一种RGT肽及其衍生物在流体条件下的应用的制作方法

本发明属于细胞生物工程技术领域，具体涉及一种rgt肽及其衍生物在流体条件下的应用。

背景技术

人体血液循环中的血小板在血管下内皮受损，胶原暴露的时候能够通过粘附聚集等一系列反应诱导血栓形成，从而产生血栓并进一步达成止血。其中，介导血小板粘附聚集的三要素是：激动剂、可溶性粘附蛋白(纤维蛋白原)和膜受体(整合素αiibβ3)(koreancircj.2012；42(5):295-301.)。

内皮细胞分泌的血小板活化抑制因子使得完整的血管内不易形成稳定的血栓。然而，一旦血管内皮因外伤或动脉粥样硬化而发生破损，导致内皮下基质成分暴露，血小板即可迅速粘附到基质上以限制出血、促进组织修复。其中，这些基质包括多种粘附大分子，如胶原、vwf、层连蛋白、纤连蛋白和凝血酶敏感蛋白等(annurevbiomedeng.1999；1:299-329.)。

上述作用将使血小板中的可活化受体(如αiibβ3)与内皮下基质蛋白之间发生作用，并使血小板与基质之间形成稳定粘附。同时，αiibβ3也可以与血浆其他成分及血管壁蛋白(包括纤维蛋白原)结合(annurevbiomedeng.1999；1:299-329，annurevcellbiol.1990；6:329-57.)，从而参与血小板的粘附聚集过程。

由于血栓的产生与血小板的粘附聚集过程相关，因此现有技术中出现了一些改变血小板作用从而治疗血栓的药物，其中一些能够通过完全抑制整合素αiibβ3的信号转导作用来抑制血小板粘附聚集，从而抑制血栓形成。然而，由于不具有选择性，这类药物通常会对血小板的内向外和外向内双向信号无选择性的抑制，在抑制血栓形成的同时会影响人体的正常止血功能，造成微、小血管的出血等副作用，因此通常只在血栓较为严重时进行短时或者支架后瞬时用药。

rgt是一个氨基酸顺序为精氨酸-甘氨酸-苏氨酸的三肽，其十四烷酰化修饰的衍生物(即myr-rgt)具有选择性抑制整合素αiibβ3介导的血小板外向内信号转导过程的作用，因此，能够实现在抑制血小板血栓形成的同时基本不影响正常止血功能的效果。rgt肽能够在血液静止状态下抑制血小板的粘附聚集(参见申请号为cn200610117991.7的中国专利申请文件)。

然而，血小板在体内发挥止血和血栓形成的作用是在血液中流动的状态下实现的。研究表明，正常的冠状动脉、颈动脉以及大脑中动脉，剪切率范围在200-500s^-1，微狭窄大中动脉或小动脉剪切率大约在500s^-1，静脉的剪切率大约在20-200s-¹，轻度狭窄的大中动脉或微动脉的剪切率大约在1500s^-1，中度到重度狭窄的大中动脉剪切率大约在5000s^-1(blood.1996；88(5):1525-41.)。同时，在剪切率小于等于500s^-1时，血小板的粘附聚集主要是由纤维蛋白原/整合素αiibβ3介导的外向内信号实现的，而当剪切率大于500s^-1时血小板的粘附聚集主要由vwf-gpib/ix/v介导的信号实现(jhematoloncol.2015；8:62.)。

由于人体不同口径的血管的剪切率各不相同，血小板在不同剪切率情况的血液中发挥作用的机制也不同，因此，即使是同一种具有粘附聚集抑制作用的药物，在不同剪切率情况的血液中也可能具有完全不同的药效。对于上述rgt肽及其衍生物来说，即使证实了其在静态血液中所具有的外向内信号抑制作用，仍然无法说明其在实际的血液流体中能够发挥何种作用，进而不能获知其能够实际应用的疾病场景。

技术实现要素：

基于上述事实，为了得出rgt肽及其衍生物能够应用的疾病场景，发明人采用了纤维蛋白原包被条件下对不同剪切率的流体状态血液使用myr-rgt处理的方式来考察流体条件下myr-rgt对血小板的整合素αiibβ3外向内信号抑制的情况，对相应的实验结果进行了分析从而得出了rgt肽及其衍生物能够应用的血液流体条件及对应的疾病场景，并提出了如下技术方案。

