的癌症。具有mmr基因的改变的其他癌症描述于例如xiao等人(2014)和okuda等人(2010)中，并且包括散发性结直肠癌、卵巢癌和子宫内膜癌。在一个方面，本发明还提供了通过鉴定具有dna修复或核酸编辑机制缺陷的患者来选择最可能响应免疫治疗途径的那些个体的方法。因此，可以筛选患者以确定患者患有或可能患有的癌症是否是以升高的dna突变水平为特征并且因此易于用具有免疫调节途径的化合物(如那些免疫检查点抑制剂)治疗的癌症。例如，可以进行诊断测试。适当地，可以分析取自患者的生物样品以确定患者患有或可能患有的癌症是否是以遗传异常或异常蛋白质表达(其导致突变率增加)为特征的癌症。可以例如使用如本文所述的微卫星分析通过测量随时间变化的突变数来确定增加的突变率。诊断测试通常在选自肿瘤活检样品、血液样品(分离和富集脱落的肿瘤细胞)、粪便活检、痰液、染色体分析、胸膜液和腹膜液的生物样品上进行。本发明的其他方面和实施例在以下条款中阐述：1.一种用于治疗癌症的方法，包括：a)提供i)具有癌细胞的受试者，和ii)dna修复基因或其蛋白质产物的修饰物；并且b)用所述修饰物治疗所述受试者，其中所述治疗减少所述受试者中癌细胞的数量。2.根据条款1所述的方法，其中dna修复基因或其蛋白质产物的修饰物是激活剂。3.根据条款2所述的方法，其中所述dna修复基因编码参与跨损伤合成的蛋白质。4.根据条款3所述的方法，其中所述dna修复基因是dna-polη，ι或κ。5.根据条款1所述的方法，其中dna修复基因的修饰物是失活剂。6.根据条款7所述的方法，其中所述dna修复基因是mmr基因。7.根据条款8所述的方法，其中所述mmr基因是mutl同源物。8.根据条款9所述的方法，其中所述mutl同源物是mlh1、mutlα、mutlβ、mutlγ、pms1、pms2或mlh3。9.根据任一前述条款所述的方法，其中所述修饰物是多肽、多核苷酸、抗体、肽或小分子化合物。10.根据任一前述条款所述的方法，其中失活剂是通过基因组编辑提供失活的分子。11.根据任一前述条款所述的方法，其中所述癌症是mmr+ve癌症。12.根据任一前述条款所述的用于治疗癌症的方法，其中dna修复酶的修饰物是与不同的癌症治疗组合提供的。13.根据条款12所述的方法，其中所述不同的癌症治疗是使mmr基因失活的一种治疗。14.根据条款13所述的方法，其中所述不同的癌症治疗是采用替莫唑胺或mnu或其衍生物的治疗。15.根据条款15所述的方法，其中所述不同的癌症治疗是免疫疗法。16.根据条款18所述的方法，其中所述免疫疗法是免疫检查点抑制剂或免疫检查点抑制剂的组合。17.根据条款19所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是抗pd1抗体、抗ctla-4抗体、抗pdl-1抗体或其组合。18.根据任一前述条款所述的治疗方法，其中错配修复基因的失活剂/抑制剂是替莫唑胺、mnu或其衍生物。19.一种用于筛选抗癌化合物的方法，包括a)提供表达dna修复基因的细胞；b)在测试化合物的存在下孵育所述细胞；c)在测试化合物的存在下测量dna突变率；d)其中与在不存在测试化合物情况下测量的细胞中dna突变率相比在测试化合物的存在下细胞中dna突变率的增加表明测试化合物是抗癌化合物。20.根据条款22所述的方法，其中表达dna修复基因的细胞是人肿瘤细胞系。21.根据条款22或条款23所述的方法，其中所述dna修复基因是mlh1、mutlα、mutlβ、mutlγ、pms1、pms2或mlh3。22.一种鉴定具有适合于通过免疫疗法治疗的肿瘤的患者的方法，包括：a)取得所述肿瘤的样品，b)分析所述样品以确定dna修复基因的序列c)将肿瘤样品中所述dna修复基因的序列与非肿瘤样品中的序列进行比较其中肿瘤样品中所述dna修复基因的序列与非肿瘤样品中所述基因的序列相比的缺陷表明所述患者具有适合于通过免疫疗法治疗的肿瘤。现在将通过举例并参考以下附图和实例说明本发明的某些方面和实施例。附图图1.在ct26、结直肠癌和ts/a乳腺癌细胞系中mlh-1失活的体内后果。在ct26结直肠细胞系中获得了crispr/cas9介导的mlh-1敲除(a)。感染ct26，并在嘌呤霉素选择后进行单细胞克隆。ctrl表示在没有指导物的情况下用cripr/cas9载体感染的ct26克隆。m2和m3是分别用指导物号2和3获得的两个不同的克隆。选择两个指导物以避免任何脱靶效应。在nod/scid小鼠中皮下注射ct26克隆(每只小鼠5×105细胞)，并监测生长直至处死当天。(b)将ct26克隆注射在balbc免疫活性小鼠中。大多数m2和m3克隆被排斥(14个中的11个和14个中的10个)，这表明在免疫能力系统中免疫缺陷小鼠中生长的相同细胞被排斥一次。(c)用对照(实线)、m2(黑色虚线)和m3(黑色小虚线)在(b)中注射的balbc小鼠的存活曲线。