组胺素1多肽在制备促进大面积皮肤缺损修复的复合材料中的应用的制作方法

本发明属于生物医学领域，特别涉及组胺素1多肽在制备促进大面积皮肤缺损修复的复合材料中的应用。

背景技术

大面积皮肤全层缺损常见于外伤、烧伤、肿瘤切除及糖尿病引起的皮肤溃疡等。大面积的皮肤全层缺损无法自行愈合，需要行自体皮片、皮瓣移植，但以上方法存在来源有限，需二次手术等不足。而异体皮片、皮瓣存在免疫排斥等风险。因此，大量的人工真皮植入物被用于皮肤缺损修复，然而这些材料最终并没有获得理想的治疗效果。皮肤缺损治疗不理想一方面是因为在大面积缺损皮肤中缺乏血管供应，不能为新生的组织提供充足的氧气和养分；另外，过多的炎症反应及细胞趋化性、细胞粘附性差，也会影响皮肤缺损愈合，导致愈合延迟。

口腔组织的伤口愈合速度要明显快于全身其他部位的伤口愈合速度，牙龈组织的修复速度是皮肤损伤修复速度的两倍，而且可以有效减少疤痕的形成，其中一个重要原因可能是口腔中的蛋白、多肽具有促进皮肤缺损修复的作用。组胺素是人类腮腺和颌下腺分泌的一组富含组氨酸的阳离子多肽，长度为7～38个氨基酸残基。组胺素1,3,5是其中最重要的3种，占组胺素总含量的85～90％。近年来，组胺素1(hst1)在生物医学领域得到了深入的研究，其具有促进细胞粘附、伸展、迁移、血管化生、抗炎等多方面作用，但hst1是否可以应用于大面积皮肤缺损修复未见相关报道。目前组胺素仅见1项专利申请：申请号为201580061786.0，名称为“唾液富酪蛋白肽”的专利申请，公开的是组胺素应用于治疗牙齿脱矿。因此，为了促进大面积皮肤创面修复，解决创面修复炎症反应及血管化不足等难题，开发以hst1多肽为基础的皮肤缺损修复材料，高效促进皮肤大面积缺损的修复具有重要的应用价值。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供组胺素1多肽在制备促进大面积皮肤缺损修复的复合材料中的应用。

本发明的另一目的在于提供组胺素1多肽在制备促进大面积皮肤缺损修复的药物中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：组胺素1(hst1)多肽在制备促进大面积皮肤缺损修复的复合材料中的应用。

所述的组胺素1(hst1)多肽的氨基酸序列选自如下任一序列：

(1)如seqidno.1(ds^phekrhhgyrrkfhekhhshrefpfygdygsnylydn)所示的氨基酸序列；

(2)含有seqidno.1中的部分或全部氨基酸序列的多肽；

(3)对seqidno.1所示的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或添加(插入)所获得的，与seqidno.1所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列。

所述的组胺素1(hst1)多肽的用量为10～1000μg/天/人，每周1次；应用于临床的剂量及剂量范围需要结合许多因素，包括给药方式、载体、患者的身体状况及缺损的大小等。

所述的大面积皮肤缺损包括外伤、烧伤、肿瘤切除或糖尿病引起的皮肤溃疡等。

所述的复合材料为由组胺素1(hst1)多肽与载体组成的复合材料；复合材料的形式可以为敷料、喷雾剂、水凝胶和膏药等；优选为负载hst1多肽的巯基化壳聚糖水凝胶，负载hst1多肽的胶原海绵或负载hst11多肽的聚乙醇酸多孔纤维膜；所述的复合材料的使用方式为将敷料，喷雾剂，水凝胶，膏药等直接喷洒或覆盖于伤口或组织表面。

所述载体为生物相容性好且不影响多肽活性的载体，包括可降解天然高分子，合成高分子以及生物陶瓷；具体包括天然材料及其衍生物，合成高分子材料及其衍生物，以及生物陶瓷中的一种以上。