本发明提供了一种rgt肽及其衍生物的应用，其特征在于，用于制备在流体条件下的血液中选择性阻断整合素β3介导的外向内信号从而抑制流体条件下血小板粘附聚集的药物，其中，流体条件下的血液的剪切率小于等于500s^-1。

本发明提供的rgt肽及其衍生物的应用，还可以具有这样的技术特征，其中，药物用于预防冠状动脉、颈动脉以及大脑中动脉中产生血栓。

本发明提供的rgt肽及其衍生物的应用，还可以具有这样的技术特征，其中，制剂用于对冠状动脉、颈动脉以及大脑中动脉中已经导致微狭窄的血栓进行治疗。

本发明提供的rgt肽及其衍生物的应用，还可以具有这样的技术特征，其中，制剂用于研发新的心脑血管疾病的治疗方法以及准确了解轻度心脑血管阻塞情况下的血小板功能。

本发明提供的rgt肽及其衍生物的应用，还可以具有这样的技术特征，其中，衍生物为十四烷酰化修饰rgt肽。

发明作用与效果

根据本发明提供的rgt肽及其衍生物在流体条件下的应用，由于剪切率500s^-1的条件下，myr-rgt能够显著地抑制血小板在纤维蛋白原包被表面的粘附和聚集，说明rgt肽及其衍生物在实际的血液流动状态下也能够表现出对血小板粘附聚集的抑制作用。同时，由于myr-rgt能够在剪切率500s^-1的流体条件下对与纤维蛋白原相关的粘附聚集表现出抑制作用，而剪切率更低时血小板的粘附聚集也与纤维蛋白原相关，因此说明myr-rgt在剪切率小于等于500s^-1的条件下也能够表现出血小板的粘附聚集抑制作用。所以，rgt肽及其衍生物能够用于抑制在剪切率小于等于500s^-1的流体条件下的血小板粘附聚集，因而能够适用于对应疾病的预防和治疗。另外，由于rgt肽及其衍生物作用机制与血小板功能相关，因此在对这些对应疾病进行治疗方法开发或病理机制研究(例如研究病理过程中血小板功能的变化等)时，也可以利用上述的rgt肽及其衍生物。

附图说明

图1是本发明实施例的流体条件下正常血小板在纤维蛋白原包被表面的粘附聚集情况显微照片；

图2是本发明实施例的流体条件下正常血小板在纤维蛋白原包被表面的粘附聚集情况的量化结果；

图3为本发明实施例的流体条件下药物处理的血小板在纤维蛋白原包被表面的粘附聚集情况显微照片。

具体实施方式

以下结合附图及实施例来说明本发明的具体实施方式。下述实施例中，不同剪切率条件的流体流动采用模拟剪切力活细胞观察工作站bioflux200system(美国fluxion公司)实现，其它未注明的实验条件均采用本领域的常规实验条件。

<实施例>

在正常的冠状动脉、颈动脉以及大脑中动脉，剪切率范围在200-500s^-1。本实施例首先构建了能够让血小板粘附聚集的粘附平面及包被体系，通过测量不同药物条件及流体条件下血小板在该粘附平面上的粘附聚集能力的方式来考察不同药物在不同流体条件下对血小板作用产生的影响。

具体实验过程如下：

1.包被体系准备

前一天晚上取2.5μg/μl的纤维蛋白原加0.1m的nahco3(ph8.3)稀释调终浓度为100μg/ml，加60μl到bioflux200板孔中，灌流2分钟，4℃包被过夜；次日向上述体系中加含钙、镁的pbs(含0.9mm的ca²⁺，0.5mm的mg²⁺)200μl灌流冲洗5分钟，再用含钙、镁的pbs配制的2％bsa200μl灌流5分钟，室温下包被2小时备用。

2.血液准备

正常健康人外周静脉抽血，抽出后立即加ppack抗凝，终浓度为150μm。荧光定量时加荧光染料calceinam标记血小板，终浓度为4μm，室温孵育30分钟，每10分钟颠倒一次，(白光观察时可不加荧光染料)。

3.流体条件下测定粘附情况

加入bioflux200专用24孔板以5000s^-1、3750s^-1、2500s^-1、1500s^-1、1000s^-1、500s^-1、250s^-1、125s^-1剪切率流动5分钟后停止，20×物镜，荧光显微镜拍摄录像采集视野。

