大鼠臂丛神经损伤保留残根模型的构建及残根的功能评估方法与流程

本发明涉及一种模拟临床受伤机制的大鼠臂丛神经根性损伤后保留残根模型的构建及残根的功能评估方法。

背景技术：

臂丛神经损伤是一种致残性的疾病，流行病学研究发现其发病率逐年增多，约占创伤总数的1.2％，锁骨上臂丛神经损伤占62％，多需手术修复，尤其是全臂丛神经损伤，是上肢最严重的伤残之一，预后差，对患者本人及其家属乃至全社会的心理、经济等方面都带来了巨大的打击和损失。目前对臂丛神经损伤的治疗主要采取神经移植、神经转位以及游离功能性肌肉移植等方法。虽然能使上肢瘫痪的患者恢复一定的抬肩、屈肘功能，但前臂及腕、手功能恢复较差。极有限的供体神经及其神经纤维数目与庞大的所需修复神经及其神经纤维数目之间存在的“供需”矛盾是制约臂丛神经损伤治疗效果的主要因素之一。尽管健侧c7、膈神经、肋间神经移位等术式的发明使臂丛神经根性损伤的治疗取得了巨大的进步，但是当合并有膈神经和肋间神经等损伤时，神经供体来源仍是一大问题。并且，神经移位后大脑支配中枢转化不良等仍然是制约疗效的重要因素。因此，寻找更多、更可靠的动力源神经且不影响供区功能成为提高臂丛神经损伤疗效的重要途径之一。

研究表明在臂丛神经根性损伤中并非所有神经根均表现为椎管内撕脱，c5、c6神经根在椎间孔处的固定韧带较坚固，当创伤暴力作用于臂丛神经根部时，c5、c6神经根在椎间孔处常表现为断裂，并遗留有残根，是供体神经的良好选择之一。然而，有临床研究发现部分臂丛神经损伤患者接受c5、c6残根移植修复术后功能恢复不满意，仍需二次重建手术。除了常见的制约神经再生的原因外，还可能有以下原因：c5、c6神经根除椎管外发生断裂外，椎管内可能同时合并完全或不全性损伤；由于臂丛神经根性损伤患者一般观察3个月后行手术治疗，脊髓与周围神经连续性的长期中断必然导致相应节段脊髓内神经元的凋亡以及局部神经回路的破坏，近端神经根长期与靶组织分离，缺乏靶组织营养，从而降低了神经元轴突再生的能力。因此必须对c5、c6神经残根损伤的严重程度及其对应的脊髓前角运动神经元的功能状态进行全面、准确的评估。然而，在临床中很难直接对患者进行直接评估。而动物实验可以很好控制影响神经再生和肢体功能恢复的一些因素。另外，研究表明大鼠的臂丛走形与人的非常类似，故本发明选择大鼠作为研究的动物模型。

目前常见的臂丛神经损伤模型大多为臂丛神经根性撕脱，为节前损伤并不遗留残根，故现阶段并无合适的模型对残根的功能状态进行评估。

技术实现要素：

本发明的目的在于模拟临床受伤机制，构建大鼠臂丛神经损伤保留残根模型，并通过残根和脊髓运动元组织学对此模型有效性进行评估。

本发明提供一种大鼠臂丛神经损伤保留残根模型的构建及残根的功能评估方法，包括：

大鼠神经残根模型的制作，包括：采用背侧入路，做一个偏右侧的弧形切口，依次切开皮肤和浅层、深层的肌肉，采用小拉钩将右肩胛骨牵开到一侧，从而暴露整个右侧臂丛神经，在显微镜下继续往近端神经根分，直到将5个神经根完全暴露出来；以及模拟临床受伤机制，采用显微止血钳将近端的神经根一一与周围肌肉组织固定，远端采用止血钳对神经根进行牵拉，牵拉后有神经根残根形成；

大体解剖观察；

神经残根取材和组织学评估，包括：检测残根的神经丝蛋白(neurofilament，nf-200)和髓鞘标志蛋白s-100蛋白的表达量、神经轴突的直径、轴突数量和髓鞘厚度；以及

脊髓取材及组织学评估。

优选地，所述止血钳通过一根细胶管与砝码连接，所述细胶管通过滑轮传导砝码产生强大的瞬间暴力，所述砝码的重量为1.5kg。

优选地，所述大体解剖观察步骤包括：对大鼠进行灌注；采用背侧入路打开椎板暴露臂从神经残根，所述残根的诊断标准为保持结构完整且与脊髓相连接；以及进行残根长度的测量。

优选地，所述残根取材及组织学评估包括：灌注大鼠取神经残根，一部分残根进行nf200和s100组化染色，主要检测残根的轴突和施旺细胞的情况；另一部分残根进行甲苯胺蓝和电镜检测，主要检测神经轴突的直径，轴突数量和髓鞘厚度。

优选地，所述灌注使用的是4％多聚甲醛固定液。

优选地，所述取神经残根的方法为：切开大鼠背部皮肤，分离肌肉，打开椎板，显露脊髓，分别切取c5-7及c8，t1神经残根，选取最短的残根。所述最短的神经残根为c5神经残根。

本发明的有益效果为：

本研究发明了一种新的大鼠臂丛神经损伤保留残根的动物模型，填补了臂丛神经损伤中残根动物模型的空白，前期结果表明该模型的有效性，为临床臂丛神经损伤后残根的应用修复提供了新的动物模型。