mlh-1ko保证大多数注射小鼠的存活超过三个月(d)的mlh-1缺陷型细胞也从ts/a乳腺癌细胞系获得。对于ts/a，我们选择了两种mlh-1ko克隆。m3和m6分别表示来自指导物号3和6的两种克隆。蛋白质印迹显示体外培养三个月后的mlh-1水平。将mlh-1ko和wt克隆注射在免疫缺陷小鼠中。(e)在balbc小鼠皮下注射mlh-1无缺陷和缺陷型细胞(每只小鼠5x105个细胞)。大多数具有mlh-1ko克隆的小鼠被排斥(7只小鼠中的6只)，而ctrl生长。统计分析：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001(学生t检验)。(f)从(e)中的实验小鼠获得ts/a的存活曲线。图2.胰腺癌细胞系中的mlh-1失活赋予免疫原性排斥。(a)对于pdac细胞系，遵循图1中所遵循的相同途径。在两个对照克隆和用指导物2和6感染的mlh-1ko克隆中监测mlh-1四个月。(b)在nod/scid小鼠中注射mlh-1无缺陷和缺陷型克隆，其中所述克隆显示出在没有无缺陷免疫系统的小鼠中移植的内在能力。(c)在fvb小鼠中原位注射pdac细胞(每只小鼠103个细胞)。三周后处死小鼠并测量肿瘤负载。胰腺肿瘤的肿瘤体积显示mlh-1沉默干扰肿瘤生长。(d)分离胰腺肿瘤块，从而分析cd8和cd4t细胞的百分比。统计分析：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001(学生t检验)。图3.mlh-1失活使得ct26对balbc小鼠中的抗pd-1和抗ctla-4疗法有反应。(a)将在nod/scid小鼠中生长的肿瘤切成每侧2mm的片并在左腿的高度皮下植入。18天后，每三天在腹膜内给予抗pd1(每只小鼠250μg)和抗ctla4(每只小鼠200μg)三次。之后，每三天用抗pd-1继续治疗。mlh1ko小鼠中的肿瘤对抗pd-1和抗ctla-4疗法有反应，而具有无缺陷mlh1的肿瘤仅显示生长延迟。(b)与对照相比，mlh缺陷型肿瘤中cd8t细胞的百分比更高。在mlh-1无缺陷的肿瘤中，疗法增加了肿瘤中cd8t细胞的百分比。统计分析：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001(学生t检验)。(c)由于mlh-1ko克隆中新抗原水平的增加，与mlh-1无缺陷肿瘤相比，mlh1ko中的cd8浸润明显更高。(d)注射ct26(每只小鼠5×105个细胞)，并且同一天用抗cd8消耗抗体处理小鼠(第0天每只小鼠400μg，第1天每只小鼠100μg以及第2天100μg)。mlh-1ko肿瘤中cd8t细胞的消耗保证肿瘤生长，这证实这些细胞控制在mlh1缺陷型肿瘤中的肿瘤逃逸。图4.ct26上随时间变化的突变负荷和新抗原预测。(a)ct26克隆随时间进行比较，以追踪合适的新抗原的发展。注释文件中报告的变体用于计算突变的肽序列并加载至netmhc4.0软件中，从而获得预测的新抗原。(b)对mc38细胞系执行同样的步骤。(c)从最初的ct26克隆库开始，在每个克隆的每个时间点计算突变负载。如果支持至少1％等位基因频率，则单个核苷酸编码变体(保留种系的变体)的总数，在编码外显子组上归一化并以突变率(每百万的碱基)报告。图5.在mlh-1无缺陷和缺陷型肿瘤中对烷化剂的药物筛选将替莫唑胺鉴定为有前途的治疗途径。(a)在有或没有mlh-1的细胞系上对烷化剂进行药物筛选。在整个结晶紫染色中测量细胞的差异易感性。通过分光光度计溶解和量化结晶紫的量。在图a中，mlh-1ko与wt之间的log2比率的ic50鉴定与亲本相比哪种药物对mlh-1ko的存活具有较低的影响。(b)替莫唑胺处理后ct26和mc38的突变负荷。以100μm至500μm的替莫唑胺处理细胞4个月。(c)皮下注射ct26和mc38(每只小鼠5×104个细胞)。每周测量肿瘤体积两次。(d)替莫唑胺处理后ct26和mc38中的mlh-1表达。mc38中mlh-1水平显著降低，而在ct26中则没有差异。图6.ct26克隆中的mlh-1序列比对。根据指导物号2和3鉴定mlh-1区域。具有指导物2的克隆显示8bp的缺失，其诱导22个密码子的移码。由于双重缺失，指导物3产生了9个密码子的移码。第一行是小鼠参考组件mm10。图7.ct26、mc38、ts/a和pdac细胞系的体外生长。将结直肠癌细胞系每孔接种1000个细胞。将ts/a和pdac以每孔5000个细胞进行接种。测试mlh-1ko的所有克隆的体外生长。每24小时用celltiterglo量化它们的代谢活性。图8.处死当天荷载pdac肿瘤的小鼠。处死当天荷载pdac的肿瘤的小鼠。图片显示了所有分析的克隆中肿瘤的大小。图9.免疫控制对体内ct26克隆的影响。(a)在免疫缺陷小鼠中注射的ct26克隆被外植。肿瘤的重量显示mlh-1ko克隆的大小增加，但没有达到统计学显著性。