调节SIGLEC依赖性免疫反应的多肽的制作方法
本发明涉及基于哺乳动物蛋白的糖基化多肽以及使用所述糖基化多肽的治疗方法，所述糖基化多肽由于调节的siglec结合而表现出降低的免疫反应或增强的免疫耐受性。本发明进一步涉及蛋白复合物以及使用所述蛋白复合物的治疗方法，所述蛋白复合物由于调节的siglec结合而表现出降低的免疫反应或增强的免疫耐受性。
背景技术：
血友病是一组遗传性基因疾病，其会损害身体控制血液凝固或凝血的能力。在其最常见的形式血友病a中，缺乏凝血因子viii(fviii)，血友病a在5000至10000个男婴中出现约1例。fviii蛋白是血液凝固中必需的辅助因子，具有多功能特性。可以用源自血浆的fviii浓缩物或用重组产生的fviii治疗fviii缺乏。用fviii浓缩物治疗使血友病患者具有正常的生活。在历史上，已经用源自人血浆的fviii治疗血友病a。在血浆中，在正常条件下，fviii分子总是与其辅因子结合；血管性血友病因子(vwf)，其稳定fviii分子使其免于不同形式的衰减。
已经描述了许多方法用于从血浆或培养物中纯化viii因子，这些方法在存在或不存在血管性血友病因子(vonwillebrandfactor)的情况下重组产生viii因子(rfviii)。在90年代，最早的重组fviii(rfviii)产品上市销售，产品分为模拟血浆中fviii的主要形式的全长rfviii分子；以及b结构域缺失的rfviii分子(eriksson等，2001)，其中一个非活性部分(b结构域)已被除去，这两种产品都具有高纯度(均不含vwf)。
血友病a患者根据需要用fviii治疗或用fviii作为预防性治疗每周数次施用。对于预防性治疗，以15-25iu/kg体重每周三次施用fviii是必要的，这是因为对fviii的持续需要以及fviii在血液系统中的短半衰期，半衰期在人类中为仅约11小时。(ewenstein等，2004)。
在常见的情形中，外源性施用fviii的持续治疗引起患者免疫系统的反应(saenko等，haemophilia8：1-11(2002))，这对治疗产生了严重的限制。
目前，为了在具有血友病a(先天性fviii缺乏症)和抑制物的患者中实现免疫耐受的最常见的选择是免疫耐受诱导(iti)，其中长时间施用高剂量的fviii。然而，该治疗需耗费长达两年的时间，在约30％的患者中仍然是不成功的，非常昂贵并且不能以预防性的方式来使用以抑制抑制性抗体的初始形成。
因此，需要减弱免疫反应的方法。一种有前景的方法是对fviii或其结合配偶体vwf的糖基化的优化。
例如，wo2014/176125a1涉及用于诱导针对fviii的抗原特异性免疫耐受的免疫缀合物。该免疫缀合物是与特定聚糖配体缀合的fviii蛋白，其靶向在b细胞上表达的siglec，即sig-1或sig-10(或直系同源物sig-g)。特别地，该聚糖配体与引入有fviii的脂质体偶联。
唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素(siglec)包括具有15个人细胞表面受体和9个鼠细胞表面受体的家族，所述表面受体在小鼠和人免疫系统中除大多数t细胞以外的各种白细胞上表达。siglec位于不同的细胞类型上并与不同的聚糖结构结合(在paulson等人，2012年中有论述)。例如，已证实vwf和fviii与sig-5的结合(pegon2012)。然而，结合机制仍然未知。
在wo2014/179184a1中描述了不同的方法。作者建议通过添加siglec配体来减少不需要的抗体免疫反应并诱导凝血因子如fviii的免疫耐受。siglec配体选自9-n-联苯基羧基-neuaca2-6gal～l-4glcnac(6'—bpcneuac)、neuaca2-6galwl-4glcnac和neuaca2-6galwl-4(6-磺基)glcnac。siglec配体通过水溶性聚合物与凝血因子连接。
技术实现要素：
本发明尤其基于以下发现：在血浆来源的蛋白中天然存在的聚糖结构，特别是vwf，能够与一组siglec相互作用，所述siglec特别是sig-5、sig-7、sig-8和sig-9。此外，发明人发现通过蛋白上的聚糖结构的修饰，可以增加与siglec如sig-5、sig-7、sig-8和sig-9的相互作用。这种增加导致施用该蛋白的患者的免疫反应减少和/或免疫耐受性增强。
因此，根据第一方面，本发明提供糖基化多肽，其包含与哺乳动物蛋白优选人蛋白的至少一个片段相同或同源的氨基酸序列，其中所述糖基化多肽含有一个或多个唾液酸化的o-聚糖，并且其中与所述哺乳动物蛋白或其片段相比，所述多肽对选自sig-5、sig-7、sig-8和sig-9中的一种或多种siglec具有增加的结合亲和力。
发明人已经特别定义了一种聚糖结构，该聚糖结构一方面是与siglec相互作用所需的，但是添加该聚糖结构还会导致与siglec的结合增加。造成这一点的原因是唾液酸化的核心2o-聚糖和/或延伸核心1o-聚糖。
因此，根据第一方面的糖基化多肽还可以定义为包含与哺乳动物蛋白优选人蛋白的至少一个片段相同或同源的氨基酸序列的糖基化多肽，其中所述糖基化多肽含有一个或多个唾液酸化的o-聚糖，并且其中所述糖基化多肽的唾液酸化的核心2o-聚糖和唾液酸化的延伸核心1o-聚糖的总数量高于所述哺乳动物蛋白或其片段的唾液酸化的核心2o-聚糖和唾液酸化的延伸核心1o-聚糖的总数量。
具有含有唾液酸化的核心2o-聚糖和/或唾液酸化的延伸核心1o-聚糖(特别是唾液酸化的核心2o-聚糖)的聚糖组分的蛋白可以用于通过联合施用来改变患者对治疗性蛋白的免疫反应。
因此，根据第二方面，本发明涉及糖基化多肽用于减少患者对治疗性蛋白的免疫反应或增强患者对治疗性蛋白的免疫耐受性的用途，所述糖基化多肽含有一个或多个唾液酸化的o-聚糖并显示出对选自sig-5、sig-7、sig-8和sig-9中的一种或多种siglec的结合。
利用对于具有siglec结合亲和力的糖基化多肽的修饰，不仅可以直接改变经修饰的多肽本身的siglec结合亲和力，而且还可以改变蛋白复合物或组合物的siglec结合亲和力，其中所述糖基化多肽是例如viii因子(fviii)与血管性血友病因子(vwf)的复合物的一部分。
因此，根据第三方面，本发明提供包含第一多肽和第二多肽的蛋白组合物，其中第一多肽是含有一个或多个唾液酸化的o-聚糖的糖基化多肽，第二多肽含有与第二哺乳动物蛋白特别是人蛋白同源或相同的氨基酸序列，其中与第二多肽相比，该组合物对选自sig-5、sig-7、sig-8和sig-9的一种或多种siglec具有增加的结合亲和力。根据第三方面的组合物的第一多肽和第二多肽优选形成蛋白复合物。
根据第四方面，本发明提供分离的多核苷酸，其包含编码根据本发明第一方面的糖基化多肽的核酸序列。在第五方面，本发明还涉及包含根据本发明第四方面的多核苷酸的表达载体。
根据第一方面的糖基化多肽，特别是vwf或fviii，以及根据第三方面的组合物，特别是fviii与vwf的复合物，由于减少的免疫反应而特别适用于医学治疗。
因此，根据第四方面，本发明提供根据第一方面定义的糖基化多肽或根据第三方面定义的组合物，其用于治疗或预防出血性疾病。
附图说明
图1显示了vwf与不同siglec的结合试验的结果。492nm处的吸光度与结合至分别鉴定的siglec或对照的vwf成比例。通过微量滴定板上500ng/孔的蛋白a固定sig-2、sig-5、sig-7、sig-f、sig-9和sig-10。以0μg/ml至0.8μg/ml的浓度添加生物素化的vwf，并且在洗涤后用hrp缀合的链霉亲和素使结合可视化，在492nm处测量吸光度。抗vwf抗体(anti-vwf)和抗鸡igy抗体(anti-chickenigy)用作对照。
图2显示了包含n-糖基化位点和o-糖基化位点以及v8蛋白酶切割位点的vwf结构域以及v8蛋白酶切割后产生的片段的示意图。
图3显示了vwf的n-末端片段和c-末端片段与siglecsig-5、sig-7、sig-f和sig-9的结合试验的结果。492nm处的吸光度与结合至分别鉴定的siglec或对照的vwf片段成比例。通过微量滴定板上500ng/孔的蛋白a固定sig-5、sig-7、sig-f和sig-9。以1μg/ml的浓度添加生物素化的n-末端vwf片段(深灰色柱)和c-末端vwf片段(浅灰色柱)，并且在洗涤后用hrp缀合的链霉亲和素使结合可视化，在492nm处测量吸光度。抗鸡igy抗体用作阴性对照。
图4显示了去唾液酸化形式、去n-糖基化形式和未处理形式的vwfn-末端片段的结合试验的结果。492nm处的吸光度与结合至分别鉴定的siglec或对照的vwfn-末端片段成比例。消化前的n-末端vwf片段用白色柱表示，pngasef去n-糖基化片段用灰色柱表示，去唾液酸化片段用黑色柱表示。通过微量滴定板上500ng/孔的蛋白a固定sig-5、sig-7、sig-f和sig-9。以8μg/ml的浓度添加生物素化的n-末端vwf片段(消化前、用pngasef或唾液酸酶a消化)，并且在洗涤后用hrp缀合的链霉亲和素使结合可视化，在492nm处测量吸光度。抗鸡igy抗体用作对照。
图5显示了o-糖基化簇i和簇ii与siglec的结合试验的结果。492nm处的吸光度与结合至分别鉴定的siglec或对照的簇i片段(浅灰色柱)或簇ii片段(深灰色柱)成比例。通过微量滴定板上500ng/孔的蛋白a固定sig-5、sig-7、sig-f、sig-9和sig-10。以4μg/ml的浓度添加生物素化的簇i和簇ii，并且在洗涤后用hrp缀合的链霉亲和素使结合可视化，在492nm处测量吸光度。抗鸡igy抗体用作阴性对照。
图6显示了在用唾液酸酶a处理之前和之后o-糖基化簇ii与siglec的结合试验的结果。492nm处的吸光度与结合至分别鉴定的siglec或对照的未经处理的簇ii片段(浅灰色柱)或经唾液酸酶a消化的簇ii片段(深灰色柱)成比例。通过微量滴定板上500ng/孔的蛋白a固定sig-5、sig-7、sig-f和sig-9。以2μg/ml的浓度添加生物素化的、消化前的簇ii(浅灰色柱)和生物素化的、经唾液酸酶a消化的簇ii，并且在洗涤后用hrp缀合的链霉亲和素使结合可视化，在492nm处测量吸光度。抗鸡igy抗体用作阴性对照。
图7显示了重组表达的vwf片段seq11和seq12的示意图。
图8显示了在胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶消化、唾液酸酶a消化和凝集素富集后从seq11分离的o-糖肽的maldims谱。鉴定的肽序列为kvtlnpsdpehcqichcdvvnltceacqepgglvvpptdapvspttlyvedisepplhgsaw(seqidno：6)，最后四个氨基酸(有下划线的)对应于连接至该序列c-末端的标签。上部光谱显示了完全o-糖基化的糖肽，底部光谱显示了o-糖苷酶消化后的同一糖肽。
图9显示了在胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶消化、唾液酸酶a消化和凝集素富集后从seq12分离的o-糖肽的maldims谱。鉴定的肽序列是[kvtlnpsdpehcqichcdvvnltceacqepgglvvpptdapvspttlyvedisepplhqepgglvvpptdapvspttlyvedisepplhqepgglvvpptdapvspttlyvedisepplhgsaw(seqidno：7)，最后四个氨基酸(有下划线的)对应于连接至该序列c-末端的标签。上部光谱显示了完全o-糖基化的糖肽，底部光谱显示了o-糖苷酶消化后的同一糖肽。
图10显示了重组多肽seq11和seq12与siglec的结合试验的结果。492nm处的吸光度与结合至分别鉴定的siglec或对照的seq11(深灰色柱)或seq12(浅灰色柱)成比例。通过微量滴定板上500ng/孔的蛋白a固定sig-5、sig-7、sig-f和sig-9。以42nm的等摩尔浓度将带有strep-tag的序列施加于该板，并且在洗涤后用hrp缀合的链霉亲和素使结合可视化，在492nm处测量吸光度。抗鸡igy抗体用作阴性对照，抗vwfpab抗体用作阳性对照。