所述的天然材料包括壳聚糖、透明质酸盐、海藻酸钠、纤维素、淀粉、木质素、胶原、明胶和卡拉胶等。

所述的合成高分子材料包括聚乳酸、聚乙醇酸、聚己内酯、聚羟基烷酸酯、聚硅氧烷和聚氨酯等。

所述的生物陶瓷包括羟基磷灰石、磷酸氢钙、磷酸三钙、磷酸八钙和硫酸钙等。

所述的敷料包括组胺素1(hst1)多肽，以及膜或海绵等。

所述的负载hst1多肽的巯基化壳聚糖水凝胶优选为通过如下方法制备得到：

(i)将巯基化壳聚糖(cs-sh)溶解到ph＝8的水中，然后加入β-甘油磷酸钠调节ph＝7，得到cs-sh水凝胶；

(ii)将hst1多肽溶液加入到cs-sh水凝胶中，搅拌均匀，得到负载hst1多肽的巯基化壳聚糖水凝胶；

步骤(i)中所述的巯基化壳聚糖(cs-sh)优选为通过如下方法制备得到：

将壳聚糖溶于醋酸水溶液中，然后加入1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(edac)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，在室温条件下避光搅拌反应15min，然后加入半胱氨酸(cys)，调节ph至5～6，再在室温条件下避光搅拌反应5小时，透析，冷冻干燥，得到巯基化壳聚糖(cs-sh)。

所述的醋酸水溶液为浓度为0.5％(v/v)的醋酸水溶液。

所述的壳聚糖的用量按每100ml醋酸水溶液配比1g壳聚糖计算。

所述的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(edac)的用量按终浓度为50mmol/l计算。