(b)用ct26移植的小鼠的存活曲线显示mlh-1的缺乏使得肿瘤对免疫检查点抑制剂更敏感(b上图)。出于伦理原因，同一天处死同种型对照小鼠和mlh-1ko肿瘤。(c)cd8t细胞参与mlh-1koct26中的肿瘤排斥。在mlh-1无缺陷肿瘤中，缺乏cd8t细胞也增强了肿瘤生长。缺乏cd8介导的对照增加了ct26对照细胞的生长速率。图10.mhci在ct26、pdac和ts/a鼠细胞系中的表达。用抗h-2kb/h-2db和h-2kd/h-2ddpe标记的抗体染色细胞系。收获细胞，并在facs缓冲液(pbs+2％fbs)中单次洗涤后，在4℃下用抗体孵育30min。分析显示使用的所有克隆都是mhci无缺陷的。图11.ca(20)nanoluc测定在存在无缺陷的复制后mmr的情况下，报告基因仍然在框外。抑制的或遗传缺陷型mmr导致移码突变和框内报告物，所述框内报告物使用商业纳米荧光素酶(nanoluciferase)测定系统检测。图12.用ca(20)-nanoluc质粒以及对照空载体(ev)或表达野生型(wt)mlh1的质粒转染细胞。转染后24小时，用胰蛋白酶消化细胞，计数，并以每孔10,000个细胞重新接种至96孔板中，每个条件进行8次重复。然后将细胞培养72小时，随后使用nanoglo测定系统(promega)检测4个孔中的纳米荧光素酶报告物活性。在bmgclariostar读板器上测量发光。对于使用celltitreblue试剂(promega)将细胞数归一化，其余4个孔中的在clariostar上的读取也进行归一化。数据显示为针对celltitreblue数据归一化的归一化纳米荧光素酶活性。图13.用ca(20)-nanoluc质粒以及对照空载体(ev)或表达野生型(wt)mlh1或mlh1g67r克隆#1、2或3的质粒转染细胞。转染后24小时，用胰蛋白酶消化细胞，计数，并以每孔10,000个细胞重新接种至96孔板中，每个条件进行8次重复。然后将细胞培养72小时，随后使用nanoglo测定系统(promega)检测4个孔中的纳米荧光素酶报告物活性。在bmgclariostar读板器上测量发光。对于使用celltitreblue试剂(promega)将细胞数归一化，其余4个孔中的在clariostar上的读取也进行归一化。数据显示为针对celltitreblue数据归一化的归一化纳米荧光素酶活性。实例实例1概述参与dna错配修复(mmr)的肿瘤抑制基因中的分子改变促进癌症起始并促成肿瘤进展。mmr缺陷型癌症经常表现出有利的预后和惰性进展。解决了mmr肿瘤患者临床结果的功能基础。小鼠结直肠癌、乳腺癌和胰腺细胞中的mutl同源物1(mlh1)被遗传失活。mmr缺陷型细胞的生长速度与其体外和在移植到免疫受损小鼠中时的无缺陷对应物相比相同或更高。然而，引人注目的是，当在同基因小鼠模型中皮下注射时，mmr缺陷型结直肠癌和乳腺癌细胞很大程度上不能形成肿瘤。当原位移植时，mmr无缺陷的胰腺癌细胞迅速导致致命疾病，而其mmr缺陷型对应物没有生长或形成较小的肿瘤。mmr缺陷型肿瘤显示高水平的浸润性t细胞，并且t淋巴细胞的抑制允许同基因小鼠中mmr缺陷型肿瘤的指数生长。最初在免疫缺陷小鼠中建立的mmr缺陷型肿瘤在移植到同基因动物中时呈指数生长，但在给予免疫检查点抑制剂时完全消退。mmr无缺陷的细胞的测序揭示了高突变负荷(50-100个突变/mb)和随时间稳定的新抗原谱。mmr失活进一步增加了突变负担，并导致新抗原的持续更新。使用药理学筛选发现增加突变水平本身不足以引发免疫监视。相反，药物诱导的dna修复永久性失活导致动态超突变状态，这对于免疫监视是核心的。这些结果为开发创新的抗癌疗法提供了基本原理。结果为了在功能上定义错配修复在肿瘤形成中的作用和对治疗的反应，研究了mmr无缺陷的小鼠结直肠癌(ct26，mc38)、乳腺癌(tsa)和胰腺癌(pdac)细胞。使用采用crispr-cas系统进行的基因组编辑来失活这些细胞模型中的每一种中的mutl同源物1(mlh1)。使用针对不同mlh1外显子区域的独立rna指导物并分离多个克隆。来源于未用特异性rna指导物处理的细胞的克隆用作对照(ctr克隆)。在基因组水平(图6)和蛋白质水平(图1a，图1d，图2a)证实了mlh1的失活。通过对重复小鼠dna元件进行测序来建立dna错配修复的功能性失活，基于与人类基因组的等同区域的同源性选择所述重复小鼠dna元件(图6)。在体外，mmr缺陷型细胞的增殖率与其亲本衍生物和ctr克隆的增殖率是可比的(图7)。结直肠和乳腺mmr缺陷型细胞在皮下注射到免疫受损小鼠中时迅速形成肿瘤，并且在几周后必须根据伦理指南处死动物(图1a和1d)。mmr缺陷型细胞比对照生长更快，但在实验终点，差异没有达到统计学显著性(图9a)。当将ct26细胞注射到相应的同基因小鼠模型(balbc)中时，它们迅速生长，并且在30天后必须处死动物。