图11显示了唾液酸酶a处理后重组多肽seq11和seq12与siglec的结合试验的结果。492nm处的吸光度与结合至分别鉴定的siglec或对照的seq11(深灰色柱)或seq12(浅灰色柱)成比例。通过微量滴定板上500ng/孔的蛋白a固定sig-5、sig-7、sig-f和sig-9。将带有strep-tag的序列通过酶法去唾液酸化并以42nm的等摩尔浓度施加于该板，在洗涤后用hrp缀合的链霉亲和素使结合可视化，在492nm处测量吸光度。抗鸡igy抗体用作阴性对照，抗vwfpab抗体用作阳性对照。
图12显示了重组多肽seq11与siglec的浓度依赖性结合的结果和特异性结合曲线的scachard分析的结果。
图13显示了重组多肽seq12与siglec的浓度依赖性结合的结果和特异性结合曲线的scachard分析的结果。
图14显示了对图12和图13中所示曲线进行scachard分析所获得的kd值的总结。
图15显示了为seq11、seq12和全长血浆vwf与重组fviii的结合所计算出的解离亲和常数(kd)值。数据通过spr获得。
图16n-末端vwf片段和c-末端vwf片段对il-12p70和ifn-γ的影响。在不添加(左栏)或添加(右栏)0.1μg/mllps的情况下，用不同浓度的vwf片段培养modc。通过流式微球阵列法同时测定细胞因子的细胞外水平。对于大多数供体，未经刺激的细胞的il-12p70水平和ifn-γ水平低于检出限(bd，il-12p70为0.6pg/ml，ifn-γ为1.8pg/ml)。数据表示为平均值±sem，每个点代表一个供体。
图17显示了在用500nm的vwfn-末端片段刺激modc10分钟后，siglec以及参与siglec信号转导的衔接分子shp-1和shp-2的磷酸化结果。用相同体积的100mmnacl刺激的细胞作为对照。用proteomeprofiler人磷酸化免疫受体阵列试剂盒(proteomeprofilerhumanphospho-immunoreceptorarraykit)分析细胞裂解物中的免疫受体-磷酸化。结果显示为2至4个单独实验的平均像素密度±sem。
具体实施方式
为了提供对说明书和权利要求以及待给出的这些术语的范围的清楚和一致的理解，提供以下定义。
定义
如本文所用的“肽”可以包含任意数量的任意类型的氨基酸，优选天然存在的氨基酸，其优选通过肽键连接。特别地，肽包含至少3个氨基酸，优选至少5个，至少7个，至少9个，至少12个，或至少15个氨基酸。此外，肽的长度没有上限。然而，优选地，根据本发明的肽的长度不超过500个氨基酸，更优选地，其长度不超过300个氨基酸；甚至更优选地，其不长于250个氨基酸。
因此，术语“肽”包括“寡肽”和“多肽”，寡肽通常是指长度为2至10个氨基酸的肽，多肽通常是指长度超过10个氨基酸的肽。
如本文所用的术语“蛋白”是指具有至少60，至少80，优选至少100个氨基酸的肽。术语“多肽”和“蛋白”可互换使用。如本文使用的多肽和蛋白包括化学合成的蛋白以及由基因编码的天然合成蛋白。多肽或蛋白可以从例如人血液的天然来源获得，或者在细胞培养物中作为重组蛋白质产生。
如本文所用的术语“哺乳动物蛋白”是指天然存在的哺乳动物蛋白，即由哺乳动物有机体天然表达的蛋白。因此，哺乳动物蛋白具有天然存在的氨基酸序列和天然存在的翻译后修饰，例如糖基化。根据本发明，术语哺乳动物蛋白和天然存在的哺乳动物蛋白可以互换使用。
如本文所用的术语“人蛋白”是指天然存在的人蛋白，即由人有机体天然表达的蛋白。因此，人蛋白具有天然存在的氨基酸序列和天然存在的翻译后修饰，例如糖基化。根据本发明，术语人蛋白和天然存在的人蛋白可互换使用。
如本文所用的“重组蛋白”或“重组多肽”是由通过分子生物学技术引入到细胞中的由转基因编码的那些。蛋白可以通过化学方法修饰或在翻译后过程中由酶进行修饰。
本发明的术语“融合蛋白”是指通过连接两个或更多个基因、cdna或序列(最初针对单独的蛋白/肽被编码)而产生的蛋白。基因可以天然存在于同一有机体或不同有机体中，或者可以是合成的多核苷酸。
如本文所用的术语“治疗性蛋白”是指具有治疗作用的蛋白或多肽，即用作活性药物成分的蛋白。
两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“序列同一性”描述。出于本发明的目的，使用如emboss软件包(emboss：theeuropeanmolecularbiologyopensoftwaresuite，rice等，2000，trendsgenet.16：276-277)中的needle程序(优选3.0.0版本或更新的版本)所执行的needleman-wunsch算法(needleman和wunsch，1970，j.mol.biol.48：443-453)确定两个氨基酸序列之间的序列同一性程度。使用的可选参数是：空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5和eblosum62(blosum62的emboss版本)取代矩阵。needle标记为“最长同一性”的输出(使用无简要选项获得)用作同一性百分比，并计算如下：
(相同残基×100)/(比对长度-比对中的空位的总数)。
与“包含”、“含有”或“特征在于”同义的过渡术语“包括”是包含性的或开放式的，不排除另外的、未列举的要素或方法步骤。过渡短语“由......组成”不包括权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分，除了通常与之相关的杂质以外。当短语“由......组成”出现在权利要求主体的一个从句中，而不是紧接在前序之后时，它仅限制在该从句中列出的要素；其他要素并不被排除在作为整体的该权利要求之外。过渡短语“基本上由......组成”将权利要求的范围限制为指定的材料或步骤“以及实质上不影响要求保护的发明的基本且新颖的特征的那些”。“基本上由……组成”的权利要求处在以“由……组成”格式书写的封闭式权利要求与以“包含”格式书写的完全开放式权利要求之间的中间立场。
如本文所用的“同源”是指各氨基酸序列、核苷酸序列与参考氨基酸序列和目标核苷酸序列具有特定程度的同一性。同源序列包括使用具有默认参数的常规序列比对工具clustalv时与目标序列至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至99％相同的氨基酸序列。通常，尽管同源物可包括任何数量的保守氨基酸替换，但同源物会包括与目标氨基酸序列相同的活性位点残基。如本文所用的“相同”是指与参考序列的氨基酸或核苷酸序列同一性为100％。
当关于目标细胞、核酸、蛋白质或载体使用时，术语“重组的”表示通过引入异源核酸或蛋白或者通过改变天然核酸或蛋白来修饰目标，或者表示细胞来自如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞内未发现的基因，或者与自然界中发现的表达水平或条件相比，以不同的水平或在不同的条件下表达天然基因。
如本文所用的，关于细胞使用的术语“转化的”、“稳定转化的”和“转基因的”是指细胞含有非天然(例如，异源)核酸序列，所述非天然核酸序列被整合到细胞的基因组中或者作为附加体由细胞携带，所述附加体在多代细胞中得以保持。
如本文所用的术语“片段”是指与天然或野生型蛋白相比，具有一个或多个氨基酸的氨基末端和/或羧基末端缺失但其中剩余的氨基酸序列与由全长cdna推导出的氨基酸序列中的相应位置相同的多肽。片段的长度通常为至少50个氨基酸。
如本文所用的术语“糖基化”是指聚糖与分子例如蛋白的连接。糖基化可以是酶促反应。形成的连接可以通过共价键。因此，如本文所用的糖基化多肽是与聚糖连接的多肽。短语“高度糖基化”是指在所有或几乎所有可用的糖基化位点(例如o-连接或n-连接的糖基化位点)处被糖基化的分子，例如酶。
如本文所用的术语“聚糖”是指多糖或寡糖，或者糖蛋白或糖基化多肽的碳水化合物部分。聚糖可以是单糖残基的均聚物或异聚物。它们可以是直链或支链分子。但聚糖通常含有至少三个糖，并且可以是直链或支链的。聚糖可包括天然糖残基(例如，葡萄糖、n-乙酰葡糖胺、n-乙酰神经氨酸、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、己糖、阿拉伯糖、核糖、木糖等)和/或修饰的糖(例如，2’-氟代核糖、2’-脱氧核糖、磷酸甘露糖、6’磺基n-乙酰葡糖胺等)。
如本文所用的术语“o-聚糖”是指通常发现与哺乳动物糖蛋白的丝氨酸残基和苏氨酸残基共价连接的聚糖。o-聚糖可以经由n-乙酰半乳糖胺(galnac)部分通过o-糖苷键α-连接到丝氨酸或苏氨酸的-oh。其他连接包括α-连接的o-岩藻糖、β-连接的o-木糖、α-连接的o-甘露糖、β-连接的o-glcnac(n-乙酰葡糖胺)、α-连接的o-半乳糖或β-连接的o-半乳糖以及α-连接的o-葡萄糖聚糖或β-连接的o-葡萄糖聚糖。
如本文所用的术语“唾液酸化的”是指已经与唾液酸或其衍生物反应的分子，特别是聚糖。
如本文所用的术语“结合亲和力”或“亲和力”表示两个分子之间，特别是配体与蛋白靶标之间的结合强度。结合亲和力受两个分子之间的非共价分子间相互作用的影响，非共价分子间相互作用例如氢键、静电相互作用、疏水相互作用和范德华力。
如本文所用的免疫反应是指适应性或先天性免疫反应。先天性免疫反应是指非特异性防御机制，该机制在体内出现抗原后被立即激活或在数小时内被激活。这些机制包括物理障碍比如皮肤、血液中的化学物质，以及攻击体内外来细胞的免疫系统细胞。先天性免疫反应由抗原的化学特性激活。适应性免疫反应是指抗原特异性免疫反应。为此，首先必须处理和识别抗原。一旦抗原被识别，适应性免疫系统就会产生大量专门被设计用于攻击该抗原的免疫细胞。
如本文所用，“免疫耐受性”(或简称“耐受性”)是这样的过程：免疫系统因其而不攻击抗原。它以三种形式出现：中枢耐受性，外周耐受性和获得性耐受性。耐受性可以是“天然的”或“自身耐受性”，其中身体不会对自身抗原产生免疫反应，或者耐受性是“诱导的耐受性”，其中通过操纵免疫系统可以产生对抗原的耐受性。
糖基化多肽
根据第一方面，本发明提供糖基化多肽，其包含与哺乳动物蛋白优选人蛋白的至少一个片段相同或同源的氨基酸序列，其中所述糖基化多肽含有一个或多个唾液酸化的o-聚糖，并且其中与所述哺乳动物蛋白或其片段相比，所述多肽对一种或多种siglec具有增加的结合亲和力。
根据本发明的糖基化多肽基于哺乳动物蛋白，即其含有与哺乳动物蛋白相同或同源的氨基酸序列。特别地，哺乳动物蛋白是人蛋白。与糖基化肽的氨基酸序列同源或相同的人蛋白优选为糖基化蛋白。
人蛋白更优选为人血液蛋白。人血液蛋白可以是人凝血因子、转运蛋白、蛋白酶抑制剂、免疫球蛋白、细胞相关的血浆蛋白、载脂蛋白、补体因子、生长因子、抗凝血蛋白(antiangioneticprotein)、高度糖基化蛋白、血液因子或其他人血液蛋白。
特别地，人凝血因子选自纤维蛋白原、纤维蛋白单体、凝血酶原、凝血酶、fv、fx、fix、fvii、fviii、fxi、fxii和fxiii、vonwillebrand因子和adamts13。
应理解，凝血因子fv、fx、fix、fvii、fviii、fxi、fxii和fxiii为失活或活化形式。因此，在本发明的上下文中，对fv、fx、fix、fvii、fviii、fxi、fxii和fxiii的提及分别包括活化形式的fva、fxa、fixa、fviia、fviiia、fxia、fxiia和fxiiia，除非另有明确说明或根据上下文可知在逻辑上不可包括活化形式。因此，例如，在这种情况下，fv、fx、fix、fvii、fviii、fxi、fxii和fxiii可以读作fv/fva、fx/fxa、fix/fixa、fvii/fviia、fviii/fviiia、fxi/fxia、fxii/fxiia、fxiii/fxiiia。