所述的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)的用量按终浓度为50mmol/l计算。

所述的壳聚糖与半胱氨酸的摩尔比为1:1。

所述的ph的调节剂为naoh溶液；优选为1mol/l的naoh溶液。

所述的透析优选为通过如下步骤实现：依次以ph＝5.0的hcl溶液，含1％(w/v)nacl、ph＝5.0的hcl溶液和ph＝5.0的hcl溶液避光透析3天。

步骤(i)中所述的cs-sh水凝胶为浓度为5％(w/v)的cs-sh水凝胶。

步骤(ii)中所述的hst1多肽溶液的浓度为125mg/ml。

步骤(ii)中所述的hst1多肽溶液与cs-sh水凝胶的体积比优选为1：9。

所述的负载hst1多肽的胶原海绵包括胶原海绵和hst1水溶液；其中胶原海绵通过如下方法制备得到：

(a)将i型胶原溶于醋酸水溶液中获得胶原溶液，然后将胶原溶液冷冻干燥，得到多孔海绵膜；

(b)将多孔海绵膜放置在氨气气氛中30分钟，然后水洗至中性，冷冻干燥、灭菌，得到胶原海绵。

步骤(a)中所述的胶原溶液为浓度为3wt％的胶原溶液。

步骤(a)中所述的醋酸水溶液为浓度为1％(v/v)的醋酸水溶液。

步骤(a)中所述的多孔海绵膜为直径5mm，高度2mm、孔隙率90％以上的多孔海绵膜。

所述的hst1水溶液的浓度优选为40μg/ml。

所述的负载hst11多肽的聚乙醇酸多孔纤维膜包括聚乙醇酸(pga)纤维多孔膜和hst1水溶液；其中，聚乙醇酸(pga)纤维多孔膜优选为通过静电纺丝制备得到。

所述的hst1水溶液的浓度优选为40μg/ml。

组胺素1(hst1)多肽在制备促进大面积皮肤缺损修复的药物中的应用。

所述的促进大面积皮肤缺损修复的药物的给药方式为局部给药、皮下注射、皮内注射、肌内注射或静脉注射。

所述的促进大面积皮肤缺损修复的药物还可以含有一种或者是至少两种药学上可以接受的载体。

所述的载体优选为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、或表面活性剂等。

所述的促进大面积皮肤缺损修复的药物可采用本领域的常规方法制成各种剂型，包括粉剂、针剂等。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明发现组胺素1(histatin1，hst1)多肽具有促进细胞粘附、血管化生及抑制炎症反应的特性。体外实验证实，hst1多肽可促进间充质干细胞粘附、伸展、血管化生、迁移、抑制炎症反应、上调干细胞的血管化因子并激活间充质干细胞-内皮细胞形成血管样组织，其促进血管化能力较空白对照组提高2.8倍，说明hst1多肽可以有效促进皮肤缺损的修复。动物实验证实hst1多肽皮下注射后，可加速大鼠皮肤缺损愈合速度，其皮肤缺损愈合较对照组快。体内实验证实，hst1多肽及复合组hst1的水凝胶、膜、膏及海绵等材料可促进大鼠皮肤缺损的愈合速度：hst1多肽负载壳聚糖水凝胶可以高效促进大鼠皮肤缺损的愈合，在7天时，其皮肤缺损修复82％，而对照组仅仅修复了51％。

(2)本发明应用的hst1多肽为人源性多肽，具有良好的生物相容性和生物安全性，未发现动物有急性毒性反应，且无免疫排斥等副作用，同时在成瘤观察中，hst11多肽无明显成瘤性。

(3)大面积皮肤缺损修复困难主要是因为细胞粘附困难、血管化不足及创面修复炎症反应，本发明应用的hst1多肽具有消炎抗菌作用，高效促进伤口愈合。

(4)本发明应用的hst1多肽可以负载于多种生物材料，具有广泛的应用前景，如hst1多肽与生物活性材料复合，制备敷料、针剂、膏剂、粉剂、水凝胶、膜、海绵、纤维支架材料等可高效促进大面积皮肤缺损的愈合，具有重要的医用价值；且hst1多肽复合人工材料制备简单，价格便宜。因此，应用hst1多肽制备促进大面积皮肤缺损修复材料具有良好产业化前景。

附图说明

图1为hst1对间充质干细胞粘附、伸展的作用研究结果图；其中，图a为hst1对间充质干细胞粘附的作用；图b为hst1对间充质干细胞伸展的作用。

图2为实施例1中巯基化壳聚糖可注射水凝胶的细胞活性示意图。

图3为实施例1中huvecs细胞种植于巯基化壳聚糖可注射水凝胶的显微镜图；其中，图a为水凝胶；图b为负载hst1水凝胶。

图4为实施例2中hst1多肽修复大鼠皮肤缺损7天时的修复结果图；其中，图a皮肤修复图；图b为皮肤修复比例统计图。

图5为实施例3中巯基化壳聚糖可注射水凝胶修复大鼠皮肤缺损的修复结果图；其中，图a皮肤修复图；图b为皮肤修复比例统计图。

图6为负载hst1多肽的胶原海绵对大鼠皮肤缺损的修复的masson染色图。

图7为实施例5中负载hst1多肽的聚乙醇酸多孔纤维膜应用于促进大鼠皮肤缺损修复的大体图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下述实施例中所使用的各原料以及试剂，除特别指出的以外，均可由市售获得。

实施例涉及到hst1多肽为hst1多肽粉剂(由上海淘普生物公司合成)，其氨基酸序列为：ds^phekrhhgyrrkfhekhhshrefpfygdygsnylydn(第2位丝氨酸被磷酸化)。

实施例1：hst1多肽促进细胞粘附、伸展及成血管的研究

(1)将骨髓间充质干细胞(购于cyagenbiosciencesinc(usa)，批号170221i31)接种于96孔板中，密度为每孔5×10³个骨髓间充质干细胞(bmscs)，加入50μl含有终浓度为10μmhst1多肽的无血清培养基(a-mem,gibco)，对照组为单纯无血清培养基(a-mem,gibco)，培养1.5h，3h后鬼笔环肽染色，观察细胞粘附及伸展情况。

(2)将bmscs接种于96孔板中，密度为每孔5×10³个细胞，加入50μl含有终浓度为10μmhst1多肽的无血清培养基培养1d(天)，3d和5d，然后于每个时间点将90μl培养液(a-mem,gibco)和10μlcck-8溶液(日本同仁化学)加入到每个孔中，并再次在37℃下孵育2h。从24孔培养板的每个孔中取出100μl反应液并转移到干净的96孔板内，利用光谱光度酶标仪测定溶液在450nm处的吸光度。