相反，mmr缺陷型细胞(m2和m3克隆)没有移植或形成小肿瘤块，所述小肿瘤块在几天后消退(图1b)。监测整个群组超过三个月，在此期间没有肿瘤复发的证据，表明小鼠已经治愈(图1c)。使用乳腺癌细胞进行相同类型的实验，其中mlh1已经在同基因小鼠中失活(图1e)。同样在这种情况下，mmr缺陷型细胞不形成肿瘤或形成随后消退的小病变。相反，mmr无缺陷的乳腺癌细胞迅速生长并在不到一个月的时间内导致动物的牺牲(图1e)。mmr缺陷型荷瘤小鼠的存活时间长于对照(图1f)。已知当皮下注射癌细胞时，肿瘤基质成分和微环境的结构和特性未得到适当的重建。15作为第三种模型，将胰腺导管腺癌(pdac)细胞原位注射到同基因小鼠的胰腺中。16这种癌症模型密切重演了人pdac的分子特征。与它们的人类对应物一样，小鼠pdac细胞极具侵略性，导致呈迅速致命性的肿瘤。值得注意的是，在这种情况下，我们还观察到mmr无缺陷和mmr缺陷型细胞之间的引人注目的差异(图2b和图8)。移植后3周，注射ctr细胞的小鼠形成大肿瘤，相反，mlh1敲除的细胞未形成肿瘤或形成非常小的病变(图2b)。注射在免疫缺陷小鼠中的pdac细胞显示相同的移植率，证实免疫无缺陷小鼠中观察到的效果与克隆生长受损无关(图2c)。在mlh-1ko克隆中cd8t细胞的百分比明显更高，证实mlh-1编辑后的新抗原参与潜在细胞毒性t细胞的募集(图2d)。研究了错配修复失活对已建立的肿瘤的影响。由于mlh1敲除的细胞不生长或生长不良，在同基因免疫活性小鼠中，它们首先在免疫缺陷小鼠中产生，直至肿瘤达到2000mm3大小，此时将病变(每侧2mm)移植到同基因balbc受体中。在这些条件下，mlh1敲除的结直肠癌细胞在受体动物中继续生长(图3a)。有理由认为，这种情况可能重演了结直肠癌患者通常接受免疫疗法即在肿瘤完全建立时的临床环境。17因此，将荷载mmr无缺陷和mmr缺陷型肿瘤的小鼠用抗pd1和抗ctla4抗体的组合来治疗。结果是引人注目的，而对照肿瘤继续增长，其mmr缺陷型对应物消退(图3a)。在大多数情况下，治疗是有疗效的，因为病变消失并且小鼠存活超过三个月而没有复发(图9b)。在实验结束时，处死一部分动物并且组织学分析显示完全病理反应(cpr)。为了深入了解负责这些发现的分子机制，验证了细胞模型中mhci的表达。在mmr无缺陷和缺陷型细胞中mhci的表达是可比的(图10)。接下来对在接受同种型特异性对照抗体的同基因小鼠中建立的mmr无缺陷和mmr缺陷型肿瘤进行组织学和facs分析。值得注意的是，与对照相比，mlh1敲除的肿瘤显示出高水平的免疫浸润(图3b)。确切地，在接受了同种型对照抗体的mmr缺陷型肿瘤而不是mmr无缺陷型肿瘤中发现cd8t细胞的水平增加。重复该实验，以便在抗pd-1和ctla-4组合处理后的早期时间点收集mmr缺陷型和mmr无缺陷型肿瘤的样品。与对照相比，发现cd8t细胞优先在mlh1敲除的克隆中增加(图3b)。在肿瘤样品中cd8细胞的免疫荧光染色后获得相同的结果(图3c)。为了检验t细胞可能是观察到的肿瘤形成表型的原因的假设，重复在抗cd8抗体的存在下注射mmr缺陷型细胞，同种型匹配抗体用作对照。结果是明确的，仅当cd8t细胞同时被抑制时，mmr缺陷型细胞容易在同基因小鼠中形成肿瘤(图3d)。在荷载mlh-1无缺陷肿瘤的小鼠中cd8的耗尽增加了肿瘤生长(图9c)。一些报告表明，具有高突变负荷的肿瘤(如黑色素瘤和肺癌)优先对免疫疗法有反应。13,18-21然而值得注意的是，大部分超突变肿瘤的预后不良，并对免疫调节剂无反应。14,17亲本细胞和匹配的正常(种系)dna的外显子组测序揭示ct26和mc38显示高突变负荷，分别为150和129个突变/兆碱基dna(图4a)。rnaseq分析表明大部分突变基因被转录，因此可以作为新抗原。这些结果与先前的报道一致，并且可能反映了ct26和mc38细胞的来源，这些细胞获得自用已知致突变的致癌物治疗的小鼠。22当基于人类癌症中测量的突变负荷水平分类时，ct26肿瘤被认为是超突变的。为了解决为什么(如果高水平的新抗原引起免疫系统吸引癌细胞)ct26肿瘤会在从未暴露于这些细胞的同基因小鼠中生长的问题，测量mmr缺陷型细胞的突变负荷。发现mlh1的失活进一步增加了ct26(从150到247-352个突变/mb)和mc38(从129到190-250个突变/mb)的突变负荷。虽然这种增加可能足以启动免疫应答，但也考虑了其他可能性。据推测，由于无效的dna修复，msi肿瘤不仅具有大量突变，而且其突变景观也因此不断波动。为了正式对此进行测试，对来自在不同时间点纵向收集的细胞的外显子进行测序。如图4所示，在mmr细胞中，突变(以及因此相应的新抗原)谱随时间动态地演变。因此，提出使得mmr缺陷型癌症可能对免疫疗法起反应的关键特征是其基因组景观快速且动态地演变。