转运蛋白可选自白蛋白、转铁蛋白、铜蓝蛋白、触珠蛋白、血红蛋白和血红素结合蛋白。
合适的蛋白酶抑制剂是例如β-抗凝血酶、α-抗凝血酶、氧化的抗凝血酶、2-巨球蛋白、cl-抑制剂、组织因子通道抑制剂(tfpi)、肝素辅因子ii、蛋白c抑制剂(pai-3)、蛋白c、蛋白s和蛋白z。
免疫球蛋白的实例，例如多克隆抗体(igg)、单克隆抗体、igg1、igg2、igg3、igg4、iga、iga1、iga2、igm、ige、igd和本周氏(bencejones)蛋白。
细胞相关的血浆蛋白可以是例如纤连蛋白、血小板球蛋白、血小板因子4。载脂蛋白的实例是apoa-i、apoa-ii和apoe。
根据本发明的补体因子是例如因子b、因子d、因子h、因子i、c3b-灭活剂、备解素、c4结合蛋白等。
生长因子的实例包括血小板源性生长因子(pdgf)、表皮生长因子(egf)、转化生长因子α(tgf-α)、转化生长因子β(tgf-α)、成纤维细胞生长因子(fgf)和肝细胞生长因子。
抗凝血蛋白包括潜伏型抗凝血酶(latent-antithrombin)、潜伏型抗凝血酶前体(prelatent-antithrombin)、氧化的抗凝血酶和纤溶酶原。
高度糖基化蛋白的实例是α-1-酸性糖蛋白、抗胰凝乳蛋白酶、间α胰蛋白酶抑制剂、α-2-hs糖蛋白、c-反应性蛋白，血液因子可以是例如诸如红细胞生成素、干扰素、肿瘤因子、tpa、gcsf。
其他人血蛋白包括富含组氨酸的糖蛋白、甘露聚糖结合凝集素、c4结合蛋白、纤连蛋白、gc-球蛋白、纤溶酶原/纤溶酶、α-1微球蛋白、c-反应性蛋白。
特别地，人蛋白选自vwf、fviii、fvii、fix、adamts13。
人类中的因子viii由f8基因编码，f8基因在六个轴突(axons)中包含187000个碱基对。转录的mrna具有9029个碱基对的长度并且被翻译成具有2351个氨基酸的蛋白，通过翻译后修饰从该蛋白中除去19个氨基酸。人类中的fviii分子在31氨基酸的侧链上被糖基化(25×n-糖基化，6×o-糖基化)。
翻译后，氨基酸链在导致形成具有约200kda的重链和具有约80kda的轻链的位置上被特异性蛋白酶切割。结构域组织通常表征为a1-a2-b-a3-c1-c2。轻链由结构域a3-c1-c2组成。重链主要由结构域a1-a2-b组成。在血浆中发现的重链具有分子量在90至200kda之间变化的异质性组分。其原因是重链的糖基化的异质性，剪接变体的存在和蛋白水解产物的存在，例如b结构域缺失的重链a1a2。全长fviii的氨基酸序列以swissprot(1986年7月21日)的p00451的氨基酸20至氨基酸2351表示。
人蛋白优选为以swissprot(1986年7月21日)的p00451的氨基酸20至氨基酸2351表示的全长fviii，b结构域缺失的fviii，或其中b结构域的一部分已被接头替换的fviii蛋白。
vwf是存在于哺乳动物血浆中的多聚体型粘附糖蛋白，其具有多种生理功能。在初期止血期间，vwf充当血小板表面上的特异性受体与细胞外基质的组分(例如胶原蛋白)之间的中介物。此外，vwf充当促凝血因子viii的载体和稳定蛋白。vwf在内皮细胞和巨核细胞中合成为2813个氨基酸的前体分子。前体多肽，pre-pro-vwf，由22个残基的信号肽、741个残基的前肽和在成熟血浆血管性血友病因子中发现的2050个残基的多肽组成(fischer等，1994)。全长vwf以uniprot条目p04275表示。
在分泌到血浆中后，vwf以具有不同分子大小的各种物质的形式循环。这些vwf分子由2050个氨基酸残基的成熟亚基的寡聚体和多聚体组成。vwf通常可以在血浆中以多聚体的形式发现，多聚体的大小约为500至20000kda(furlan等，1996)。特别地，vwf具有uniprot条目p04275的任何序列的氨基酸序列。更优选地，vwf蛋白以seqidno：1表示。
糖基化多肽可以例如含有如wo2015/185758a2中定义的vwf片段。如wo2015/185758a2中所示，其中定义的fviii和vwf片段的复合物与单独的fviii相比，表现出与磷脂膜的结合降低，并且与fviii和全长vwf的复合物相比，表现出与胶原iii和肝素的结合降低。
在这方面，vwf片段特别是以seqidno.1的氨基酸764开始的片段。seqidno：1的氨基酸764至氨基酸1035包含vwf的fviii结合结构域。
优选以seqidno.1的氨基酸764开始的vwf片段优选以seqidno：1的1905至2153范围内的氨基酸结束。该片段更优选以vwf片段的2030至2153范围内的氨基酸结束。更优选地，vwf片段以seqidno：1的2100至2153范围内的氨基酸结束。
应理解，与由糖基化肽中包含的氨基酸序列定义的哺乳动物蛋白或片段相比，糖基化多肽具有增强的结合亲和力。因此，如果糖基化多肽包含全长哺乳动物蛋白的氨基酸序列，则与全长哺乳动物蛋白相比，糖基化多肽对siglec具有更高的亲和力。
另一方面，如果糖基化多肽包含由哺乳动物蛋白的亚序列定义的哺乳动物蛋白片段，则与源自天然存在的蛋白的相同片段相比，糖基化多肽具有增强的结合亲和力。例如，如果糖基化多肽中的氨基酸序列与vwf片段相同或同源，则与从血浆源vwf的片段化获得的相同片段相比，根据第一方面的糖基化多肽对一种或多种siglec具有增强的结合亲和力。
如实施例中所示，确定了至少特异性结合siglec：sig-5、sig-7、sig-8和sig-9的vwf的聚糖结构(参见实施例1)。因此，根据第一方面的一个实施方案，一种或多种siglec选自sig-5、sig-7、sig-8和sig-9。
发明人惊奇地发现，在人vwf中，o-聚糖负责结合sig-5、sig-7、sig-8和sig-9。相反，n-聚糖没有显示出与这些siglec的任何结合(参见实施例2)。这尤其令人惊讶，因为到目前为止，正是n聚糖被表明与siglec相互作用(lai等，2015)。
发明人进一步确定，o-聚糖不仅必须被唾液酸化以结合sig-5、sig-7、sig-8、sig-9，而且还必须存在最小百分比的核心2聚糖(参见实施例4)。
因此，siglec结合以及相应的减少的免疫反应基于，与哺乳动物蛋白质或其片段的唾液酸化的核心2o-聚糖的数量相比，糖基化蛋白中唾液酸化的核心2o-聚糖的数量或百分比增加。
由于结构相似性，假设唾液酸化的延伸核心1o-聚糖具有与唾液酸化的核心2聚糖相同的效果。因此，为了增加上文定义的对siglec的结合亲和力，优选增加唾液酸化的核心2和延伸核心1o-聚糖的总数量或总百分比。
因此，根据一个实施方案，糖基化多肽的唾液酸化的核心2和/或延伸核心1o-聚糖的数量高于哺乳动物蛋白或其片段的唾液酸化的核心2和/或延伸核心1o-聚糖的数量。在这方面，与哺乳动物蛋白的核心2和/或延伸核心1o-聚糖的百分比相比，唾液酸化的核心2和/或延伸核心1o-聚糖的百分比也增加。
这意味着糖基化多肽的唾液酸化的核心2o-聚糖和唾液酸化的延伸核心1o-聚糖的总数量高于哺乳动物蛋白或其片段的唾液酸化的核心2o-聚糖和唾液酸化的延伸核心1o-聚糖的总数量。
或者，可以仅增加唾液酸化的核心2o-聚糖的数量。在这方面，与哺乳动物蛋白的核心2o-聚糖的百分比相比，唾液酸化的核心2o-聚糖的百分比也增加。
表现出结合的siglec参与人和小鼠的免疫反应。siglec共同具有n端v-setig结构域和可变数量的c2-setig结构域，n端v-setig结构域结合含有唾液酸的配体，c2-setig结构域使配体结合侧延伸远离膜表面。
此外，许多siglec具有细胞质酪氨酸基序，包括免疫受体酪氨酸抑制基序(itim)和itim样基序，通常存在于参与细胞信号转导调节的共受体中。其他siglec不含酪氨酸基序，但含有带正电荷的跨膜跨区，该跨膜跨区允许与衔接蛋白结合。siglec不识别危险相关的分子模式(damps)，而是识别“自身”的决定子。
siglec“顺式”结合相同细胞上的这种唾液酸化的自身配体，“反式”结合相邻细胞上的这种唾液酸化的自身配体。人siglec通常被称为sig-1至sig-14。小鼠siglecsig-e、sig-f和sig-g分别是人siglecsig-9、sig-8和sig-10的直系同源物。
sig-1至sig-4还分别称为唾液酸粘附素(sialoatesin)、cd22cd33和mag。cd22和sig-10位于b细胞上，sig-5位于中性粒细胞和单核细胞上，sig-7位于nk细胞上，sig-8位于嗜酸性粒细胞上，sig-9位于单核细胞、中性粒细胞和树突细胞上(paulsen等，2012)。
siglec结合各种不同的聚糖结构。siglecsig-2、sig-5、sig-7、sig-8、sig-9和sig-10中的每一个具有不同的聚糖偏好(paulson等，2012)。siglec在先天性和适应性免疫中发挥作用。特别是位于人和小鼠的b细胞上的sig-2和sig-10。
根据paulsen等人的观点，sig-2和sig-10似乎协同地促成外周b细胞耐受性。另外，siglec似乎充当toll样受体(trl)的抑制性共受体。在这方面，证明了sig-7或sig-9与活化受体的交联分别导致了nk细胞抗肿瘤细胞的细胞溶解活性的抑制和从肥大细胞释放化学中介物。
此外，sig-e(sig-9)和sig-11通过固定化抗体进行交联导致对巨噬细胞中响应于lps的细胞因子产生的抑制。
值得注意的是，已证明巨噬细胞系中sig-5和sig-9的大量(topic)表达响应于肽聚糖、atlr2配体、lps和cpg而抑制tnf-α产生并增强il-10产生。此外，lps诱导的巨噬细胞中的sig-e(sig-9)的表达表现出影响trl信号转导的作用。此外，唾液酸化的病原体通过siglec抑制免疫反应。作为一个实例，b组链球菌表达荚膜多糖上的neu-acα-1galβ-14glcnac残基并在中性粒细胞上募集siglec-9，导致对中性粒细胞的杀微生物功能的抑制。
因此，在不希望囿于理论的情况下，认为在抗原呈递细胞(例如树突细胞)上与siglec的结合导致该细胞表面上促炎受体表达的下调和免疫抑制受体表达的上调。而且，该结合导致抗炎细胞因子的产生增加以及促炎细胞因子的产生降低，并因此导致对t细胞增殖和抗体产生的抑制。因此，当将糖基化多肽施用于患者时，siglecsig-5、sig-7、sig-8和sig-9的结合导致免疫反应降低或免疫耐受性增强。
因此，根据第一方面的糖基化多肽还可以定义为包含与哺乳动物蛋白优选人蛋白的至少一个片段相同或同源的氨基酸序列的糖基化多肽，其中所述糖基化多肽含有一个或多个唾液酸化的o-聚糖，并且其中与所述哺乳动物蛋白或其片段相比：
-人对糖基化多肽的免疫反应降低；和/或
-人对糖基化多肽的免疫耐受性增强。
另一方面，本发明第一方面的另一结构定义是糖基化多肽，其包含与哺乳动物蛋白优选人蛋白的至少一个片段相同或同源的氨基酸序列，其中所述糖基化多肽含有一个或多个唾液酸化的o-聚糖，并且其中所述糖基化多肽的唾液酸化的核心2o-聚糖和唾液酸化的延伸核心1o-聚糖的总数量高于所述哺乳动物蛋白或其片段中唾液酸化的核心2o-聚糖和唾液酸化的延伸核心1o-聚糖的总数量。
优选地，糖基化多肽包含与哺乳动物蛋白优选人蛋白的至少一个片段相同或同源的氨基酸序列，其中所述糖基化多肽含有一个或多个唾液酸化的o-聚糖，并且其中所述糖基化多肽的唾液酸化的核心2o-聚糖的数量高于所述哺乳动物蛋白或其片段的唾液酸化的核心2o-聚糖的总数量。
为了将o-聚糖偶联到糖基化多肽的氨基酸序列，糖基化多肽含有一个或多个o-糖基化位点。糖基化多肽的o-糖基化位点可以是标准o-糖基化位点，丝氨酸(ser)和苏氨酸(thr)。然而，在本发明的上下文中，已经描述的o-聚糖与酪氨酸(tyr)、羟基赖氨酸(羟基-lys)或羟脯氨酸(hydroxy-pro)的结合也是可行的。因此，糖基化多肽中的一个或多个o-糖基化位点可以选自任何可能的o-糖基化位点中的ser、thr、tyr、羟基-lys和羟基-pro。优选地，o-糖基化位点选自ser和thr。
