本发明具体涉及一种治疗瘢痕疙瘩的微针贴片及试剂盒与应用。
背景技术：
瘢痕疙瘩是一种皮肤对创伤的过度反应，主要表现为局部成纤维细胞的过度增生和胶原蛋白的大量合成。瘢痕疙瘩的纤维组织通常超出创伤的范围，累及周围正常组织。在手术切除后，瘢痕疙瘩常常会复发。临床上，它们被诊断为红色结节，引起瘙痒和疼痛，限制活动，并造成容貌上的变化。瘢痕疙瘩通常出现在皮脂分泌腺或皮肤张力增加的区域，包括肩部、上背部和手臂、胸部、耳朵、脸颊和颈部。它们虽然没有危机病人生命，但是其会导致相当大的生理(瘙痒、疼痛，活动受限等)和心理的不良影响。瘢痕疙瘩在20-30岁的年轻人群中比较常见。有色人种相对而言有较高的发病率：在黑色人种和加勒比血统中，多达16％的人口可能会受到影响；1％亚洲人群受其影响。
目前，瘢痕疙瘩形成的机理还不大清楚，所以还没有特别有效的治疗方案。到目前为止，所采用的方式包括固醇激素注射、免疫调节、化学药物治疗、手术切除、冷冻治疗、激光治疗、封闭性敷裹、放射疗法。
在所有的选项中，类固醇注射是相对比较有效的，是目前的一线治疗方案。术后，50-100％瘢痕疙瘩会缩小，但复发率很高(接近50％)。另外，它最大的问题是在类固醇注射过程中，痛苦感很强，这导致患者常常放弃治疗。此外，注射通常每月重复一次，需要患者来到医院就诊。手术切除见效快，但是复发率从45到100％不等。当然手术后通过辅助治疗，如皮质类固醇注射，可用于减少瘢痕疙瘩复发，但其疗效也很低。有报道发现冷冻疗法会有一定疗效，但其有效性很低，结果并不一致。另外在很多地方，不一定有冷冻疗法需要的设施例如液氮。硅和非硅基封闭敷料已被广泛用于瘢痕疙瘩，这种无创的治疗方式在儿科患者和耐痛能力较差的成人中保守欢迎。然而，其治疗效果一般，在临床上反应较差。另外放射治疗也是选择之一，但目前对它的争议很大，而且它价格昂贵，需要复杂且安全性要求较高的放射源设备。激光治疗也开始受到人们到重视，但目前还在临床测试阶段。
总之，有效的、安全的、方便的和经济的治疗瘢痕疙瘩的临床需要尚未得到满足。目前所有的治疗方法都是由医疗专业人员处理，这需要病人多次到诊所就诊，导致医疗费用和花费时间的增加。目前的标准治疗以皮质类固醇注射为主，但需要在专门的诊所定期治疗，其他方案都表现出了一些效果，但都有它们的局限性。
微针(microneedle)是一种具有微米尺寸针尖的经皮给药装置，它常常被用于透皮递送药物和疫苗。当然，它们可以用于皮肤病学中的生物活性剂的经皮给药。研究证明，微针可以用来传递5-氟尿嘧啶(5fu)药物，从而来治疗瘢痕疙瘩。
公开号为cn104661695a的发明专利公开了一种用于皮肤改善的递送装置和方法，并具体公开了涂药器包括用于施用包含在改善皮肤上有效的生物相容性陶瓷材料的组合物的微针阵列。该专利能够取得一定效果，但是尤其其采用了组合物，因此，在使用中难免会产生副作用的影响。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种不依赖于药物和其他生物活性物质的治疗瘢痕疙瘩的微针贴片，使用安全。
本发明同时还要提供上述的治疗瘢痕疙瘩的微针贴片在制备治疗瘢痕疙瘩的试剂盒中的应用。
本发明还要提供一种治疗瘢痕疙瘩的试剂盒，用于治疗瘢痕疙瘩，无药物，副作用小。
为解决以上技术问题，本发明采取的一种技术方案是：
一种治疗瘢痕疙瘩的微针贴片，不含有药物，包括基底、设置在基底上的微针阵列，微针阵列包括多个微针(1-10000个)，每个微针之间的间距不小于200微米，微针长度在300-1000微米之间，微针材料采用不在皮肤中溶胀并软化且不引起皮肤瘙痒和过敏的非金属。