这导致新型突变的不断出现，这些突变逐渐地和反复地被免疫系统所吸引。这种可能性可以解释为什么mmr缺陷型肿瘤的临床发生率通常具有更有利的预后，并且趋向于在更长的时间内受到免疫系统的控制。诸位发明人提出，mmr肿瘤中免疫监视的逃逸是通过新t细胞库所吸引的新抗原的动态出现来抵消。如前所讨论，参与dna修复的肿瘤抑制基因的失活增加了癌细胞的突变率，并且这促进了癌症进展。已知诱变剂可促进癌发生。因此，增加人类细胞中突变的数量被认为是肿瘤促进事件。23有理由认为，癌细胞中突变数量的强制增加可能(矛盾地)有益于治疗目的。然而，假设突变增加必须是动态的而不是静态的。为了测试这种可能性，用诱变剂处理癌细胞，所述诱变剂会或不会导致dna修复机器的永久失活。诸位发明人和其他人先前报道了对诱变剂的抗性可能与mmr基因如mlh1和msh2的失活有关。24设计药理学筛选以鉴定优先影响mmr无缺陷细胞(与其msi对应物相比)的抗癌剂。对于筛选，选择已知烷化dna和/或损害dna复制的fda批准的抗癌药物(表2)。功能测定显示mmr缺陷型细胞不受所测试的抗癌剂影响或对所测试的抗癌剂更具抗性(图5a)。然而，结直肠和乳腺mmr无缺陷细胞与其msi对应物相比，显示出对替莫唑胺(tmz)的优先敏感性。替莫唑胺是一种众所周知的化学治疗剂，其用于治疗若干肿瘤类型并触发dna损伤。25,26先前已显示，tmz暴露会影响dna修复，并且tmz治疗可导致mmr失活。将27ct26和mc38mmr无缺陷细胞用替莫唑胺治疗，直至出现抗性群体。外显子组分析揭示，暴露于tmz会使突变负荷增加至与mmr失活所达到的水平可比的水平(图5b)。然后将ct26和mc38细胞注射到相应的同基因小鼠中。tmz抗性ct26细胞容易形成肿瘤并以与其亲本对应物可比的速率生长(图5c)。然而，对替莫唑胺具有抗性的mc38不会形成肿瘤。因此评估了抗tmz的ct26和mc38细胞的mmr状态。最值得注意的是，通过微卫星不稳定性测定测量，mc38而非ct26细胞显示mmr缺陷。进一步发现在mc38(而非ct26)细胞中mlh1表达显著降低(图5d)。这些结果表明暴露于烷化剂增加了癌细胞的突变负荷，然而这本身不足以驱动体内肿瘤排斥。表3：综合考虑时这些发现有几个寓意。首先，已经广泛努力开发能够恢复肿瘤抑制蛋白功能的药物，希望它们可以作为抗癌剂。然而，诸位发明人的数据表明可以替代地追求肿瘤抑制基因或基因产物的永久性失活(而不是再激活)以用于治疗目的。这种非传统途径的基本原理是基于以下概念：癌细胞中突变数量的动态而非静态增加可导致基于细胞的免疫应答。其次，免疫调节剂如pd-1和pdl-1抑制剂仅在一部分癌症患者中有效。基于本文提供的结果，可能的是长期受益于免疫疗法的患者可修复导致动态超突变状态的dna缺陷。在结直肠癌中，这些群体主要与携带mmr和聚合酶基因缺陷的个体重叠。这些基因在黑素瘤和肺癌中不经常改变，然而这些患者中的一部分确实具有对免疫阻滞的延长反应(topalian,s.l.等人nengljmed366,2443-2454,(2012))。可以设想，一些具有来自免疫调节剂的突出且持久的益处的黑素瘤和肺癌患者也携带导致动态超突变状态的分子改变。这些结果的另一个寓意是可以在药理学上诱导导致新抗原持续更新的动态突变负荷的增加，并且这可以导致有效的免疫监视。在这方面，我们用替莫唑胺(一种常用的化学治疗剂)获得的结果表明，导致dna修复功能失活的药物可能在系统上是可耐受的。本文提供的数据的重点是参与错配修复的mlh1，然而其他(肿瘤抑制因子)基因也可以被靶向，目的是促进动态突变负荷。例如，可以设想药物诱导的dna聚合酶例如pole和pold失活。错配修复系统和dna聚合酶的组分具有催化活性(分别为atp酶和核酸外切酶活性)，因此应该适合药理学抑制。总之，诸位发明人提供的数据表明dna错配修复的失活导致动态超突变状态，其触发持久的免疫监视。这些结果为基于dna修复酶的失活开发创新的抗癌疗法提供了基本原理。方法小鼠模型所有动物程序均经都灵大学伦理委员会和意大利卫生部批准，并按照如下进行：机构指南(4d.l.n.116,g.u.,增补40,18-2-1992)和国际法律和政策(eec理事会指令86/609，ojl358,1,12-12-1987；护理和使用实验动物的nih指南，美国国家研究委员会(usnationalresearchcouncil)，1996年)。从查尔斯河(charlesriver)(calco，科摩(como)，意大利)获得4至6周龄c57/bl/6j、balbc和nod/scid小鼠。在小鼠实验中，皮下接种细胞(5×105个细胞/小鼠)。监测肿瘤生长以及小鼠的健康直至处死。每5天测量肿瘤大小，并使用以下公式计算：v＝((d/2)2×(d/2))/2(d＝次要肿瘤轴；d＝主要肿瘤轴)，并报告为肿瘤质量体积(mm3，个体肿瘤体积的均值±sem)。