本动物实验模型可以很好地控制影响神经再生和功能恢复的因素，并对这些影响因素分别进行研究。另外，通过该动物模型，可以使用客观的方法评价神经残根及其对应脊髓运动神经元的功能状态，并可以在此基础上进行神经残根的保护，为临床中神经残根的应用和提高神经残根修复效果提供可靠的实验理论依据，这在临床研究中是很难做到的。

附图说明

图1a-1h显示了实验大鼠神经残根模型的建立步骤和臂丛神经根牵拉伤后的病理特点；其中，图1a显示了做一个正中偏右侧的弧形切口，1b显示了切开颈部浅层和深层肌肉，1c显示了暴露全臂丛，1d显微镜高倍镜下显示全臂丛，1e采用装置进行牵拉造模，1f显微镜高倍镜下显示造模过程，1g显示牵拉后可见有残根形成，1h打开椎板暴露脊髓和神经残根；

图2a-2e显示了神经残根组织化学评估情况，验证残根的功能状态；2a、2b、2c分别为he、nf200和s100的免疫组化图；2d、2e分别为nf200和s100组化统计图；

图3a-3e显示了神经残根轴突直径、轴突数和髓鞘评估情况，同时也验证残根的功能状态；3a、3b分别为甲苯胺蓝染色和电镜图；3c、3d、3e分别为轴突直径、单位面积轴突数和髓鞘厚度的统计图；

图4a-4d显示了脊髓尼式体染色情况，验证相对应的脊髓前角运动神经元的存活情况；4a、4b、4c分别为脊髓横切面尼氏体染色图；4d为各个时间点脊髓运动神经元存活数

图5a-5f显示了脊髓凋亡因子bcl-2,bax及cleavedcaspase-3组化染色情况，验证脊髓运动神经元的死亡过程是否与凋亡相关；5a、5b、5c分别为脊髓横切面bcl-2,bax及c-caspase3免疫组化染色图；5d、5e、5f分别为bcl-2,bax及c-caspase3免疫组化阳性细胞统计。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。所述附图和实施例仅作为示例，而非限制本发明。

在本发明的实施例中，大鼠臂丛神经损伤保留残根模型的构建，对残根及其对应脊髓运动神经元进行功能评估具体包括以下步骤：

步骤一：构造模型；

步骤二：造模完成后对实验大鼠进行大体评估；

步骤三：神经残根取材及组织学评估；以及

步骤四：脊髓取材及组织学评估。

具体地，步骤一的目的是：模拟临床上臂丛神经损伤机制，进行动物造模。在本发明的实施例中，步骤一包括：

采用背侧入路，做一个偏右侧的弧形切口，如图1a所示。依次切开皮肤和浅层、深层的肌肉(图1b)，采用自制的小拉勾将右肩胛骨牵开到一侧，从而暴露整个右侧臂丛神经(图1c箭头所示)，在10倍显微镜下继续往近端神经根分，直到将5个神经根完全暴露出来(图1d)。

实验分为两组：假手术组和牵拉组。假手术组只暴露神经根而不损伤神经根。牵拉组采用显微止血钳将近端的神经根一一与周围肌肉组织固定(图1f)，一方面是模拟c5、c6神经根出椎间孔的韧带连接；另一方面是为了防止神经根直接从脊髓连接处撕脱，因为牵拉暴力可能会直接造成节前损伤。

模拟临床受伤机制，远端采用止血钳对神经根进行牵拉，牵拉后有神经根残根形成(图1g，图1h)。止血钳通过一根细胶管与砝码连接，砝码的重量为1.5kg。细胶管通过滑轮传导砝码产生的强大的瞬间暴力。

具体地，步骤二的目的是：验证装置造模后实验动物神经残根的大体情况，以此验证动物模型的有效性。

在本发明的实施例中，步骤二包括：

对实验中的所有实验大鼠在损伤后立即行臂丛的解剖观察，并在显微镜下进行拍照；术后第1天，分别从假手术组和牵拉组随机挑选5只大鼠进行灌注；同样采用背侧入路打开椎板暴露臂从神经残根，残根的诊断标准为保持结构完整且与脊髓相连接；同时用标尺进行残根长度的测量。

具体地，步骤三的目的是：验证动物臂丛神经损伤后残根的功能状态，进一步验证模型有效性。

在本发明的实施例中，步骤三包括：

按不同时间点(1、3、7、14、28d)每组随机选取实验大鼠5只，4％多聚甲醛固定液灌注，切开实验大鼠背部皮肤，分离肌肉，打开椎板，显露脊髓，分别切取c5-7及c8，t1神经残根。有研究表明神经残根的功能状态与长度相关，长度越长，残留的施旺细胞越多，可以释放更多的细胞因子，从而对神经元进行保护。故选取最短的神经残根，经测量为c5神经根，故选取c5神经根进行进一步行he(hematoxylin-eosin，苏木精-伊红染色法)、nf200和s100组化染色，分析其阳性表达量并进行统计分析。

具体地，步骤四的目的是：验证动物臂丛神经损伤后残根相应脊髓神经元的功能状态，进一步验证模型有效性。

在本发明的实施例中，步骤四包括：

在第三步基础上进一步取c5神经根相对应的c5脊髓节段，进行脊髓nissl染色和bcl-2，bax及cleaved-caspase3免疫组化染色。尼氏体染色是为了计算损伤侧阳性的运动神经元与正常侧阳性运动神经元数目的比值，凋亡相关组化染色是为了计算损伤侧阳性细胞数与正常侧运动神经元存活细胞数目的比值。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。