本发明涉及生物材料制备技术领域，具体涉及一种脱细胞真皮基质材料的制备方法。
背景技术：
细胞外基质的成分常常在物种间保守，并能被异种受体耐受。从不同组织获得的细胞外基质，包括皮肤、心脏瓣膜、血管、神经、骨骼肌、肌腱、韧带、小肠粘膜下层，已经在组织工程和可再生性材料应用中做了广泛研究。脱细胞的目标是有效的移除所有细胞和胞核物质，同时尽量减小对材料生物活性、机械完整性的不利影响。目前本领域也存在一些现有技术，例如：
发明专利申请201710682043.6提供了一种脱细胞真皮基质的制备方法，其包括以下步骤：灭毒断层皮片以脱脂剂脱脂后，经脱细胞液脱细胞，获得产物a；所述产物a以橄榄苦苷溶液交联后，依次经酒精漂洗、pbs溶液漂洗、干燥、辐照消毒，获得产物b；所述产物b以羧甲基壳聚糖溶液处理后，经水漂洗，获得产物c；所述产物c以戊二醛溶液浸泡后，经柔化、保湿处理、再以生理盐水漂洗、病毒灭活后，冻干制得脱细胞真皮基质；所述脱脂剂包括水和如下质量分数的：纯碱1.0％～4.0％；烧碱1.0％～4.0％；表面活性剂0.1％～1.0％；所述表面活性剂选自平平加、十二烷基氨基丙酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚或曲拉酮；所述脱细胞液包括水和如下质量分数的：胰酶0.1％～0.5％；激活剂0.1％～0.3％；脱脂剂0.2％～0.6％；所述激活剂为硫酸铵；所述脱脂剂为平平加或十二烷基硫酸钠溶液。
发明专利申请201710323525.2公开了一种异种脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)选用巴马香猪皮为皮源，对取皮区进行脱毛、消毒，用取皮机取下大张皮肤，无菌生理盐水清洗，皮鼓反取成0.25～0.5mm的断层皮片，采用激光打孔技术对断层皮片进行制孔，备用；(2)将步骤(1)制得的断层皮片浸泡于0.5～1.0％(m/v)的邻苯基苯酚钠水溶液中，处理6～8min，无菌生理盐水清洗3～4次，然后加入1～2％(m/v)三羟甲基甲胺基乙磺酸水溶液，超声震荡处理6～12h，每2h更换一次溶液，其中加入的三羟甲基甲胺基乙磺酸水溶液与断层皮片的重量比为10:1，得到去表皮的真皮；(3)将步骤(2)得到的去表皮的真皮置于0.2～0.4％tritonx-100(v/v)溶液中，室温下振荡洗涤6～12h，用含4000u/l庆大霉素生理盐水溶液洗涤3次，加入脱细胞处理液，在37℃条件下作用12～24h，所述的脱细胞处理液与去表皮的真皮的重量比为10:1，用含4000u/l庆大霉素生理盐水溶液洗涤3次，再用无菌生理盐水清洗3～4次，得到脱细胞真皮；(4)将步骤(3)得到的脱细胞真皮放入转鼓中，然后分次加入温度为35℃、ph为5.7的羧甲基壳聚糖溶液，反应30min后调节ph值至5.0，再反应75min，调节ph值至6.8，处理完毕后放净废液，再将处理后的材料用无菌生理盐水洗2次，每次15分钟，洗后控干水，得到脱细胞真皮基质；(5)将经步骤(4)处理得到的脱细胞真皮基质浸泡于体积浓度为0.1～0.3％(v/v)的戊二醛溶液中交联15～30min，无菌生理盐水冲洗10～15min，然后置于柔化剂溶液中浸泡30～60min，清洗后再放入保湿剂溶液中，37℃保温处理30～60min，最后用无菌生理盐水充分冲洗去除残留；(6)将经步骤(5)处理得到的脱细胞真皮基质放入冷冻干燥机的冷冻室内冻干后，成型包装，再经γ射线辐照消毒灭菌，即为成品。