胰腺导管腺癌的小鼠模型是通过原位注射到如前所述分离的fvb/n同基因小鼠kraslsl_g12d、p53r172h/+、ink4a/arfflox/+细胞(1×103个细胞/小鼠)的群组中而获得的。当注射到免疫活性fvb/n小鼠的胰腺中时，这些细胞系能够形成肿瘤，其重现了自发性肿瘤微环境的许多特征，平均潜伏期为3-4周。通过用卡尺测量并用前述公式估计单独切除的肉眼可见肿瘤(>1mm3)的体积来定量总肿瘤负荷。细胞模型ct26和mc38结直肠癌细胞系由mariarescigno博士的实验室(欧洲肿瘤学研究所)友情提供。ts/a乳腺癌细胞系是从在balb/c小鼠中自发产生的中度分化的乳腺癌的第一次体内移植物建立的侵袭性细胞系。ts/a细胞由federicacavallo(意大利都灵大学分子生物技术中心)友情提供。lewis肺癌细胞系购自atcc。从荷瘤pdac小鼠分离mpdac细胞。胰腺癌gemm模型来自fvb/n背景。组合的p53点突变和ink4a/arfflox化的小鼠kiapp48cre具有以下基因组成：p48cre、kraslsl_g12d、p53r172h/+、ink4a/arfflox/+。注意，相应肿瘤抑制基因的野生型等位基因在肿瘤形成途中丢失。将ct26和mc38细胞系在rpmi164010％fbs、加谷氨酰胺、青霉素和链霉素中在体外扩增。将ts/allc和pdac在dmem10％fbs加谷氨酰胺、青霉素和链霉素中培养。crispr/cas9介导敲除mlh1为了敲除mlh1基因，使用基因组编辑系统(全合一个和两个载体，具有可诱导递送hspcas9的单独慢病毒构建体，jonkers实验室赠)。对于特定的具有最低脱靶效应的rna指导物的鉴定，使用zhang实验室网站提供的软件工具(www.genome-engineering.org)。如前所述，将靶向鼠mlh1的退火的sgrna寡核苷酸克隆到bsmbi(thermoscientific)限制性lenticrispr-v2质粒(来自addgene#52961)载体和lentiguide-puro(来自addgene#52963)中。29将连接的质粒转化到感受态stbl3细胞(invitrogen)中。对于每种构建体，挑取3-5个单独菌落并在lb氨苄青霉素培养基中培养过夜。然后使用dna微量制备试剂盒(qiagen)分离来自每个菌落的质粒，并使用hu6-正向引物测序以验证正确的整合取向。慢病毒生产和感染通过用病毒载体和包装质粒pvsvg(addgene#8454)、pspax2(addgene#12260)共转染hek293t细胞来包装慢病毒颗粒(sanjana等人,natmethod2014)。使用cacl2实现转染，之后将细胞孵育48小时。然后收获来自每个孔的上清液，通过0.22μm过滤器，以除去细胞碎片，并在-80℃下以1ml等分试样冷冻。在8μg/ml聚凝胺(millipore)的存在下，用慢病毒感染约60％汇合度的细胞。为了选择进行转导的细胞，我们在诱导型载体的情况下使用嘌呤霉素(p9620sigmaaldrich)处理和庆大霉素(gibcolifetechnologies)。cas9的诱导是在体外4oh-他莫昔芬(sigmaaldrich)处理(1μg/ml)之后。crispr/cas9中的脱靶效应为了检查crispr/cas9表达是否导致脱靶切割，分析了每个sgrna的前20个脱靶位点和至少三个外显子脱靶。基于扩增子的ngs数据的分析仅揭示了在这些预测的脱靶位点处的野生型序列。因此，可以得出结论，在crispr/cas9表达的实验环境中，不希望的脱靶效应可以忽略不计29。治疗抗小鼠pd-1(克隆rmp1-14)和抗小鼠ctla-4(克隆9h10)抗体购自bioxell(美国)。对小鼠经腹膜内给予250μg抗pd-1/小鼠和200μg抗ctla-4/小鼠来治疗。在注射后第3、6和9天给予治疗。每三天连续给予抗pd-1。根据相同的时间安排注射同种型对照(对于pd-1为大鼠igg2a，以及对于ctla-4为多克隆叙利亚仓鼠igg)。抗小鼠cd8a(克隆yts169.4)和同种型大鼠igg2b用于耗尽免疫活性小鼠中的细胞毒性t细胞。在肿瘤接种当天，腹膜内注射抗小鼠cd8a抗体(200μg/小鼠)。在肿瘤注射后2和3天后，用100μg耗尽性抗体/小鼠来治疗小鼠。进行facs分析以控制没有肿瘤的小鼠血流中的cd8at细胞水平。通过腹膜内注射他莫昔芬治疗小鼠来获得体内诱导型mlh1敲除。将10mg/ml的他莫昔芬(来自sigma-aldrich的t5648)以1:10溶于乙醇和以9:10溶于花生油中。每天给每只小鼠注射100μl药物，持续5天。蛋白质印迹对于生化分析，使所有细胞在补充有10％fbs的培养基中生长。通过在沸腾的sds缓冲液(50mmtris-hcl[ph7.5]、150mmnacl和1％sds)中溶解细胞来提取总细胞蛋白质。