标准糖基化位点ser和thr通常显示出对o-聚糖的最高占据率。因此，根据一个实施方案，一个或多个糖基化位点选自ser和thr。
在本发明的上下文中，出于实际原因，术语“糖基化多肽”以单数形式使用。通常，糖基化多肽会以相同类型的多肽的组合物的形式存在。在这方面，早期形式的糖基化多肽是具有相同氨基酸序列但在糖基化方面存在变化的糖基化多肽的组合物。例如，并非组合物的所有单个分子都可被糖基化至100％。此外，与特定o-糖基化位点结合的聚糖可能出现差异。因此，本发明还涉及至少包含第一类的糖基化多肽分子的组合物，其中该第一类的蛋白分子的氨基酸序列与哺乳动物蛋白优选人蛋白的至少一个片段相同或同源并且所述蛋白质分子含有一个或多个糖基化位点。
优选地，多肽含有一个或多个糖基化位点簇。尽管单个糖基化位点可能足以结合siglec，但这是假设o-糖基化位点簇的形成导致与siglec的结合得到改善。通常在哺乳动物蛋白中观察到糖基化位点的簇形成，实例是在铰链区中含有成簇的o-聚糖的人iga(参见franc等人，2013)和人粘蛋白(参见guzman-aranguez和argüeso2010)。
在这方面，在o-糖基化簇中已经考虑了紧邻的两个o-糖基化位点。因此，一个或多个o-糖基化位点簇含有至少两个o-糖基化位点。o-糖基化位点簇可具有不同数量的o-糖基化位点。例如，糖基化多肽可含有具有两个糖基化位点的一个簇和具有三个糖基化位点的第二簇。在一个簇的o-糖基化位点之间也可存在n-糖基化位点。优选地，在o-糖基化簇中没有n-糖基化位点。
此外，一个簇可含有三个o-糖基化位点和另一簇可含有四个o-糖基化位点。许多个三o-糖基化位点形成三个相邻的o-聚糖，所述三个相邻的o-聚糖都可以与siglec相互作用，并因此产生增强的效果。根据一个实施方案，一个或多个o-糖基化位点簇优选含有至少三个o-糖基化位点。
在vwf中，存在两个簇，每个簇具有四个o-糖基化位点。因此，优选地，多肽含有一个或多个具有至少四个o-糖基化位点的簇。目前，假设o-糖基化位点的数量越高，结合亲和力越高。
o-糖基化位点簇可以由氨基酸序列中短距离内的两个或更多个o-糖基化位点定义。这些簇也称为“序列簇”。然而，由于糖基化多肽的三维组装，o-糖基化簇还可以包括在氨基酸序列中距离更远但在折叠之后紧邻的o-糖基化位点。后一种类型的簇也称为“折叠簇”。
vwfo-糖基化簇2在20个氨基酸内含有4个o-糖基化位点，其排列成β转角。因此，o-聚糖或o-糖基化位点的距离为
折叠簇可以跨越超过100个氨基酸的氨基酸序列。然而，优选地，簇的空间排列不超过
根据一个实施方案，一个或多个簇，即序列簇，在十个氨基酸内含有至少一个o-糖基化位点。如果o-糖基化位点延伸得更远，则认为与o-糖基化位点结合的o-聚糖可能不一起作用于含有siglec的相同细胞。
优选地，一个或多个簇在四个氨基酸内含有至少一个o-糖基化位点。由于o-糖基化位点的平均距离为四个氨基酸，因此o-糖基化位点很可能在折叠后也非常接近。空间上的接近允许簇中的聚糖在同一细胞上与siglec协同作用。
更优选地，一个或多个簇在三个氨基酸中含有至少一个o-糖基化位点。如实施例中所示，所测试的vwf肽含有在两个氨基酸中具有一个o-糖基化位点的簇。因此，根据优选的实施方案，一个或多个簇在两个氨基酸中含有至少一个糖基化位点。
如实施例中所示，一个这样的o-糖基化簇已经足以与siglec有强的相互作用。此外，通过比较两种vwf多肽还表明，更高数量的o-糖基化位点簇导致肽对siglec(特别是sig-5、sig-7、sig-8和sig-9)的结合亲和力增强。因此，糖基化多肽优选包含至少两个糖基化簇，更优选至少三个糖基化簇。
在不希望囿于理论的情况下，簇靠得越近，糖基化多肽与siglec的结合亲和力越高。在这方面，如果存在两个簇，则它们优选由少于100个氨基酸隔开。小于100个氨基酸的距离允许聚糖簇在siglec结合中的协同作用。更优选地，两个簇由少于50个氨基酸隔开。最优选地，两个簇由少于30个氨基酸隔开。
根据一个实施方案，任意两个相邻簇之间的距离小于100个氨基酸，优选地，糖基化多肽内任意两个簇之间的距离小于50个氨基酸。更优选地，任意两个相邻簇之间的距离小于30个氨基酸。
相比于与其序列同源或相同的人蛋白，糖基化多肽优选含有至少一个另外的o-糖基化位点簇。
如上所定义的，与所有糖基化多肽一样，根据本发明的糖基化多肽代表糖基化多肽分子的组合物。这些分子在糖基化模式方面表现出一定程度的异质性，特别是并非所有的糖基化位点都必然被o-聚糖占据。被o-聚糖占据尤其取决于其中产生推荐的糖基化多肽的宿主细胞。优选地，选择宿主细胞，即表达系统，使得o-糖基化位点的占据百分比高于70％。当占据低于70％时，对于siglec结合而言，可能存在不充足的o-聚糖。优选地，超过80％的o-糖基化位点被o-聚糖占据。更优选地，超过90％的o-糖基化位点被o-聚糖占据。根据优选的实施方案，超过95％的o-糖基化位点被o-聚糖占据。
与糖基化多肽连接的聚糖的组成取决于生产方法。o-聚糖可以是天然聚糖或合成聚糖。例如，天然o-聚糖是具有以下核心结构的聚糖：
核心1o-聚糖：galβ1→3galnacα1→ser/thr
延伸核心1：o-聚糖：galβ1→4glcnacβ1→3galβ1→3galnacα1→ser/thr
核心2o-聚糖：galβ1→3(galβ1→3glcnacβ1→6)galnacα1→ser/thr
已知siglec与唾液酸结合。与此相符的是，在实施例中显示去唾液酸化消除了与siglec的结合(参见实施例3)。因此，证实了o-聚糖的唾液酸化是结合的先决条件。因此，优选为糖基化多肽中o-聚糖的高百分比的唾液酸化。
因此，糖基化多肽的o-聚糖优选是唾液酸化的，即含有至少一个唾液酸作为聚糖分子的一部分。
优选地，唾液酸化的o-聚糖含有以α2-3糖苷键连接的至少两个唾液酸。或者，唾液酸化的o-聚糖还可含有以α2-8糖苷键连接的两个唾液酸。唾液酸化的o-聚糖还可以包含α2-3和α2-8糖苷键连接。根据一个实施方案，唾液酸化的o-聚糖含有以2-3和/或2-8糖苷键连接的至少三个唾液酸。糖基化多肽中的唾液酸化的o-聚糖特别是核心1o-聚糖或核心2o-聚糖。下面给出了核心1o-聚糖、延伸核心1o-聚糖和核心2o-聚糖结构的概述：
唾液酸化的核心1o-聚糖：neunacα2→3galβ1→3galnacα1→ser/thr
唾液酸化的延伸核心1o-聚糖：
neunacα2→3galβ1→4glcnacβ1→3galβ1→3galnacα1→ser/thr
唾液酸化的核心2o-聚糖：neunacα2→3galβ1→4glcnacβ1→6(neunacα2→3galβ1→3)galnacα1→ser/thr
核心1o-聚糖和核心2o-聚糖和/或延伸核心1o-聚糖可能都需要存在于糖基化多肽上。根据一个实施方案，糖基化多肽包含唾液酸化的核心1o-聚糖以及唾液酸化的核心2o-聚糖和/或延伸核心1o-聚糖。如实施例4中所示，基于o-聚糖的总数，核心2聚糖的百分比为2.5％对于siglec相互作用是不足的。因此，根据糖基化多肽的一个实施方案，基于o-聚糖的数量，核心2o-聚糖的百分比为至少5％。在同一的实施例中，显示基于o-聚糖的数量的核心2o-聚糖百分比为10.78％的簇2导致了与siglec的强相互作用。因此，根据优选的实施方案，基于o-聚糖的数量，糖基化多肽中核心2o-聚糖的百分比为至少8％。更优选地，基于o-聚糖的数量，核心2o-聚糖的百分比为至少10％。
在实施例7中，确定了重组产生的vwf肽的约80％的糖肽分子含有核心2o-聚糖或延伸核心1聚糖。因此，基于o-聚糖的总数量，唾液酸化的核心2o-聚糖和/或延伸核心1o-聚糖的百分比为至少20％。因此，根据一个实施方案，基于o-聚糖的数量，糖基化多肽中核心2o-聚糖和/或延伸核心1o-聚糖的浓度为至少15％，更优选至少18％，最优选至少20％。
糖基化多肽中核心2o-聚糖的数量或百分比，特别是带有核心2o-聚糖的糖基化多肽的单分子的数量或百分比可通过以下任何一种策略提高：
一种策略是使用酶β1,6-n-乙酰氨基葡萄糖转移酶。该酶参与核心2o-聚糖的形成。因此，通过在过表达酶β1,6-n-乙酰氨基葡萄糖转移酶的细胞系中表达糖基化多肽可以增加带有核心2的分子和/或每多肽分子的核心2o-聚糖的数量。
另一种选择是在源自癌细胞系的表达细胞系中表达糖基化多肽。癌细胞系经常被证明用于产生具有更高量的核心2o-聚糖的糖基化蛋白。
增加延伸核心1的百分比的一种策略是使用酶β1,3-n-乙酰氨基葡萄糖转移酶。该酶参与延伸核心1o-聚糖的形成。因此，通过在过表达β1,6-n-乙酰氨基葡萄糖转移酶的细胞系中表达糖基化多肽可以增加带有延伸核心1的分子和/或每多肽分子的延伸核心1-o聚糖的数量。
通过化学合成聚糖可以增加核心2和/或延伸核心1唾液酸化的o-聚糖的浓度。
因此，基于本发明的教导，技术人员可以改变聚糖从而确定具有高结合亲和力的合成聚糖。根据优选的实施方案，o-聚糖是天然聚糖。
根据一个实施方案，糖基化多肽中的至少一部分唾液酸化的核心2o-聚糖含有与半乳糖(gal)或n-乙酰氨基葡萄糖苷酶(glcnac)连接的硫酸基团或与核心2型o-聚糖中的glcnac连接的岩藻糖，这些代表siglec7、8和8的高亲和力结合配体(paulson等人，2012)。
本领域技术人员已知如何产生额外的o-糖基化位点的不同方法。由于o-糖基化位点的数量增加，糖基化多肽与人蛋白或其片段相比可具有增加数量的唾液酸化的核心2o-聚糖。
在这方面，糖基化多肽可以是融合蛋白，其中含有一个或多个o-糖基化位点的第二氨基酸序列共价连接至与人蛋白或其片段相同或同源的氨基酸序列(第一氨基酸序列)。第二氨基酸序列可以位于相对于第一氨基酸序列的n末端。或者，第二氨基酸序列可以位于相对于第一氨基酸序列的c末端。糖基化多肽可以在第一个氨基酸序列的n-和c-末端含有另外的氨基酸序列。
因此，在这种融合蛋白中，可以存在第二氨基酸序列和任选的其他氨基酸序列，其主要含有o-糖基化位点，特别是o-糖基化簇。o-糖基化位点簇可以基于已知哺乳动物特别是人蛋白糖基化蛋白的氨基酸序列。
第二氨基酸序列可包含一个或多个以下o-糖基化簇：
在序列seqidno：8、seqidno：10、seqidno：12、seqidno：14、seqidno：16、seqidno：18和seqidno：20中，x代表任何天然氨基酸。
在vwf中发现seqidno：9和seqidno：11，而seqidno：13、seqidno：15、seqidno：17、seqidno：19和seqidno：21源自fviii的b结构域。
第二氨基酸序列可包含选自seqidno：8、seqidno：10、seqidno：12、seqidno：14、seqidno：16、seqidno：18和seqidno：20的一个或多个序列。第二氨基酸序列可含有所述序列的组合。第二氨基酸序列优选包含序列seqidno：8、seqidno：10、seqidno：12、seqidno：14、seqidno：16、seqidno：18和seqidno：20之一的多个拷贝。第二氨基酸序列可以进一步包含seqidno：8、seqidno：10、seqidno：12、seqidno：14、seqidno：16、seqidno：18和seqidno：20的多个拷贝的组合。
第二氨基酸序列可包含选自seqidno：9、seqidno：11、seqidno：13、seqidno：15、seqidno：17、seqidno：19和seqidno：21的一个或多个序列。第二氨基酸序列可含有所述序列的组合。第二氨基酸序列优选包含序列seqidno：9、seqidno：11、seqidno：13、seqidno：15、seqidno：17,seqidno：19和seqidno：21之一的多个拷贝。第二氨基酸序列可以进一步包含seqidno：9、seqidno：11、seqidno：13、seqidno：15、seqidno：17、seqidno：19和seqidno：21的多个拷贝的组合。