发明专利申请201710247775.2披露了一种医用脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，包括以下操作步骤：1)将新鲜动物皮肤去肉后，依次进行消毒、清洗、高渗盐处理，撕去表皮，得待处理真皮皮片；2)将步骤1)制得的真皮皮片放入碱液和过氧化氢的混合溶液中浸泡3～24小时；3)将步骤2)处理后的真皮皮片进行裁切、剖层后浸泡在含有胰蛋白酶的溶液中，在35～40℃温度下，ph7～9，浸泡1～12小时；4)将步骤3)处理后的真皮皮片清洗后，冷冻存放，即完成。
但上述现有方法存在如下问题：制成的细胞外基质，其碱液的浓度高，浸泡的时间长，处理温度高，造成纤维消化，出现塌陷和空隙层，这将造成产品应用时细胞不能长入，对终产品的使用造成影响。其碱液浓度低、浸泡时间短，处理温度低，造成细胞脱不干净，引起基体的免疫反应，造成产品使用失败。
技术实现要素：
基于本领域存在的上述不足，本发明旨在提供一种既能使细胞脱除干净，又能保证真皮基质纤维的完整性，从而达到保证产品安全、高质量的目的。
本发明的技术方案如下：
一种脱细胞真皮基质材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将人或动物的皮肤组织置于固定剂中进行固定处理；
(2)将固定处理后的皮肤组织置于碱性溶液中进行脱细胞处理；
(3)将脱细胞处理后的皮肤组织进行浸提清洗处理；
所述固定剂为戊二醛、甲醛或过氧乙酸；
所述碱性溶液选自质量百分比浓度范围在4％-15％之间的naoh或koh溶液；
所述浸提清洗处理中使用的清洗液为生理盐水。
所述固定处理的时间为2小时以上。
所述脱细胞处理的时间为15-30小时，温度为15-35℃。
所述浸提清洗处理的时间为5-7小时。
所述制备方法还包括：进行所述浸提清洗处理后，可变化洗涤溶液，继续清洗直至皮肤组织呈半透明状态。
所述制备方法还包括：将浸提清洗处理后的皮肤组织置于氨基酸溶液中。
所述氨基酸溶液包括天门冬氨酸、谷氨酸或甘氨酸；优选地，所述氨基酸溶液的浓度为0.5％-2％。
所述脱细胞真皮基质材料保存于氨基酸溶液中，并调整溶液ph值为7.4左右。
所述人或动物的皮肤组织为去除了脂肪、表皮和毛发的皮肤组织。
所述的制备方法制备得到的真皮基质材料。
在本发明一些具体的实施例中，所述制备方法按如下步骤进行：取人或动物组织所得的皮肤，去脂肪和皮毛，放入固定剂中固定，固定剂可以是戊二醛、甲醛或过氧乙酸。该组织在固定液中至少保留2小时，或者直到该组织被固定。组织固定后用适宜的溶液对其进行洗涤，该溶液可以是蒸馏水，洗涤次数可以是多次。
然后将该组织放在碱性溶液中进行脱细胞，碱性溶液可以是naoh或koh溶液。放置时间为15-30小时，温度为15-35℃，碱液浓度为4％-15％。
本文中涉及的百分比浓度均为质量百分比浓度。
组织脱细胞后，使用生理盐水进行浸提清洗，浸泡时间为5-7小时，保证组织的生物安全性。实践中发现，若没有浸泡清洗，组织的细胞毒性不合格。
组织浸泡清洗后，可变化洗涤溶液，直到清洗为半透明状态，然后将组织放置于氨基酸中医消除残留的游离固定剂并降低ph。氨基酸可以是天门冬氨酸、谷氨酸或甘氨酸，浓度为0.5％-2％，最后调整ph约为7.4。