(3)将含有hst1多肽的壳聚糖水凝胶平铺于96孔板，每孔40ul，浓度为125mg/ml，将bmscs接种于96孔板中，密度为每孔5×10³个细胞，对照组为不含hst1多肽水凝，培养3天后，显微镜观察细胞粘附、伸展情况。其中，含有hst1多肽的壳聚糖水凝胶(即负载hst1多肽的巯基化壳聚糖水凝胶)的制备方法如下：

①巯基化壳聚糖可注射水凝胶的制备方法：

称取1g壳聚糖溶于100ml0.5％(v/v)的醋酸水溶液，分别加入终浓度为50mmol/l的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(edac)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，室温、避光搅拌反应15min，然后将cys加至反应体系中(壳聚糖与半胱氨酸的摩尔比为1:1)，用1mol/lnaoh溶液调节ph至5～6，室温、避光搅拌反应5小时；依次以ph＝5.0hcl溶液，含1％(w/v)nacl的ph＝5.0hcl溶液和ph＝5.0hcl溶液避光透析3天，最后冷冻干燥，得到巯基化壳聚糖(cs-sh)样品，4℃保存。

②将cs-sh加入ph＝8的去离子水溶液中，充分溶解后，最终配制成5％(w/v)的cs-sh溶液，然后加入β-甘油磷酸钠在室温下调节最终的ph＝7左右，得到cs-sh水凝胶；

③按照cs-sh水凝胶与hst1多肽溶液(hst1多肽溶液的浓度为125mg/ml)的体积比为9:1加入搅拌混匀，即可得到凝胶前驱液(负载hst1多肽的巯基化壳聚糖水凝胶)。

(4)结果

细胞粘附、伸展、血管化结果表明，hist1明显促进bmscs粘附，其细胞粘附数量在1.5h和3h分别是对照组(con)的2.4倍及1.8倍；hist1显著促进bmscs伸展，其细胞伸展比例在1.5h和3h分别是对照组的2倍及1.5倍(见图1)。

cck-8实验证明hst1多肽具有良好的细胞相容性，其细胞活性在1,3,5d，与对照组均无统计学差异(见图2)。

结果显示负载hst1多肽水凝胶可明显促进bmscs细胞的伸展(见图3)。

实施例2：hst1多肽促进大鼠皮肤缺损修复的研究

(1)构建sd大鼠大面积皮肤缺损模型

将sd大鼠(体重250～300g，共5只，购自南方医科大学动物实验中心)用3％(w/v)的戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉后，俯卧于手术台，固定四肢，背部剃毛，1％(w/v)碘消毒铺巾。皮肤打孔器在背侧做5mm直径的圆形全层皮肤缺损，术后3d内，每天注射庆大霉素(注射量为4mg/kg)预防感染，注射卡布洛芬(注射量为12.5mg/kg)镇痛，并分笼正常喂养。

(2)hst1多肽对大鼠皮肤缺损的修复

采用sd大鼠自身对照，一侧为实验组，将预先准备好的hst1多肽粉剂植入皮肤缺损处(覆盖在伤口表面)，每个缺损处填入约100μghst1多肽粉剂，并使用纱布覆盖包扎。另一侧为对照组，不予特殊处理。整个实验过程无需更换敷料，每天观察动物的活动以免敷料脱落。

术后第0d(手术后当天)和7d，利用数码相机记录创面情况。实验结果如图4所示。图像分析软件(imagej)测定皮肤缺损的面积提示应用hst1明显加快皮肤缺损修复速度，7天时组胺素1修复大约75％皮肤面积，而对照组(con)仅仅修复了51％。其中，创面愈合面积用如下公式计算：

p＝[(i-r)/i]×100％；

式中：i为初始皮肤缺损面积，r为特定时间点的皮肤缺损面积。

实施例3：负载hst1多肽巯基化壳聚糖水凝胶促进大鼠皮肤缺损修复

(1)负载hst1多肽的巯基化壳聚糖水凝胶的制备方法同实施例1。

(2)负载hst1多肽巯基化壳聚糖水凝胶对大鼠皮肤缺损的修复

采用sd大鼠(模型构建方法同实施例1)自身对照，一侧为实验组，注入负载hst1多肽巯基化壳聚糖水凝胶，将负载hst1多肽巯基化壳聚糖的水凝胶(每例皮肤缺损注射40ul水凝胶)注入至sd大鼠皮肤缺损(ф＝5mm)处；另一侧为对照组；其中，对照组(con)不予特殊处理。结果如图5所示，表明负载hst1多肽巯基化壳聚糖明显促进皮肤修复。