根据优选的实施方案，第二氨基酸序列含有seqidno：8的一个或多个拷贝。
此外，第二氨基酸序列可以与天然存在的糖基化蛋白的序列具有一定百分比的同一性。与天然存在的蛋白的同一性水平优选为80％，更优选至少90％。
或者，第二氨基酸序列中o-糖基化位点的氨基酸序列可以是全合成的。如本文所用的全合成的氨基酸序列是不基于已知蛋白特别是哺乳动物蛋白的序列。
根据一个实施方案，糖基化多肽中将第二氨基酸序列连接至与人蛋白或其片段相同或同源的氨基酸序列的共价接头选自肽键、化学接头或糖苷键。在这方面，合适的化学接头是：
-胺-胺接头，如双马来酰亚胺基乙烷、1,8-双马来酰亚胺基-二乙二醇；
-胺-巯基接头，如琥珀酰亚胺基碘乙酸酯、n-α-马来酰亚胺基乙酰氧基琥珀酰亚胺酯；
-羧基-胺接头，二环己基碳二亚胺，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐；以及
-巯基-碳水化合物接头，例如n-β-马来酰亚胺基丙酸酰肼，n-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼。
根据本发明的融合蛋白的接头可以通过间隔肽序列形成，所述间隔肽序列分隔开定义融合蛋白的第一氨基酸序列和第二氨基酸序列。间隔肽序列可以促进单个蛋白质或肽部分的正确折叠，并且可以使单个蛋白质或肽部分更可能保留其各自的功能特性。间隔肽序列可以在构成完整融合蛋白dna序列的单个dna片段的框内组装期间(即重叠pcr或dna连接期间)插入至融合蛋白dna序列中。
肽键具有以下优点：完全糖基化的多肽可以作为融合蛋白一次表达。
第二氨基酸序列可以通过化学接头添加至第一氨基酸序列，因此在蛋白表达后添加。
如实施例中所示，特别是含有o-糖基化簇1和/或o-糖基化簇2的vwf和其片段与siglec结合。
因此，根据一个实施方案，人蛋白是fviii或其片段。因此，糖基化多肽中相对于fviii的序列同一性为至少90％，更优选至少95％，最优选至少98％。根据优选的实施方案，第一氨基酸序列与seqidno：1的氨基酸764至氨基酸1268相同或同源。
第二氨基酸序列的长度优选为5至100个氨基酸，更优选10至80个氨基酸，最优选20至70个氨基酸。
根据一个实施方案，第二氨基酸与seqidno：1的氨基酸1238至氨基酸1268至少98％同源。优选地，第二氨基酸序列与seqidno：1的氨基酸1238至氨基酸1268相同。根据更优选的实施方案中，第二氨基酸序列与seqidno：1的氨基酸1238至氨基酸1268的两个连续拷贝至少98％同源。优选地，第二氨基酸序列与seqidno：1的氨基酸1238至氨基酸1268的两个连续拷贝相同。
根据本发明的代表性融合蛋白是seq12。seq12具有以下氨基酸序列(seqidno：2)：
以下序列(seqidno：3)代表具有另外的12个氨基酸信号肽(粗体和加下划线的)的seq12。该肽的表达提供seq12的单体形式。信号肽被酶促切割掉。
根据本发明的另一种代表性融合蛋白是包含seq12以及具有信号肽(粗体和加下划线的)的前肽(粗体)的pro-seq12。pro-seq12由seqidno：4示出：
pro-seq12的表达导致二聚体的形成。该肽二聚体在切割前肽后仍保留。
根据一个实施方案，糖基化多肽含有与seqidno：1的氨基酸764至氨基酸1268至少98％相同的第一氨基酸序列。第二氨基酸序列与seqidno：1的氨基酸1238至氨基酸1268的两个连续拷贝至少98％同源。
根据一个实施方案，糖基化多肽通过在人细胞系中表达而产生。通常，任何人细胞系都适合于糖基化多肽的表达。特别地，用hek细胞系获得有利的糖基化肽。
用于产生糖基化多肽的hek细胞系的实例是hek293f、flp-intm-293(invitrogen,r75007)、293(
适合作为表达用的宿主细胞的其他细胞系包括源自人髓性白血病细胞的细胞系。宿主细胞的具体实例是k562、nm-f9、nm-d4、nm-h9d8、nm-h9d8-e6、nmh9d8-e6q12、gt-2x、gt-5s和源自任何所述宿主细胞的细胞。k562是存在于美国典型培养物保藏中心(atccccl-243)中的人髓性白血病细胞系。其余的细胞系源自k562细胞，并且已针对特定的糖基化特征而被选择。
根据另一个实施方案，一个或多个糖基化位点位于与哺乳动物蛋白或其片段同源或相同的氨基酸序列内。这应理解为，不存在于哺乳动物或片段的氨基酸序列内的o-糖基化位点，存在于糖基化多肽内同源或相同的氨基酸序列内。
可以将与哺乳动物蛋白或其片段同源或相同的氨基酸序列内的一个或多个o-糖基化位点插入至该序列内。或者，一个或多个o-糖基化位点可以替换哺乳动物蛋白的氨基酸。氨基酸替换是优选的，因为它不改变多肽链的大小，因此它不太可能影响蛋白的三维结构。
氨基酸序列内的一个或多个o-糖基化位点优选为在该序列的不形成蛋白的结合位点或活性中心的部分中。此外，优选将一个或多个o-糖基化位点添加到将被暴露于折叠蛋白表面的氨基酸位置。为了对蛋白的活性或完整性产生最小影响，可以将一个或多个o-糖基化位点添加到蛋白的柔性环中。
在fviii蛋白的情况下，优选将一个或多个o-糖基化位点添加到b结构域中的位置或替换b结构域。
在一个实施方案中，通过与一种或多种生物相容性聚合物连接来修饰糖基化多肽，以改善例如半衰期或稳定性。合适的生物相容性聚合物包括聚亚烷基氧化物例如但不限于聚乙二醇(peg)、葡聚糖、多聚唾液酸(colominicacid)或其他基于碳水化合物的聚合物、氨基酸聚合物、生物素衍生物、聚乙烯醇(pva)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯-共-马来酸酐、聚苯乙烯-共-苹果酸酐、聚恶唑啉、聚丙烯酰吗啉、肝素、白蛋白、纤维素、壳聚糖的水解产物、淀粉如羟乙基淀粉和羟丙基淀粉、糖原、琼脂糖及其衍生物、瓜尔胶、普鲁兰、菊粉、黄原胶、角叉菜胶、果胶、海藻酸水解产物、其他生物聚合物及其任何等同物。在一个实施方案中，聚合物是聚乙二醇(peg)。在另一个实施方案中，聚合物是甲氧基聚乙二醇(mpeg)。其他有用的聚亚烷基二醇化合物是聚丙二醇(ppg)、聚丁二醇(pbg)、peg-缩水甘油醚(epox-peg)、peg-氧羰基咪唑(cdi-peg)、支化聚乙二醇、线性聚乙二醇、叉状聚乙二醇和多臂或“超支化”聚乙二醇(星状-peg)。生物相容性聚合物优选通过以下残基之一与多肽连接：-sh、oh、-cooh。
根据一个实施方案，糖基化多肽能够形成二聚体或多聚体。二聚体特别是多聚体的形成增加了紧邻的o-聚糖或o-聚糖簇的数量。因此，更多的o-聚糖可以在一个细胞上与siglec相互作用。此外，o-聚糖可以与几个紧邻在一起的、表达siglec的细胞相互作用，从而增强免疫耐受性。
多聚化可以是糖基化多肽所基于的哺乳动物蛋白的氨基酸序列中的多聚化结构域的结果。或者，可以通过将多聚化结构域引入至糖基化多肽的氨基酸序列中来形成糖基化多肽的多聚体。
形成多聚体的、根据本发明的融合蛋白的实例是pro-seq12-mult，其包含seq12、具有信号肽(粗体和加下划线的)的肽原(粗体)，以及多聚化序列，vwf的“半胱氨酸结结构域”(加下划线的)。pro-seq12-mult由seqidno：5表示：
或者，可以通过与聚合物或脂质体结合来获得糖基化多肽的多聚化。
糖基化多肽的用途
如上所定义的，发明人已发现具有包含唾液酸化的核心2o-聚糖和/或唾液酸化的延伸核心1o-聚糖的聚糖组合物的蛋白与所定义的siglec相互作用，并因此影响哺乳动物的免疫系统的细胞。特别地，糖基化多肽表现出降低的免疫反应。因此，如果与第二蛋白一起施用，这种糖基化多肽可以影响患者对第二蛋白的免疫反应。因此，具有唾液酸化的核心2o-聚糖和/或唾液酸化的延伸核心1o-聚糖的糖基化多肽可用于改变特别是降低患者对蛋白(特别是联合施用的治疗性蛋白)的免疫反应。
因此，根据第二方面，本发明涉及糖基化多肽用于降低治疗性蛋白的免疫反应的用途，所述糖基化多肽包含一个或多个唾液酸化的o-聚糖并表现出与一种或多种siglec的结合，所述一种或多种siglec选自sig-5、sig-7、sig-8和sig-9。
优选地，用于降低免疫反应的糖基化多肽包括唾液酸化的核心2o-聚糖和/或唾液酸化的延伸核心1o-聚糖。更优选地，糖基化多肽定义为根据第一方面的糖基化多肽。
该用途还可以描述为用治疗性蛋白治疗患者的方法，其中该方法包括施用糖基化多肽用于降低治疗性蛋白的免疫反应，所述糖基化多肽包含一个或多个唾液酸化的o-聚糖并表现出与一种或多种siglec的结合，所述一种或多种siglec选自sig-5、sig-7、sig-8和sig-9。
组合物和蛋白复合物
因此，根据本发明的概念，即通过例如添加一个或多个唾液酸化的核心2-o聚糖而获得的对人蛋白的免疫反应降低，不仅可以通过制备融合蛋白或通过插入o-糖基化位点或用o-糖基化位点替换氨基酸来实现，还可以通过添加根据第二方面的用途中所描述的其他多肽来实现。这导致形成糖基化多肽和第二多肽的组合物，该组合物的免疫反应将降低。
因此，在第三方面，本发明还涉及包含第一多肽和第二多肽的组合物，其中第一多肽是含有一个或多个唾液酸化的o-聚糖的糖基化多肽，第二多肽含有与第二哺乳动物蛋白特别是人蛋白同源或相同的氨基酸序列，其中与第二多肽相比，该组合物对选自一种或多种siglec的siglec具有增强的结合亲和力，所述一种或多种siglec选自sig-5、sig-7、sig-8和sig-9。
还可以提供结合配偶体，其为对siglec具有增强的结合亲和力的多肽，使得两种多肽的复合物与该多肽相比对siglec具有增强的结合亲和力。
因此，根据第三方面，本发明提供了包含第一多肽和第二多肽的组合物，其中第一多肽是含有一个或多个唾液酸化的o-聚糖的糖基化多肽，第二多肽含有与第二哺乳动物蛋白特别是人蛋白同源或相同的氨基酸序列，其中与第二多肽相比，
-该组合物对siglec具有增强的结合亲和力；和/或
-人对该复合物的免疫反应降低；和/或
-人对该复合物的免疫耐受性增强。
第二人蛋白优选是人血液蛋白。人血液蛋白可以是人凝血因子、转运蛋白、蛋白酶抑制剂、免疫球蛋白、细胞相关的血浆蛋白、载脂蛋白、补体因子、生长因子、抗凝血蛋白、高度糖基化蛋白、血液因子或其他人血液蛋白。
特别地，人凝血因子选自纤维蛋白原、纤维蛋白单体、凝血酶原、凝血酶、fv/fva、fx/fxa、fix/fixa、fvii/fviia、fviii/fviiia、fxi/fxia、fxii/fxiia、fxiii/fxiiia、血管性血友病因子和adamts13。
转运蛋白可选自白蛋白、转铁蛋白、铜蓝蛋白、触珠蛋白、血红蛋白和血红素结合蛋白。
合适的蛋白酶抑制剂是例如β-抗凝血酶、α-抗凝血酶、氧化的抗凝血酶、2-巨球蛋白、cl-抑制剂、组织因子通道抑制剂(tfpi)、肝素辅因子ii、蛋白c抑制剂(pai-3)，蛋白c、蛋白s和蛋白z。
免疫球蛋白的实例例如多克隆抗体(igg)、单克隆抗体、igg1、igg2、igg3、igg4、iga、iga1、iga2、igm、ige、igd和本周氏蛋白。
细胞相关的血浆蛋白可以是例如纤连蛋白、血小板球蛋白、血小板因子4。载脂蛋白的实例是apoa-i、apoa-ii和apoe。
根据本发明的补体因子例是如因子b、因子d、因子h、因子i、c3b-灭活剂、备解素、c4结合蛋白等。
生长因子的实例包括血小板源性生长因子(pdgf)、表皮生长因子(egf)、转化生长因子α(tgf-α)、转化生长因子β(tgf-α)、成纤维细胞生长因子(fgf)和肝细胞生长因子。
抗凝血蛋白包括潜伏型抗凝血酶、潜伏型抗凝血酶前体、氧化的抗凝血酶和纤溶酶原。