优选地，微针材料采用聚合物，聚合物包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸、聚己内酯、液晶聚合物、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙二醇二丙烯酸酯中的一种或几种。
优选地，微针的形状可以是圆锥形、金字塔形或三棱锥椎体。
优选地，微针形状为圆锥形时，其底部的直径为200-500微米；微针形状为金字塔形时，其底部边长为200-500微米；微针形状为三棱锥椎体时，其边长为200-500微米。
优选地，基底选自硅胶或聚二甲基矽氧烷，基底的设有微针阵列的一面上设置延伸的胶体层，胶体层上设置离形膜层。
提供上述的治疗瘢痕疙瘩的微针贴片在制备治疗瘢痕疙瘩的试剂盒中的应用。
优选地，试剂盒中不包含治疗瘢痕疙瘩的有效药物成分。
本发明采取的又一技术方案是：
一种治疗瘢痕疙瘩的试剂盒，包括上述的治疗瘢痕疙瘩的微针贴片。
优选地，该试剂盒不包含治疗瘢痕疙瘩的有效药物成分。
优选地，该试剂盒还包括棉签，碘伏或75％医用酒精。
由于以上技术方案的采用，本发明与现有技术相比具有如下优点：
1、无痛或微痛：由于微针仅插入到真皮表层，没有接触神经元细胞，所以疼痛感会比较小。
2、无药物，治疗安全：由于微针是通过物理接触来治疗瘢痕疙瘩，其中没有药物，这种方式没有药物副作用的问题。例如，5fu对于某些病人是不适用的，例如怀孕的女性。同样，这种方式也没有辐射和激光的危害。
3、监管和审批快：药物与基于医疗器械的监管路线是不一样的，路线的差异导致了产品开发的成本和时间上的显着差异。与药物治疗方式相比，类似于微针的体表医疗器械通常不需要多级安全分析和渐进式临床试验。因此，开发成本将比含药物微针的开发成本低很多倍，且审批快。
4、医疗成本低：与注射、手术切除、辐射、激光的瘢痕疙瘩治疗不同，微针贴片病人可以自行应用，这大大减少了对公共医疗系统的负担，并因此降低了医疗成本。
附图说明
图1为本发明实施例2中的微针结构示意图；
图2为本发明细胞实验中的微针贴片示意图；
图3为本发明动物和临床试验中的微针贴片示意图；
图4为本发明实施例2与实施例3中微针的物理表征图：a是实施例2微针贴片的显微镜图像；b是图4a放大后的显微镜图像；c是实施例2微针的扫描电子显微镜图像；d是实施例3微针贴片的显微镜图像；e是图4d放大后的显微镜图像；f是实施例3微针的扫描电子显微镜图像；g是实施例2与实施例3微针的压力-位移曲线图；
图5为无药微针对从疤痕疙瘩中提取的成纤维细胞(kf)增殖的抑制图；a是10天内，kf细胞在由无药微针、0.1mg/ml5fu、1mg/ml5fu过程中增殖的情况图；b是5fu和微针处理后kf细胞形貌的变化图；c是微针处理4小时和24小时后，hoechst33342和pi对kf细胞的染色图；
图6为微针对kf细胞增殖抑制的机理研究图；a是(i)未处理、(ii)用lcp微针朝下(mndown)和(iii)mn朝上(mnup)处理24小时后的kf细胞形态图，其中，细胞由hoechst33342和pi染色来标记所有细胞和死细胞，虚线所画的区域是mn接触细胞的区域；b是图a中单位面积的死亡细胞的统计图(n＝3，值为平均值±sd，**：p<0.01)；
图7为兔耳增生性瘢痕模型的建立和微针在兔耳增生性瘢痕模型中对组织增生的影响图；a是兔耳增生性瘢痕模型的建立图；b是对伤口进行各种处理(阴性对照、pegda、lcp微针处理，微针在兔耳增生性瘢痕模型中对组织增生的影响图；c和d是阴性对照图；e和f是lcp微针治疗的伤口图；g和h是pegda微针治疗的伤口图；
图8为利用瘢痕升高指数(sei)来量化微针抑制了肥大性瘢痕的功效图；a是未处理的代表性组织切片图；b是微针处理的伤口的代表性组织切片图；c是未经处理和微针治疗的兔耳伤口的sei图，*p<0.01，n＝3。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述。