实施例4：负载hst1多肽的胶原海绵应用于促进大鼠皮肤缺损修复。

(1)负载hst1多肽的胶原海绵的制备

①多孔海绵膜的制备：i型胶原(四川铭让生物科技有限公司)溶于1％(v/v)醋酸水溶液后，制备3％(wt％)胶原溶液，冷冻干燥后得到直径为5mm、高度为2mm的多孔海绵膜，孔隙率90％以上；然后在氨气气氛中放置30分钟，水洗至中性；最后冷冻干燥后，灭菌，低温密封保存；

②hst1溶液的制备：将250μghst1多肽粉剂用2ml灭菌去离子水分散溶解。

(2)负载hst1多肽的胶原海绵对大鼠皮肤缺损的修复

采用sd大鼠(模型构建方法同实施例1)自身对照，一侧为实验组，将预先准备好的多孔海绵膜植入(覆盖于伤口表面)皮肤缺损处(ф＝5mm)，然后加入hst1溶液(直径5mm多孔海绵膜负载40μlhst1溶液)；另一侧为纯胶原(单纯多孔海绵膜)对照组。

结果发现5天后材料部分降解，新生皮肤覆盖至整个缺损区，与对照组(con)相比，实验组新生皮肤更致密，更接近正常皮肤组织(见图6)。

实施例5：负载hst1多肽的聚乙醇酸多孔纤维膜应用于促进大鼠皮肤缺损修复。

将静电纺丝制备的聚乙醇酸(pga)纤维多孔膜(纤维直径约100nm，膜孔隙率95％；其合成方法参考：minsuklee,taufiqahmad,jinkyulee,hassank.awada,yadongwang,kyobumkim,heungsooshinandheeseokyang,dualdeliveryofgrowthfactorswithcoacervate-coatedpoly(lactic-co-glycolicacid)nanofiberimprovesneovascularizationinamouseskinflapmodel,biomaterials,10.1016/j.biomaterials.2017.01.036,124,(65-77),(2017).)湿热灭菌。

采用sd大鼠(模型构建方法同实施例1)，体重250～300g，共5只，购自南方医科大学动物实验中心。以自身为对照，一侧为实验组，植入pga纤维多孔膜，将其植入到大鼠一侧皮肤缺损处(ф＝5mm)，将250μghst1多肽粉剂用2ml灭菌去离子水分散溶解，然后每处加入40μlhst1溶液(含5μghst1)；另外一侧空白对照。

结果发现7天后实验组皮肤修复78％，而空白对照组仅为50％(见图7)。

综上，本发明中发现hst1多肽可明显促进大面积皮肤缺损的修复，将其与多种生物材料复合的水凝胶、膜、膏及海绵等，均可取得相似的促进皮肤缺损修复作用。hst1多肽可以是天然多肽或合成多肽，也可以是全部氨基酸序列或个别、多个氨基酸的取代、缺失和插入变异的多肽及同源物，因为部分氨基酸的改变并不影响其实质功能。复合材料除了上述材料之外，其他的复合材料如可降解天然高分子、合成高分子及生物陶瓷亦可以促进大鼠皮肤缺损修复，如壳聚糖、透明质酸盐、海藻酸钠、纤维素、淀粉、木质素、胶原、明胶、卡拉胶等天然材料及其衍生物，聚乳酸、聚乙醇酸、聚己内酯、聚羟基烷酸酯、聚硅氧烷、聚氨酯等合成高分子材料及其衍生物，羟基磷灰石、磷酸氢钙、磷酸三钙、磷酸八钙、硫酸钙等生物陶瓷，以及以上材料所组成的复合材料等。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>杭州彗搏科技有限公司

<120>组胺素1多肽在制备促进大面积皮肤缺损修复的复合材料中的应用

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<170>siposequencelisting1.0

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<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

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202530

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35