高度糖基化蛋白的实例是α-1-酸性糖蛋白、抗胰凝乳蛋白酶、间α胰蛋白酶抑制剂、α-2-hs糖蛋白、c-反应性蛋白。血液因子可以是例如诸如红细胞生成素、干扰素、肿瘤因子、tpa、gcsf。
其他人血蛋白包括富含组氨酸的糖蛋白、甘露聚糖结合凝集素、c4结合蛋白、纤连蛋白、gc-球蛋白、纤溶酶原/纤溶酶、α-1微球蛋白、c-反应性蛋白。
特别地，第二人蛋白选自vwf、fviii、fvii/fviia、fix、adamts13。
特别地，根据第三方面的组合物是第一多肽和第二多肽的蛋白复合物。
第一多肽优选被糖基化并含有一个或多个唾液酸化的o-聚糖。第二多肽含有与哺乳动物蛋白特别是人蛋白相同的氨基酸序列。为了降低人对第二多肽的免疫反应，第一多肽与第二多肽形成复合物。
对于蛋白复合物形成，特别地，第一多肽包含允许与第二多肽结合的结合结构域，和糖基化结构域。特别地，该糖基化结构域包含一个或多个o-糖基化位点，优选o-糖基化簇。
根据一个实施方案，第二多肽是fviii蛋白，第一多肽包含vwf的fviii结合结构域和结合至唾液酸化的核心2o-聚糖的一个或多个o-糖基化位点。
该组合物的优选实例是fviii蛋白与第一多肽的蛋白复合物，所述fviii蛋白具有与由p00451的氨基酸20至氨基酸2351表示的序列95％相同的氨基酸序列，所述第一多肽作为结合配偶体，其包含与seqidno：1的氨基酸764至氨基酸935至少95％相同的氨基酸序列。
根据第三方面的蛋白复合物的一个实施方案，第一多肽是根据第一方面的多肽。
根据进一步的实施方案，第二多肽可以例如选自fviii、fvii、fix和adamts13。
在第三方面的一个实施方案中，第一多肽至少包含人vwf的片段，并且第二多肽是fviii蛋白，特别是全长fviii蛋白、b结构域缺失的fviii蛋白或其中部分b-结构域已被接头替换的fviii蛋白。根据一个实施方案，第一多肽由seqidno：1的氨基酸764至氨基酸1268定义，其在hek-细胞特别是hek293f-细胞中产生。
根据进一步的实施方案，第一多肽由seqidno：1的氨基酸764至氨基酸1268以及seqidno：1的氨基酸1238至氨基酸1268的一个拷贝定义。此外，第一多肽可以由选自seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4和seqidno：5的氨基酸序列定义。
如实施例中所示，可以用细胞系hek293f产生对siglec，特别是sig-5、sig-7、sig-8和/或sig-9具有改善的结合亲和力的蛋白。因此，根据蛋白复合物的另一个实施方案，通过所推荐的在人细胞系优选hek细胞系中的表达来产生第一多肽和第二多肽。用于产生糖基化多肽的hek细胞系的实例是hek293f、flp-intm-293、293、293ebna、293h、293s、293t、293t/17、293t/17sf、hek293stf和hek-293.2sus。用于产生多肽的优选细胞系是hek293f细胞系。
第一多肽和第二多肽可以通过单独的重组表达产生，然后两者连接在一起。或者，第一多肽和第二多肽在相同细胞中重组表达。为此，第一多肽和第二多肽可以由相同的载体编码或在两个不同的载体上。
多核苷酸
根据第四方面，本发明提供了分离的多核苷酸，其包含编码根据本发明第一方面的糖基化多肽的核酸序列。
分离的多核苷酸可以是dna分子或rna分子。分离的多核苷酸优选是dna分子，特别是cdna分子。用于将编码肽的多核苷酸分离或克隆的技术是本领域已知的，包括从基因组dna中分离，从cdna制备，或其组合。从这种基因组dna克隆多核苷酸例如可以通过例如使用众所周知的聚合酶链反应(pcr)或对表达文库进行抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆dna片段来实现(参见例如innis等人，1990)，pcr：方法和应用指南(aguidetomethodsandapplication)，学术出版社(academicpress)，纽约。可以使用其他核酸扩增方法，例如连接酶链反应(lcr)、连接激活转录(lat)和基于多核苷酸的扩增(nasba)。
分离的多核苷酸可以是编码糖基化多肽的dna分子，所述糖基化多肽具有与选自seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5的序列相似或相同的氨基酸序列。
特别地，分离的多核苷酸可以是对具有与seqidno：2的同一性为至少90％、优选至少95％、更优选至少98％、最优选100％的氨基酸序列的糖基化多肽进行编码的dna分子。此外，分离的多核苷酸可以是对具有与seqidno：3的同一性为至少90％、优选至少95％、更优选至少98％、最优选100％的氨基酸序列的糖基化多肽进行编码的dna分子。根据一个实施方案，分离的多核苷酸是对具有与seqidno：4的同一性为至少90％、优选至少95％、更优选至少98％、最优选100％的氨基酸序列的糖基化多肽进行编码的dna分子。根据一个实施方案，分离的多核苷酸是对具有与seqidno：5的同一性为至少90％、优选至少95％、更优选至少98％、最优选100％的氨基酸序列的糖基化多肽进行编码的dna分子。
表达载体
在第五方面，本发明还涉及包含根据本发明第四方面的多核苷酸的表达载体。
表达载体还优选包含控制元件例如启动子，以及转录和翻译终止信号。根据第四方面的多核苷酸和控制元件的多核苷酸可以连接在一起以产生重组表达载体，该表达载体可以包括一个或多个限制性位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的多核苷酸。可以将多核苷酸插入合适的表达载体中用于表达。在产生表达载体时，编码序列位于表达载体中，使得编码序列与适当的控制序列可操作地连接以用于表达。
重组表达载体可以是可以方便地进行重组dna程序并且可以实现本发明第四方面的多核苷酸的表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。表达载体的选择通常取决于表达载体与该表达载体要被引入的宿主细胞的相容性。表达载体可以是线性质粒或闭合的环状质粒。
优选使表达载体适于在哺乳动物细胞中表达。表达载体可以是自主复制载体，即作为染色体外的实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。对于自主复制，载体可以进一步包含复制起点，该复制起点使得载体能够在所考虑的宿主细胞中自主复制。复制起点可以是在细胞中起作用的、介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”是指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
载体优选是当引入至宿主细胞时被整合到基因组中并与其被整合进的一个或多个染色体一起复制的载体。为了整合到宿主细胞基因组中，表达载体可以依赖于表达载体的任何其他元件，以通过同源或非同源重组整合到基因组中。或者，载体可含有其他多核苷酸用于在染色体的精确位置处通过同源重组整合至宿主细胞基因组中。
本发明的载体优选含有一个或多个(例如几个)选择标志物，其允许容易地选择转化的、转染的、转导的或类似的细胞。选择标志物是一种基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性，对重金属的抗性，原养型(prototrophy)变为营养缺陷型等。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，sambrook等，1989，同上)。
根据一个实施方案，根据第五方面的载体的载体骨架选自pcdna3、pcdna3.1、pcdna4、pcdna5、pcdna6、pcep4、pcep-puro、pcet1019、pcmv、pef1、pef4、pef5、pef6、pexchange、pexpr、pires和pscas。
根据第五方面的载体可以瞬时或非瞬时转化到宿主细胞中。宿主细胞可以是上面列出的任何细胞。优选地，宿主细胞是hek293f。
医疗用途和治疗方法
如上所述，根据本发明的糖基化多肽和组合物特别是蛋白复合物具有降低患者特别是人类患者中的免疫反应的优点。因此，糖基化多肽和蛋白复合物特别地可用作医学治疗的活性成分。
根据第六方面，本发明提供了根据第一方面定义的糖基化多肽，其用于医学治疗。作为替代方案，根据第六方面，本发明提供了根据第三方面定义的组合物，其用于医学治疗。优选地，治疗或预防出血性疾病。
因此，本发明的第六方面还涉及治疗或预防患者出血性疾病的方法，所述方法包括向所述患者施用根据第一方面的糖基化多肽或根据第三方面的组合物，特别是蛋白复合物。
如本文所用的，“出血性疾病”是指损害正常止血的疾病或病症。出血性疾病可以是，例如，血友病a、血友病b、因子viii缺乏症、因子xi缺乏症、血管性血友病(vonwillebranddisease)、格兰兹曼血小板功能不全(glanzmann'sthrombasthenia)、巨大血小板综合征(bernardsouliersyndrome)、特发性血小板减少性紫癜、脑内出血、创伤、创伤性脑损伤等。
如本文所用的，“血友病”是指与增加的血凝块形成时间(与没有血友病的健康个体中的血凝块形成时间相比)相关的一组出血性疾病。“血友病”是指血友病a和血友病b，血友病a是导致产生缺陷型因子viii的疾病，血友病b是导致产生缺陷型因子ix的疾病。
出血性疾病优选为血友病。治疗可以是例如对pups(先前未经治疗的患者)的血友病治疗或免疫耐受诱导(iti)治疗。
根据第三方面的另一个实施方案，本发明提供了根据第二方面定义的蛋白复合物，其用于治疗或预防出血性疾病。
治疗优选包括向患者施用有效量的糖基化多肽或组合物，特别是蛋白复合物。
本文所述的糖基化多肽或组合物，特别是蛋白复合物可以单独施用或以药物组合物的形式施用。根据本发明的药物组合物可包含与至少一种药学上可接受的载体一起配制的有效量的的缀合物。可以通过药学领域熟知的任何方法制备该实施方案的药物组合物并将其施用于受试者。参见，例如goodman&gilman'sthepharmacologicalbasisoftherapeutics(古德曼与吉尔曼的治疗学的药理学基础),hardmanetal.,eds.,mcgraw—hillprofessional(第10版，2001)；remington:thescienceandpracticeofpharmacy(雷明顿：药学的科学与实践),gennaro,ed.,lippincottwilliams&wilkins(第20版，2003)；以及pharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems(药物剂型和药物递送系统),anseletal.(eds),lippincottwilliams&wilkins(第7版，1999)。此外，该实施方案的药物组合物还可以配制成包括其他医学上有用的药物或生物制剂。药物组合物通常包含与药学上可接受的载体组合的治疗有效量的糖基化多肽或蛋白复合物。药学上可接受的载体是本领域已知或确立的任何载体。示例性的药学上可接受的载体包括无菌无热原水和无菌无热原盐水溶液。可用于本发明实施方案的其他形式的药学上可接受的载体包括粘合剂、崩解剂、表面活性剂、吸收促进剂、保湿剂、吸收剂、润滑剂、填充剂、增量剂(extender)、水分赋予剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、增溶剂、控制渗透压的盐、诸如缓冲液的稀释剂以及根据制剂的使用形式而通常使用的赋形剂。它们根据所得制剂的单位剂量可以选择性地选择和使用。