本发明治疗瘢痕疙瘩的微针贴片，不含有药物，包括基底、设置在基底上的微针阵列，微针阵列包括多个微针，每个微针之间的间距不小于200微米，微针长度在300-1000微米之间，微针材料采用不在皮肤中溶胀并软化且不引起皮肤瘙痒和过敏的非金属。此处基底设置为扁平状，可以为圆形、长方形等其他形状。
在实施例中，微针材料采用聚合物，聚合物包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolicacid)，plga)、聚乳酸(poly(lacticacid)，pla)、聚己内酯(polycaprolactone，pcl)、液晶聚合物(liquidcrystalpolymer，lcp)、聚甲基丙烯酸甲酯(poly(methylmethacrylate)，pmma)、聚乙二醇二丙烯酸酯(poly(ethyleneglycol)-diacrylate，pegda)中的一种或几种。
在实施例中，微针的形状是圆锥形、金字塔形或三棱锥椎体。
在实施例中，基底选自硅胶或聚二甲基矽氧烷，为了更好的使微针贴片固定在皮肤表面，基底的设有微针阵列的一面上设置延伸的胶体层，胶体层上设置离形膜层。此处微针贴片也可以直接用绷带或贴膜(如3mtegadermtm)等固定。
在实施例1中，微针的形状是圆锥形，圆锥形底部的直径为200-500微米，微针材料采用plga。
在实施例2中，如附图1所示，微针贴片尺寸为8.5mm×8.5mm，由10×10阵列组成，针密度为每厘米内均匀分布着13个微针，微针的形状是金字塔形，金字塔形底部边长为200-500微米，优选为200微米，微针材料采用lcp。本实施例的微针用于以下细胞、动物和临床试验。如附图2所示，在细胞试验中，微针面朝下置于细胞上，在重力作用下，微针针尖接触到细胞，并产生物理伤害。如附图3所示，在动物和临床试验中，微针面直接放置在瘢痕疙瘩上，并在表面覆盖上3mtegadermtm来固定。
在实施例3中，微针的形状是金字塔形，金字塔形底部边长为200-500微米，优选为200微米，微针材料采用pegda，其余结构与实施例2相同。
在实施例4中，微针的形状是三棱锥椎体，三棱锥椎体边长为200-500微米，微针材料选用pcl。
分别对实施例2和实施例3中微针的物理性质进行研究，结果如附图4所示：其微针整列可以从显微镜成像中观察到(图4a，4d)。扫描电子显微镜(sem)检查表明，针尖的尺寸小于10μm，针底部200μm×200μm(图4c，4f)。通过压缩测试，获得了lcp和pegda微针的机械性能(图4g)，在所得到的压力-位移图上，其线性部分与材料的杨氏模量值成正比例，这个结果告诉我们，与pegda微针相比，lcp微针的硬度要强30％左右。
在细胞层面对实施例2中的微针进行试验。
此试验的成纤维细胞从瘢痕疙瘩中提取出来，它被定义为kf。我们将kf接种在24孔板中，每个孔中的细胞为1万个。接着，我们比较了被微针、5fu处理后的细胞的增殖，结果如附图5所示。在10天的时间里，没有接受任何处理的细胞增殖了5倍左右；5fu抑制了kf增殖，细胞数量在10天的时间里没有发生变化；和5fu类似，无药微针也抑制了细胞增殖(图5a)，在10天的时间里，细胞的总数仅仅增加了2倍。5fu是通过干扰dna合成过程的机理来抑制细胞增殖的，而微针却是通过物理接触的效果来进行治疗的。