将样品煮沸10分钟并超声处理30秒。通过离心澄清提取物，并用bca蛋白质测定试剂盒(thermoscientific)归一化。用增强的化学发光系统(gehealthcare)和过氧化物酶缀合的二抗(amersham)进行蛋白质印迹检测。以下一抗用于蛋白质印迹：抗mmlh-1，1:5000(来自abcam的epr3894)，抗肌动蛋白(i-19)1:2000(来自santacruzbiotechnology)。免疫表型分析从麻醉小鼠的尾静脉收集血细胞。将小鼠肿瘤切成小块，用胶原酶(1.5mg/ml)和dna酶(100μg/ml)解聚，并通过过滤器过滤。细胞(106)用特异性抗体和zombievioletfixableviabilitykit(biolegend)染色。通过facsdako仪器和flowjo软件进行流式细胞术。用以下抗体进行表型分析。percp-大鼠cd45(30f11)、大鼠apccd11b(m1/70)、大鼠pe/cy7cd3(17a2)、fitc大鼠cd4(rm4-5)和pe大鼠cd8(yts156.7.7)。外显子组和生物信息学分析使用reliapreptmgdna试剂盒(promega)提取基因组dna。由integragen使用agilentsureselectmouseallexon试剂盒进行基因组dna样品的捕获和富集。使用illuminahiseq4000对文库进行测序。在fpo住院和护理科学研究所(institutodiricoveroecuraacaratterescientifico)(irccs-fpo)对由integragen提供的测序原始数据进行生物信息学分析。使用casava1.8软件将fastq格式的原始数据解复用为配对末端75-bp读段。平均观察到中值深度为70x，超过97％的靶区域被至少一个读段覆盖。在进一步分析之前，使用bwa-mem算法(li,h.&durbin,r.bioinformatics26,589-595(2010))将配对末端读段与小鼠参考(组件mm10)进行比对。然后使用“rmdup”samtools命令30从比对文件中移除pcr重复项。体细胞变异被称为使用定制ngs路线减去balbc和c57bl6中发现的种系变异31。仅考虑以最小深度5x存在且由至少1％等位基因频率支持的位置。为了计算等位基因频率的显著性，我们对每个变体进行了fischer检验。仅考虑在靶区域上归一化的编码变体来计算突变负荷。从变体的注释文件开始计算新抗原。报道的氨基酸变化用于重建密码子变化内的肽序列。适当修剪突变的肽序列，然后将其填至netmhc4.0软件以预测新抗原。32对于每种变异，仅考虑具有最佳等级的预测的新抗原以产生合适的肽输出。统计分析来自celltiterglor(promega)的所有数据表示为至少三次独立实验的均值±s.d.，每次实验具有三次实验重复。用每组至少4只小鼠进行小鼠实验。通过学生t检验计算p值。实例2-基于细胞的调节剂测定为了读出哺乳动物细胞中的错配修复(mmr)，开发了基于纳米荧光素酶(promega)报告酶活性的测定(“ca(20)-nanoluc测定”)。将20个拷贝的ca二核苷酸重复序列(称为“ca(20)”)克隆到nanoluc编码序列的上游，以便将nanoluc活性置于mmr途径的控制下。该ca(20)段使nanoluc编码序列在框外，因此没有酶表达且没有活性。然而，ca(20)段是经常发生dna复制错误的序列，因此依赖于mmr途径来修复任何复制后dna错配。在mmr感受态细胞中，任何错误都被有效修复，nanoluc编码序列保持在框架外，因此报告物活性低。然而，如果mmr是通过小分子或任何mmr机制的遗传丢失抑制，复制后错误可能仍未修复，可能发生移码突变，因此群体中的一些细胞现在将表达功能性nanoluc蛋白。这在图11中所示的图画中描绘。因此，当将含有ca(20)nanoluc构建体的质粒转染到细胞中时，mmr抑制可以报告为活性的增加。由于是一种具有大的且线性动态范围的高度加工酶，因此预测只需少量mmr错误即可产生阳性信号，从而实现具有大信噪比的灵敏测定。使用hek293a、ft和t细胞测试该测定形式。在这些细胞中，mlh1启动子被高度甲基化至不同程度，因此mlh1表达低。如图12所示，当用ca(20)-nanoluc构建体和表达野生型人mlh1的质粒共转染这些细胞时，nanoluc信号几乎被完全抑制。这证实ca(20)-nanoluc质粒报告mlh1活性，并且可以使用该测定系统测量mlh1活性。为了扩展这些发现，通过将甘氨酸67突变为精氨酸(g67r)产生人mlh1的atp酶无活性突变体。这是一种人类林奇综合征突变，并且之前已在生化分析中报道为atp酶无活性。在hek293ft细胞中，观察到与之前用wtmlh1情况下相同的明显的纳米荧光素酶(nanoluciferase)活性抑制，但是三种不同的mlh1g67r质粒未能抑制报告物活性，如图13所示。