本发明保留了完好的细胞外基质以及活性物质，对于细胞的生长、分化、代谢、调节起到不可代替的作用。通过该技术处理过的组织，由于能够被宿主识别出对宿主表达组织免疫抗原性的细胞物质被去除，完整保留了脱细胞基质的形态，组织结构、超微结构，定位和耐受性等都与原有组织的基质一样。
本发明涉及人或动物组织所得的皮肤组织制备生物细胞外基质的方法。该方法可通过物理化学方式处理皮肤组织，去除可引起排斥的细胞成分，得到细胞外基质框架，用于移植或修复生命体的创面。
为了避免碱液浓度过高导致的过度消化脱细胞基质而使基质材料产生塌陷，而碱液浓度过低又会导致脱细胞效果不理想的情况发生，本发明经反复验证摸索出一套全新的真皮基质脱细胞处理方法，采用质量百分比浓度范围在4％-15％之间的naoh或koh溶液可使最终制备得到的脱细胞真皮基质材料的空隙率保持在70％-90％之间，空隙大小在15μm-42μm之间，细胞残留量为0，具备上述性能的脱细胞真皮基质材料可以很好地用于皮肤移植和/或修复，使皮肤细胞得以快速长入、不产生免疫原性、使用安全的同时，又不会因基质纤维过度消化而产生塌陷或空隙层，保证了脱细胞真皮基质材料的完整性和产品质量。
附图说明
图1为本发明一个实施例所提供的制备方法制备得到的脱细胞真皮基质材料的成品图。
图2为本发明一个实施例所提供的制备方法制备得到的脱细胞真皮基质材料的h-e染色结果图，×400，由图可知：皮肤基质通过上述方法处理后，胶原纤维排列整齐、致密，染色均匀，无水肿、崩解。无细胞结构发现。
图3为本发明一个实施例所提供的制备方法制备得到的脱细胞真皮基质材料的电镜照片图(标尺：50μm)，可以看出，皮肤基质通过上述方法处理后，表面光滑，局部有少量孔隙出现，无任何细胞附着。
图4为本发明一个实施例所提供的制备方法制备得到的脱细胞真皮基质材料的电镜照片图(标尺：30μm)，可以看出：皮肤基质通过上述方法处理后，表面光滑，可见大量交织排列的胶原纤维(→)，无任何细胞附着。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，但并不限制本发明的范围。如无特殊说明，下述实施例中采用的操作均为常规方法，所采用的材料均可以商购获得。
生物材料的来源
人或动物的皮肤组织来自：人体皮肤取材于无高血脂心血管病家族史、血清学检查人类免疫缺陷病毒(pcr法排除)、乙肝病毒、丙肝病毒、梅毒的人的各部位组织，来源均由捐献人或捐献亲属同意将组织捐献给医院或通过医院提供给相关机构进行医学临床使用的组织。动物皮肤取材于定点饲养、定点采购、定点屠杀，以及根据国家相关规定进行动物防疫、检疫的动物皮肤。
本发明提供一种脱细胞真皮基质材料的制备方法。在本发明所有的实施例中，都具备如下共同特征：所述制备方法包括如下步骤：
(1)将人或动物的皮肤组织置于固定剂中进行固定处理；
(2)将固定处理后的皮肤组织置于碱性溶液中进行脱细胞处理；
(3)将脱细胞处理后的皮肤组织进行浸提清洗处理；
所述固定剂为戊二醛、甲醛或过氧乙酸；
所述碱性溶液选自浓度范围在质量百分比浓度为4％-15％之间的naoh或koh溶液；采用这一碱液浓度可使处理得到的脱细胞真皮基质材料的细胞脱干净，不引起机体的免疫反应，同时使处理得到的脱细胞真皮基质材料具备足够空隙。经本发明制备方法处理制备得到的脱细胞真皮基质材料的空隙可达到15μm-42μm，空隙率在70％-90％之间，使产品应用时细胞得以长入，又不至于造成纤维消化出现塌陷和空隙层。