对于体内应用，糖基化多肽、蛋白复合物或药物组合物可以通过任何常规给药途径施用至患者，例如，口服施用、肠胃外施用或吸入施用。肠胃外施用包括静脉内注射、皮下注射、腹膜内注射、肌内注射和腹膜内注射、液体剂、悬浮剂、乳剂和流滴剂。对于肠胃外施用给药，糖基化多肽，蛋白复合物或药物组合物应是例如液体剂或悬浮剂的可注射剂。
在其他实施方案中，将糖基化多肽、蛋白复合物或药物组合物口服施用给患者。在这些实施方案中，药物的形式包括固体制剂，例如片剂、包衣片剂、粉末剂、颗粒剂、胶囊剂和丸剂，液体制剂例如液体剂(例如滴眼剂、滴鼻剂)、悬浮剂、乳剂和糖浆剂，吸入剂例如气雾剂、雾化器和喷雾器，以及脂质体包合剂。在其他一些实施方案中，糖基化多肽、蛋白复合物或药物组合物通过吸入施用给患者的呼吸道以靶向受试者的气管和/或肺。在这些实施方案中，可商购获得。
根据第六方面的一个实施方案，糖基化多肽或组合物特别是蛋白复合物的用途，该用途包括静脉内或非静脉内注射。非静脉内注射优选是皮下注射。
通过以下非限制性实施例进一步描述本发明。
实施例
实施例1-全长血管性血友病因子(vwf)与siglec的结合：
1.1.实验过程
从r&d系统获得作为fc-融合蛋白的重组sig-2、sig-5、sig-7、sig-f(人sig-8的小鼠等同物)、sig-9和sig-10。首先，将蛋白a(servafeinbiochemicagmbh&co)以0.5μg/孔的浓度在4℃下包被在板上，过夜(o/n)。在用洗涤缓冲液(20mmhepes，125mmnacl，1mmedta，1％bsa)封闭并洗涤的步骤后，通过以5μg/ml的浓度在37℃下孵育1小时，fc-融合siglec或对照抗体与蛋白a结合。通过抗体fc部分固定抗vwf-pab抗体(dako，#a0082)作为阳性对照，固定抗鸡igy抗体(sigmaaldrich，#c2288)作为阴性对照。
使用ez-linktmsulfo-nhs-生物素生物素化试剂盒(thermofisherscientific)将血浆源vwf(pdvwf)生物素化。将浓度系列的生物素化的vwf以0μg/ml至0.8μg/ml的浓度施加至孔中。在用洗涤缓冲液进行五次洗涤步骤后，将hrp偶联的链霉亲和素(thermofisherscientific，#31001)加入孔中，并在37℃下孵育1小时，随后进行五次洗涤步骤。
为了使结合的生物素化的pdvwf可视化，将孔用邻苯二胺二盐酸盐底物(sigmafasttmopd，#p9187，sigmaaldrich)孵育。随后测量492nm处的吸光度。
1.2结果
如图1所示，在使用sig-5、sig-7、sig-f和sig-9的结合实验中，492nm处的吸光度随着vwf的起始浓度而增加。值略高于(sig-f和sig-9)或略低于(sig-5和sig-7)阳性对照(抗vwf)。相反，使用sig-2、sig-10和阴性对照抗鸡igy抗体的结合实验中的吸光度约为0，与浓度无关。
因此，vwf以浓度依赖性的方式结合sig-5、sig-7、sig-f和sig-9。另一方面，vwf不与sig-2和sig-10结合。
实施例2-vwf片段与siglec的结合
2.1实验过程
vwf的c-末端片段和n-末端片段通过v8蛋白酶(thermofisherscietific，#201959)消化制备并在monoq5/50gl柱(gehealthcare#17-5166-01)上通过阴离子交换色谱法纯化，所述v8蛋白酶消化在37℃和300rpm下进行3小时，使用在50mmtris-hcl、150mmnaclph7.8的缓冲液中酶：蛋白重量比为1：100。运行缓冲液是20mmtris-hcl，ph7.4；洗脱缓冲液20mmtris-hcl、500mmnaclph7.4。使用100mmnacl作为运行缓冲液，在superose610/300gl柱(gehealthcare#17-5172-01)上通过尺寸排阻色谱法进一步纯化片段和使片段脱盐。
获得的片段(c-末端和n-末端)在图2中示意性示出，其中标识出了结构域和糖基化位点。
使用ez-linktmsulfo-nhs-生物素生物素化试剂盒(thermofisherscientific)将纯化的vwfc-末端片段和vwfn-末端片段生物素化，并如实施例1中所述测量与siglec的结合，vwfc-末端片段和vwfn-末端片段的浓度为1μg/ml。
2.2结果
基于图3中所示的吸光度值，含有大部分o-糖基化位点和2个o-聚糖簇(簇1和簇2)的vwfn-末端片段与sig-5、sig-7、sig-f和sig-9结合。相反，对于vwfc-末端片段，测量到很低的吸光度或测不到吸光度。因此，后者片段不与siglec结合。
实施例3-vwf的n-末端部分与siglec的结合：
3.1.实验过程
使用唾液酸酶a对实施例2中获得的n-末端vwf片段的一部分进行酶促去唾液酸化。对于100μgvwf片段使用2μl酶(唾液酸酶atm#gk80040获自prozyme)，在37℃下在50mm磷酸钠，ph6.0中孵育3小时。
n-末端vwf片段的第二部分被去-n-糖基化。对于20μgvwf片段使用1μl酶(pngasef#p0704获自newenglandbiolabs)，在37℃下在50mm磷酸钠，ph7.5缓冲液中孵育过夜。
测试去唾液酸化的n-末端vwf片段、去-n-糖基化的n-末端vwf片段和未处理的n-末端vwf片段的样品与sig-5、sig-7、sig-8和sig-9的结合。如实施例1中所述进行结合实验，其中n末端vwf片段的浓度为8μg/ml。
3.2结果：
如图4所示，对去-n-糖基化的vwfn-末端片段和未处理的vwfn-末端片段所测定的吸光度值仅略有不同。因此，去-n-糖基化不影响结合，这表明结合是通过o-聚糖介导的。
如图4所示，o-聚糖的去唾液酸化强力地减少或消除了vwfn-末端片段与siglec的结合。因此，vwfn-末端片段的结合由与o-聚糖链连接的唾液酸介导。
实施例4-含有o-聚糖簇1和簇2的肽与siglec的结合
4.1实验过程
如图2中所示意性示出的，vwf含有两个完全被占据的o-糖基化位点簇(参见solecka等，2016)。两个簇在核心2结构的相对量方面存在不同。在簇1中，只有4.9％的糖肽分子含有核心2结构。因此，基于簇1中o-聚糖的总数量，唾液酸化的核心2o-聚糖的百分比是1.25％。
另一方面，在簇2中，34.86％的糖肽分子含有核心2结构(参见solecka等，2016)。因此，基于簇2中o-聚糖的总数量，唾液酸化的核心2o-聚糖的百分比是10.78％。
为了独立地测量两个簇的结合，用胰蛋白酶处理vwfn-末端片段，产生以下片段：包含seqidno：1的vwf的aa1212至1274的簇1片段和包含seqidno：1的vwf的aa1437至1491/1492的簇2片段。片段用反向hplc纯化。简言之，还原pdvwf并根据制造商的说明使用马来酰亚胺-peg2-生物素(ez-linktm马来酰亚胺-peg2-生物素，#21901bid，获自thermofisherscientific)封闭游离半胱氨酸。用胰蛋白酶在37℃下消化过夜后，使用10kda截留离心过滤装置(millipore)浓缩高分子量肽。随后在jupiter5μ
如实施例1中所述进行与siglec的结合实验，其中siglec为sig-5、sig-7、sig-f、sig-9和sig-10，簇1片段和簇2片段的浓度为4μg/ml。
另外，簇1片段和簇2片段的样品通过去唾液酸作用处理，随后在如实施例1中所述的结合实验中测试，其中去唾液酸化的簇1片段和簇2片段的浓度为2μg/ml。
4.2结果：
基于图5中所示的吸光度值，簇2片段与siglecsig-5、sig-7、sig-f、sig-9结合。用sig-10时没有检测到吸光度或检测到很低的吸光度，这证实了来自其他实施例的结果。
因此，o-聚糖簇上高比例的核心2结构是结合sig-5、sig-7、sig-f、sig-9的必要条件。
实施例5-簇2siglec结合的唾液酸依赖性
5.1实验过程
将如实施例4中所述获得的簇2片段的样品去唾液酸化。随后在如实施例1中所述的结合实验中测试去唾液酸化的簇2片段和未处理的簇2片段，其中siglec为sig-5、sig-7、sig-f和sig-9，去唾液酸化的簇1片段和簇2片段的浓度为2μg/ml。
5.2结果
对未处理的簇2片段检测到的吸光度值证实了实施例4中的结果(参见图6)。去唾液酸化的簇2片段不显示结合或仅显示很少的结合。因此，o-聚糖簇上核心2结构的唾液酸化是结合sig-5、sig-7、sig-f、sig-9的必要条件。
实施例6-具有或不具有含fviii结合位点的o-连接聚糖重复的vwf片段的重组表达：
两个重组vwf片段在hek细胞系293f中表达。第一片段seq11包含seqidno：1的aa764至1268，并含有具有o-糖基化位点1248、1255、1256、1243的簇1。
第二片段seq12包含seqidno：1的aa764至1268和aa1238至1268的另外2个重复(aa764-1268+2×1238-1268)，因此包含另外两个拷贝的簇1o-聚糖簇重复。
seq11和seq12在具有c末端strep-tag的hek293细胞系中瞬时表达，并通过strep-tactin亲和层析(ibagmbh)纯化。因此，编码seq11和seq12的基因由geneart(thermofisherscientific)合成，并克隆到含有twin-strep-tag的pdsg-表达载体(ibagmbh)中。用构建体转化top10大肠杆菌(ibagmbh)，并在37℃下在含氨苄青霉素的lb-琼脂平板上孵育过夜后选择单克隆。根据制造商的推荐，使用qiaampdna-mini或maxi试剂盒(qiagen)进行质粒dna制备。通过测序验证所克隆的构建体的正确取向和完整性。对于两种vwf片段的真核表达，使用4.5mg/ml25kda线性聚乙烯亚胺，用1.5mg/l构建体转染在mexi转染培养基(ibagmbh)中生长的mexi-293细胞(ibagmbh)。在37℃、5％co2和100rpm至150rpm下孵育2至4小时后，用mexi转染培养基以1：2稀释培养物并继续培养直至细胞存活率达到75％。随后，通过在4℃和300×g下离心将上清液与细胞分离。为了最小化生物素在细胞培养基中的抑制作用并调节ph，将0.1体积的缓冲液(1mtris-hcl，1.5mmnacl，10mmedta，ph8.0)和0.09％(v/v)biolock溶液(ibagmbh)加入上清液中并在4℃下孵育20分钟。离心后，将上清液施加到strep-tactinxt柱(ibagmbh)上，用洗涤缓冲液(100mmtris-hcl，150mmnacl，1mmedta，ph8.0)洗涤5次，用洗脱缓冲液(100mmtris-hcl，150mmnacl，1mmedta，10mm脱硫生物素，ph8.0)洗脱结合的含strep-tag的蛋白。
片段seq11和seq12在图7中示意性地示出。
实施例7-vwf片段seq11和seq12的o-糖基化分析
7.1实验过程
通过质谱法分析根据实施例6产生的片段seq11和seq12的o-糖基化。
为此，首先通过在60℃下与50mm二硫苏糖醇一起孵育并随后用100mm碘乙酰胺孵育20分钟来将seq11和seq12还原并烷基化。用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶消化后，将所得肽在唾液酸酶a消化缓冲液中再缓冲，并使用实施例3中描述的条件过夜去唾液酸化。使用琼脂糖固定化凝集素(vectorlaboratories)通过jacalin(木菠萝凝集素(artocarpusintegrifolialectin))亲和层析来特异性富集o-糖肽。将jacalin-琼脂糖装入重力驱动柱中，并根据制造商的说明进行层析。使用c4ziptip移液管吸头(millipore)纯化洗脱的o-糖肽用于maldims测量，并使用溶解在50％乙腈/0.1％三氟乙酸中的25mg/ml超级dhb基质以线性正离子模式进行测量。