化合物的测定如下进行：用wtmlh1和ca(20)-nanoluc质粒共转染hek293ft细胞，将细胞重新铺板到96孔板中，并然后用一系列剂量的可能抑制剂处理。活性化合物将报告报告物信号的增加，而不是抑制。当处理可导致细胞毒性的非成熟命中化合物时，这是一个明显的优势：在通过信号丢失报告的测定形式中，信号减少通常可能是由于细胞死亡，导致化合物被错误地称为命中物。参考文献1vogelstein,b.etal.cancergenomelandscapes.science339,1546-1558,doi:10.1126/science.1235122(2013)。2shojaee,s.etal.ptenopposesnegativeselectionandenablesoncogenictransformationofpre-bcells.natmed,doi:10.1038/nm.4062(2016)。3orthwein,a.etal.amechanismforthesuppressionofhomologousrecombinationing1cells.nature528,422-426,doi:10.1038/nature16142(2015)。4rayner,e.etal.apanoplyoferrors:polymeraseproofreadingdomainmutationsincancer.natrevcancer16,71-81,doi:10.1038/nrc.2015.12(2016)。5bronner,c.e.etal.mutationinthednamismatchrepairgenehomologuehmlh1isassociatedwithhereditarynon-polyposiscoloncancer.nature368,258-261,doi:10.1038/368258a0(1994)。6koornstra,j.j.etal.managementofextracolonictumoursinpatientswithlynchsyndrome.lancetoncol10,400-408,doi:10.1016/s1470-2045(09)70041-5(2009)。7lax,s.f.,kendall,b.,tashiro,h.,slebos,r.j.&hedrick,l.thefrequencyofp53,k-rasmutations,andmicrosatelliteinstabilitydiffersinuterineendometrioidandserouscarcinoma:evidenceofdistinctmoleculargeneticpathways.cancer88,814-824(2000)。8xiao,x.,melton,d.w.&gourley,c.mismatchrepairdeficiencyinovariancancer--molecularcharacteristicsandclinicalimplications.gynecoloncol132,506-512,doi:10.1016/j.ygyno.2013.12.003(2014)。9okuda,t.etal.geneticsofendometrialcancers.obstetgynecolint2010,984013,doi:10.1155/2010/984013(2010)。10ponti,g.,castellsagué,e.,ruini,c.,percesepe,a.&tomasi,a.mismatchrepairgenesfoundermutationsandcancersusceptibilityinlynchsyndrome.clingenet87,507-516,doi:10.1111/cge.12529(2015)。11vilar,e.&gruber,s.b.microsatelliteinstabilityincolorectalcancer-thestableevidence.natrevclinoncol7,153-162,doi:10.1038/nrclinonc.2009.237(2010)。12rizvi,n.a.etal.cancerimmunology.mutationallandscapedeterminessensitivitytopd-1blockadeinnon-smallcelllungcancer.science348,124-128,doi:10.1126/science.aaa1348(2015)。13schumacher,t.n.&schreiber,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