本文中“空隙”的定义：细胞清除后相应空间空出，在原有细胞腾出的空间即空隙。由于原始的生物材料，例如真皮，经过了脱细胞等一系列处理，脱细胞后的基质框架结构会发生一定程度的改变，因此本文中的“空隙”与原始真皮中的细胞间的结构空隙不能等同。
所述浸提清洗处理中使用的清洗液为生理盐水。
本文中的“真皮”一词具有本领域的常规含义，本领域技术人员可通过常规技术手段获取本文所述的“真皮”。
在进一步的实施例中，所述固定处理的时间为2小时以上。这一步的作用在于：保护框架结构在脱细胞处理过程中不被破坏。
在一些实施例中，所述脱细胞处理的时间为15-30小时，温度为15-35℃。选用这些反应参数和反应条件的好处是：细胞脱除干净，框架保持完整。
在另一些实施例中，所述浸提清洗处理的时间为5-7小时。
在进一步的实施例中，所述制备方法还包括：进行所述浸提清洗处理后，可变更洗涤液，继续清洗直至皮肤组织呈半透明状态。具体地，所述洗涤液选自纯化水或蒸馏水。
在更进一步的实施例中，所述制备方法还包括：将浸提清洗处理后的皮肤组织置于氨基酸溶液中。
在具体的实施例中，所述氨基酸溶液包括天门冬氨酸、谷氨酸或甘氨酸；这几类氨基酸是脱细胞真皮基质框架成分(胶原成分为主)保养所必须的。
在优选的实施例中，其中所述氨基酸溶液的浓度为质量浓度0.5％-2％。
在更具体的实施例中，所述脱细胞真皮基质材料保存于氨基酸溶液中，并调整溶液ph值为7.4左右；采用ph7.4左右的氨基酸溶液做为脱细胞真皮基质材料的保存溶液好处在于：为弱碱性溶液，能够保持蛋白活性，模拟蛋白的生存环境。
本发明制备方法所制备得到的脱细胞真皮基质材料产品应用的方面很多，皮肤创面缺损的修复，如烧烫伤修复、覆盖等，引导组织再生，如口腔黏膜修复、疝修复、体壁缺损修复、耳鼻喉黏膜修复、角膜修复等；整形应用等。
在某些实施例中，所述人或动物的皮肤组织为去除了脂肪、表皮和毛发的皮肤组织，即，真皮层组织。
实验例1、本发明的具体操作
取人或动物组织所得的皮肤，去脂肪和皮毛，放入固定剂中固定，固定剂可以是戊二醛、甲醛或过氧乙酸。该组织在固定液中至少保留2小时，或者直到该组织被固定。组织固定后用适宜的溶液对其进行洗涤，该溶液可以是蒸馏水，洗涤次数可以是多次。
然后将该组织放在碱性溶液中进行脱细胞，碱性溶液可以是naoh或koh溶液。放置时间为15-30小时，温度为15-35℃，碱液浓度为4％-15％。
组织脱细胞后，使用生理盐水进行浸提清洗，浸泡时间为5-7小时，保证组织的生物安全性。实践中发现，若没有浸泡清洗，组织的细胞毒性不合格。
组织浸泡清洗后，可变化洗涤溶液，直到清洗为半透明状态，然后将组织放置于氨基酸中医消除残留的游离固定剂并降低ph。氨基酸可以是天门冬氨酸、谷氨酸或甘氨酸，浓度为0.5％-2％，最后调整ph约为7.4。
实验例2、本发明的方法制备得到的真皮基质材料的性能效果验证
采用本发明的制备方法获得的真皮基质材料，经本领域常规检测方法，例如发明专利申请201711056849.0记载的检测方法，检测下述各项性能指标，获得如下结果：
细胞毒性实验结果：如图2和图3所示，细胞无毒性；免疫原性成分检测为0；
脱细胞效果数据：细胞残留量为0；
机械性能数据：抗张强度大于3mpa；断裂力大于20n；顶破力大于35n；缝合力大于32n。
通过电镜观察和计数，统计得到下述空隙数据：如图3和图4所示，本发明制备方法得到的脱细胞真皮基质材料的空隙率70％-90％，空隙大小为15μm-42μm。