另外，用o-糖苷酶(内-α-n-乙酰半乳糖胺酶，#p0733，newenglandbiolabs)额外处理等份的经富集的糖肽。简而言之，在37℃下用该酶孵育肽2小时，10μl糖蛋白使用1μl酶。由于o-糖苷酶仅对核心1o-聚糖(galβ1→3galnacα1→ser/thr二糖)具有特异性，因此其留下与肽骨架连接的核心2聚糖和/或延伸核心1o聚糖。
7.2结果
结果总结在图8和图9中。
通过源后衰变(psd)maldi鉴定o-糖肽。鉴定的seq11片段的肽序列是kvtlnpsdpehcqichcdvvnltceacqepgglvvpptdapvspttlyvedisepplhgsaw(seqidno:6)。最后四个氨基酸(加下划线的)对应于c末端strep-tag。该肽含有四个o-糖基化位点。
图8的上部光谱显示了完全o-糖基化的糖肽，图8的下部光谱显示了o-糖苷酶消化后的同一糖肽。o-糖苷酶消化后的1460.3da质量位移(用箭头标记)对应于四个核心1o-聚糖，每个质量为365da。在上部光谱中观察到的365da质量距离对应于同一肽的不同糖型，而每个另外的365da质量加合物对应于形成核心2结构的galβ1→4glcnac二糖。在o-糖苷酶处理后，观察到完全去糖基化形式的肽(8358.6da)以及含有核心2结构(galβ1→4glcnacβ1→6(galβ1→3)galnac，730da)和/或延伸核心1结构(galβ1→4glcnacβ1→3galβ1→3galnac，730da)的糖型。
鉴定的seq12片段的肽序列是kvtlnpsdpehcqichcdvvnltceacqepgglvvpptdapvspttlyvedisepplhqepgglvvpptdapvspttlyvedisepplhqepgglvvpptdapvspttlyvedisepplhgsaw(seqidno:7)。最后四个氨基酸(加下划线的)对应于c末端strep-tag。
图9的上部光谱显示了完全o-糖基化的糖肽，图9的下部光谱显示了o-糖苷酶消化后的同一糖肽。o-糖苷酶消化后的4380.3da质量位移对应于12个核心1o-聚糖，每个质量为365da，这证实了seq12中的12个o-糖基化位点全部都被o-聚糖占据。与对seq11所观察到的类似，在光谱中观察到的365da的距离和730da的距离分别对应于galβ1→4glcnac二糖或者核心2和/或延伸核心1结构。
核心1和核心2型o-聚糖的定量基于具有连接的相应o-聚糖的糖肽的相对量。通过评估maldi谱中的信号强度来完成给定肽的不同糖型的定量。
对于糖肽seq11，基于同一肽的不同糖型的maldi信号强度完成定量。该肽的所有糖型(8358da、8724da、9089da、9454da、9819da、10181da、10543da、10910da、11277da)的总峰强度等于41275a.u.，其代表100％。
质量为8358da、仅含有核心1聚糖的糖型显示出8410a.u的强度，这相当于总量的20％。因此，所有其他糖型(80％)含有连接的至少一个核心2和/或延伸核心1聚糖型聚糖。在该测量中，核心2和延伸核心1是不可区分的。因此，基于o-聚糖的总数量，核心2和/或延伸核心1o-聚糖的百分比为至少20％。
因此，在hek细胞系中重组产生的seq11中的四个o-糖基化位点和seq12中的全部十二个o-糖基化位点被核心1o-聚糖占据，并且还被核心2o-聚糖和/或延伸核心1o-聚糖以高百分比地占据。考虑到大量的核心2o-聚糖，两个序列都可以是siglec结合的良好配体。添加两个额外的、包含四个o-糖基化位点的序列重复，成功地得到了具有十二个成簇的且完全被占据的o-聚糖的蛋白。
实施例8-分析seq11和seq12与siglec的结合
8.1实验过程
在除检测策略不同外的如实施例1所述的siglec结合elisa中测试携带strep-tag的重组蛋白seq11和seq12；使用strep-tactin-hrp(#2-1502-001，ibagmbh)缀合物代替链霉亲和素-hrp用于检测strep-标记的蛋白质。应用的strep-tactin-hrp的浓度为0.25μg/ml。两种蛋白，seq11和seq12均以42nm的等摩尔浓度进行测试。
8.2结果
如图10所示，多肽seq11和seq12均显示出与sig-5、sig-7、sig-f和sig-9的结合。针对多肽seq11和seq12与所有四种siglec结合所测量的吸光度与针对seq11和seq12与抗-vwf抗体的结合所测量的吸光度在相同的范围内。
相反，在使用sig-2和sig10的实验中，seq11和seq12的吸光度与使用抗鸡抗体的阴性对照实验处在相同范围内。因此，seq11和seq12均不与sig-2或sig-10结合(参见图10)。
实施例9-seq11和seq12与siglec结合的唾液酸依赖性
9.1实验过程
在添加对于strep-标记的多肽seq11和seq12的唾液酸酶a消化的情况下，重复根据实施例8的实验方案。如实施例3中所述进行去唾液酸化。
9.2结果
使用去唾液酸化的seq11和seq12的结合实验的结果显示在图11中。根据测量的吸光度，与未处理的多肽相比，去唾液酸化的seq11和seq12与sig-5的结合显著降低。对sig-7、sig-f和sig-9的结合被完全消除，即吸光度与所测定的对sig-2和sig10的结合处在同一水平。因此，两种多肽seq11和seq12与sig-5、sig-7、sig-f和sig-9的结合是唾液酸依赖性的。
实施例10-seq11和seq12与siglec结合的比较
10.1实验过程
为了测量和比较seq11和seq12的表观结合亲和力，应用siglecelisa以及对结合曲线的scatchard分析。如实施例8和实施例9中所述进行elisa。使用graphpadprism软件进行scachard分析。
10.2结果
序列11和序列12的结合曲线以及相应的scachard图如图12和图13所示。来自schachard图的表观结合亲和力(kd)总结在图14中。seq12中o-聚糖重复的增加对siglec结合亲和力有显著影响。对siglec5的亲和力，从seq11的0.494μm增加到seq12的0.14μm。对于siglec7的亲和力，从seq11的0.371μm增加到seq12的0.005μm。对于siglec8的亲和力，从seq11的1.027μm增加到seq12的0.015μm。最后，对于siglec9的亲和力，从seq11的0.591μm增加到seq12的0.041μm。在文中声明：“根据该elisa实验，将计算所有seq11-siglec和seq12-siglec相互作用的解离亲和常数”。
实施例11-测定seq11和seq12的fviii结合亲和力
11.1实验过程
通过表面等离子共振(spr)评估两种序列的fviii结合。使用biacore3000(gehealthcare)仪器进行分析。使用胺偶联试剂盒(gehealthcare)将多肽序列11和序列12固定在cm5芯片上。作为阳性对照，固定全长血浆vwf(wilate，octapharma)。随后，将fviii(nuwiq，octapharma)浓度系列(0.2nm、0.6nm、1.7nm、5.0nm、15nm、45nm)注射到传感器芯片表面上。运行缓冲液是150mmhepes，150mmnacl，5mmcacl2，0.05％。
11.2结果
spr测量显示，两个序列的fviii结合亲和力(kd)等于1.4nm，因此额外的o-聚糖重复对与fviii的结合亲和力没有影响。
实施例12-n末端vwf片段而不是c末端vwf片段降低il-12p70和ifn-γ的细胞外水平
12.1背景
siglec在免疫系统的各种细胞上表达，包括单核细胞和树突细胞，并且在细胞粘附、内吞作用以及调节适应性和先天性免疫的信号转导通路中起作用(macauley等人，2014)。大多数siglec在其细胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)或itim样基序，其已经被证明通过抑制细胞增殖和活化(vitale等，1999；ikehara等，2004)、诱导细胞凋亡(nutku等人，2003)和抑制细胞因子产生(erdmann等人2009；chen等人2013)而起到减弱炎症反应的作用。
为了观察在结合siglec的vwf片段的存在下由modc产生的炎性细胞因子的水平是否发生改变，通过流式细胞术同时分析经刺激的、未成熟的、单核细胞来源的树突细胞(modc)的上清液中il-12p70和ifn-γ的量。
12.2实验设计
通过ficoll梯度富集来自健康供体的单核细胞，随后通过磁性细胞分选来纯化cd14+单核细胞。为了获得modc，在补充有10％胎牛血清、1000u/ml白细胞介素4和1000u/ml粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的rpmi培养基中培养cd14+单核细胞5至6天。根据制造商的推荐，通过检测il-12p70和ifn-γ的细胞微珠阵列cbaflex(bd)，在用相应的vwf片段刺激后24小时，分析由modc分泌的细胞因子谱。用相同体积的100mmnacl处理的细胞作为对照。用流式细胞仪facsverse分析样品。使用fcap阵列软件(bd)进行细胞因子浓度的最终分析和计算。
12.3结果
图16显示了在具有和不具有lps刺激的情况下，用两种vwf片段孵育modc后的细胞因子浓度。根据这些结果，vwf的n-末端部分而不是c-末端部分降低了响应于lps刺激而合成的促炎细胞因子的产生。在没有lps刺激的情况下，没有检测到vwf片段对促炎细胞因子的分泌的影响。
实施例13-siglec及其衔接分子的磷酸化分析
13.1背景
在含唾液酸的配体结合后，siglec的itim基序和itim样基序被src家族酪氨酸激酶磷酸化，导致含有src同源2(sh2)结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶(shp)-1和shp-2的募集。一旦被激活，这些磷酸酶可以使细胞底物去磷酸化，从而控制各种信号转导通路的激活(crocker等，2007)。尽管shp-1在抑制性信号转导中起作用，但shp-2在大多数信号转导通路中增强信号转导，而且还报导其参与负向调节细胞内信号转导过程(an等，2006；avril等，2004；boyd等，2009；qu，2000；salmond和alexander，2006)。
13.2实验过程
如实施例12中所述制备modc。为了确定n-末端vwf-片段对siglec及其衔接分子shp-1和shp-2的酪氨酸磷酸化的影响，将6×106个modc与500nm的n-末端vwf片段孵育10分钟。用相同体积的100mmnacl刺激的细胞作为对照。根据制造商的推荐，使用proteomeprofiler人磷酸化免疫受体阵列试剂盒(r&dsystems)使用500μg细胞裂解物进行免疫受体-磷酸化分析。
13.3结果
磷酸化免疫受体阵列(phospho-immunoreceptorarray)的结果显示在图17中。根据测量的像素密度，与对照相比，n末端vwf片段特异性地改变shp-1、shp-2、sig-5和sig-7的磷酸化。没有观察到sig-2和sig-10的磷酸化，这与缺乏vwfn-末端片段与这些siglec的结合非常相关。
拥有上文的描述以及相关附图中所呈现出的教导的益处，本发明所属领域的技术人员将会想到本文所阐述的本发明的许多修改和其他实施方案。因此，应该理解，本发明不限于所公开的特定实施方案，并且修改和其他实施方案旨在包括在所附权利要求的范围内。尽管本文采用了特定的术语，但它们仅仅以一般性和描述性的意义使用，目的不是用于进行限制。
参考文献
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