为了进一步研究微针对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的抑制效果，我们细致观察了kf细胞在5fu和微针处理下的形貌变化。5fu的处理没有对kf细胞纺锤体形态导致任何变化，但微针处理的细胞改变了其形态，24小时后，大部分的细胞表现成圆形(图5b)。我们接着在施加微针的第4和24小时，用2种荧光染料标记-hoechst33342和碘化丙啶(pi)来标记细胞，hoechst会染色所有的细胞，而pi仅仅标记死细胞。我们发现，在4小时的时候，微针接触的区域，并没有死细胞(图5c)，但到了24小时，微针区域的死细胞的数量显著增加。
为了进一步确定微针是细胞死亡的主要因素，我们将微针贴片通过两种方式和细胞进行接触(图6a)，微针向上的组称为“mnup”，其中的kf细胞和基底直接接触；微针向下的组称为“mndown”，其中的kf细胞和微针直接物理接触。而后，我们观察细胞的增殖。如果这两种放置方式都抑制了细胞的增殖，那么其原理就是微针材料的化学毒性；如果只有微针向下的方式抑制了细胞增殖，那么机理就是物理接触。
24小时后，在mnup组中，细胞死亡程度相对较小；相反，在mndown组里，死亡的细胞(pi阳性)数量是mnup组的6倍(图6b)。尤其需要注意的是，死亡的细胞主要集中在微针接触区域。mnup和mndown两组中的死亡细胞数量之间的差异表明，我们观察到的抑制现象是由kf细胞和微针的物理接触而产生的，并不是由于微针材料的毒性而引起的。
在动物层面对实施例2中的微针进行试验
我们利用兔耳增生性瘢痕模型来探讨，以上观察到的现象是否可以影响瘢痕增生指数(hi)。兔耳增生性瘢痕模型的建立步骤包括：1)在兔耳上产生伤口，每耳不超过4个伤口；2)使用7mm活检穿孔器完全去除表皮、真皮和软骨膜(图7a)；3)对于伤口随机性选择处理方式(未处理、lcp微针处理或pegda微针处理(图7b))；4)使用3m的tegadermtm覆盖伤口；5)10天后，收集创伤部位伤，通过多聚甲醛来固定，切边染色，成像。
试验结果显示：在对照(未处理的)伤口中，我们发现真皮增厚的方式类似于损伤部位的肥大性瘢痕(图7c，7d)，凸起组织从外观上与人体肥大性瘢痕相似，lcp(图7e，7f)和pegda(图7g，7h)微针治疗部位的愈合伤口被抑制(真皮组织生成减少)，真皮层厚度减小。
我们利用瘢痕升高指数(sei)来量化兔耳上组织增生的程度(图8)，sei是新形成的组织或肥厚性新皮层和原始真皮的区域面积的比例。图8a为未经处理的伤口，图8b是lcp微针治疗的伤口切片。如图8c所示，如果没有任何处理，类似于肥厚性瘢痕的组织在14天时会出现，sei为1.5左右；当利用微针处理时，sei的值在0.8左右，这说明我们的技术在这种模型中抑制了肥大性瘢痕的形成。
本发明无药聚合物微针来抑制瘢痕疙瘩的生长、并进一步减小其尺寸，其作用机理在于微针和瘢痕疙瘩成纤维细胞的物理接触抑制了细胞的增殖，可以用来预防病理性瘢痕(即瘢痕疙瘩和增生性瘢痕)的生成，其实践中可包括卡介苗(bcg)疫苗注射、剖宫产切口、烧伤等等。
上述的微针贴片在制备治疗瘢痕疙瘩的试剂盒中的应用。
本发明一种治疗瘢痕疙瘩的试剂盒，包括上述的治疗瘢痕疙瘩的微针贴片，试剂盒中不包含有任何用于治疗瘢痕疙瘩的有效药物成分，同时，该试剂盒还包括棉签，碘伏或75％医用酒精等用于消毒的工具。
本发明微针贴片的使用方法：将微针阵列朝向人体，把微针贴片固定在瘢痕疙瘩处，其中，微针必须进入真皮层，接触到成纤维细胞，微针要停留在皮肤中至少12小时。为了取得更好的治疗效果，优选使用流程至少4个星期，每天更换微针贴片。
本发明微针贴片与目前可用的治疗方案不同，微针的独特之处在于它们可以由病人自己使用，这将大大降低医疗系统的负担；其次，由于其作用机理不涉及药物，因此不存在药物副作用问题；最后，其开发成本低，是一种一类医疗器械，与药物产品的开发相比，其成本相对较低。
以上对本发明做了详尽的描述，实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。