图1是本发明实施例的流体条件下正常血小板在纤维蛋白原包被表面的粘附聚集情况显微照片，图2是本发明实施例的流体条件下正常血小板在纤维蛋白原包被表面的粘附聚集情况，图2中，横坐标为流体剪切率，纵坐标为粘附血小板的荧光密度。

如图1及图2所示，在未添加任何影响血小板功能的药物时，包被纤维蛋白原后在流体剪切率小于等于500s^-1时血小板可粘附，但大于500s^-1血小板是不粘附的。这是由于剪切率小于等于500s^-1时血小板的粘附主要依赖于纤维蛋白原介导的外向内信号发挥作用，而大于500s^-1时血小板的粘附主要依赖于胶原和vwf等。由于在本实施例中所用的包被材料仅为纤维蛋白原，因此在剪切率大于500s^-1时血小板不能粘附。

4.药物对流体条件下血小板粘附情况的影响

本实施例中以myr-rgt作为rgt肽衍生物来考察rgt肽及其衍生物的作用，同时采用不同的对照组来进行了对比考察。对照组包括：(1)myr-grt，即十四烷酰化修饰的甘氨酸-精氨酸-苏氨酸三肽的衍生物，该甘氨酸-精氨酸-苏氨酸三肽对血小板无影响，因而myr-grt作为阴性肽对照组；(2)rgds，即对血小板具有双向信号抑制作用从而对血小板聚集具有强抑制作用的药物，作为阳性对照组；(3)dmso，对血小板无影响作用，作为未加药物的对照组。

上述各实验组的操作具体为：取myr-rgt(200μm)或myr-grt(200μm)或rgds(1mm)或dmso，在37℃条件下分别与洗涤的血小板悬液共孵育30分钟。将共孵育后的血小板(2×10⁸/ml)和红细胞(2×10⁸/ml)混合，以500s^-1剪切率在有纤维蛋白原包被过的管腔内流动6分钟。采用60×物镜，在白光下实时拍摄录像(曝光强度为自动曝光)。

图3为本发明实施例的流体条件下药物处理的血小板在纤维蛋白原包被表面的粘附聚集情况显微照片。其中，图3(a)为dmso组，图3(b)为rgds组，图3(c)为myr-grt组，图3(d)为myr-rgt组。

如图3所示，dmso组和myr-grt组均未表现出血小板粘附聚集抑制作用，myr-rgt表现出了较为明显的血小板粘附聚集抑制作用，而rgds表现出更为强烈的血小板粘附聚集抑制作用。

综合图1、图2和图3所示的实验结果可以看出，在模拟了体内血液流动的情况下，剪切率500s^-1的条件下myr-rgt能够显著地抑制血小板在纤维蛋白原包被表面的粘附和聚集。

实施例作用与效果

根据上述实验结果可以看出，剪切率500s^-1的条件下，myr-rgt能够显著地抑制血小板在纤维蛋白原包被表面的粘附和聚集，说明rgt肽及其衍生物在实际的血液流动状态下也能够表现出粘附聚集抑制作用。同时，由于myr-rgt能够在剪切率500s^-1的流体条件下对与纤维蛋白原相关的粘附聚集表现出抑制作用，而剪切率更低时血小板的粘附聚集也与纤维蛋白原相关，因此说明myr-rgt在剪切率小于等于500s^-1的条件下也能够表现出血小板的粘附聚集抑制作用。

所以，rgt肽及其衍生物能够用于抑制在纤维蛋白原包被表面在剪切率小于等于500s^-1的流体条件下的血小板粘附聚集，因而能够适用于对应疾病的预防和治疗。即，rgt肽及其衍生物适用于预防冠状动脉、颈动脉以及大脑中动脉中产生血栓，或对冠状动脉、颈动脉以及大脑中动脉中已经导致微狭窄的血栓进行治疗(即防止血小板继续聚集而防止血栓进一步发展)，从而非常适合用于预防心脑血管疾病和治疗轻度心脑血管血栓。另外，由于rgt肽及其衍生物作用机制与血小板功能相关，因此在对这些对应疾病进行治疗方法开发或病理机制研究(例如研究病理过程中血小板功能的变化等)时，也可以利用上述的rgt肽及其衍生物。