含有Apelin-17的药物组合物及其用途的制作方法

本发明涉及含有apelin-17的药物组合物及其用途。apelin-17可以促进血小板聚集以及促进体外血栓形成；apj受体阻断剂f13a抑制apelin-17诱导的血小板聚集和体外血栓形成作用；并发现apelin-17具有协同血小板激活剂凝血酶诱导的血小板聚集。

背景技术

apelin是跨膜g蛋白偶联受体apj的内源性配体，在组织中广泛分布，心血管、肾脏、神经和大脑等系统中均有表达。apelin/apj系统具有增强心肌收缩力，降低血压，促进血管生长，调节胰岛素的分泌，垂体激素释放及体液平衡等多种生物学效应。apelin前体肽由77个氨基酸残基组成，随后被裂解为不同氨基酸长度的片段，包括：apelin-12、apelin-13、apelin-17和apelin-36等。

血小板作为血液中一种重要的成分参与出血凝血过程，在止血、伤口愈合及血栓形成等生理病理方面发挥作用。未活化的血小板呈双凸圆盘状，易受机械、化学刺激而活化。活化状态的血小板会伸出足突，并分泌相应的粘附蛋白，使血小板间相互粘附而发生聚集。血小板聚集是血栓及血栓性疾病形成的重要环节。当机体血管内皮发生损伤或者炎症时，血小板即活化发生聚集，进而启动凝血过程。多数血栓的形成都与血小板过度活化，发生不可逆的聚集作用引起。因此，研究引起血小板发生聚集的内源性因子，探索诱发血小板聚集所激活的受体或通道，将为开发抑制血小板聚集药物及寻找相应的作用靶点提供新的理论。

apelin/apj系统发挥相应功能的过程中，它可能对血小板聚集有影响的证据也逐渐显现出来。2005年学者报道[29,30]apelin具有增强心肌收缩力，扩张血管的作用，而心肌收缩力的增加及其血管舒张作用的发生与na+/h+和na+/ca2+交换体有关。2013年modgila等报道[32]apelin通过pi3k途径抑制了ca2+依赖性k+通道促进脑动脉平滑肌细胞收缩。血小板活化的标志和始动因素之一是血小板胞浆内ca2+浓度的升高。血小板内ca2+浓度增加可激活atp酶，引起atp的释放，为血小板提供能量，而促进血小板的活化。ca2+全程参与到血小板活化、粘附、聚集以及血栓形成过程中。

此外，本课题组前期研究发现，apelin通过14-3-3-erk1/2信号通路促进大鼠血管平滑肌细胞增殖。当血小板发生活化时，14-3-3像其他血小板分泌蛋白一样分泌到膜外，参与血栓的形成。组织因子(tissuefactor，tf)在血管壁的完整性遭到破坏时，通过激活凝固级联反应发挥止血作用。2015年cirillo等[37]报道在单核细胞向内皮细胞粘附过程中，apelin能够促凝因子tf的表达。这些报道预示着apelin具有血栓和血管功能的调节作用。而2007年kuba等[38]报道apelin敲除小鼠会导致压力超负荷诱导的心力衰竭，并且有尾部出血时间缩短和促血栓形成的风险。然而，近期adam等[39]又报道apelin-13抑制胶原和凝血酶诱导的血小板聚集，延长小鼠尾部出血的时间。这又表明apelin是一个抑制血小板聚集的因子。

目前关于apj配体亚型apelin-17的研究主要集中在血管新生、心肌收缩及血液动力学等方面，而apelin-17与血小板功能及血栓形成方面尚未有任何报道。本专利主要探讨了apelin-17与血小板聚集和血栓形成的功能研究。发现apelin-17可以通过激活apj受体来促进血小板聚集以及体外血栓形成。apj受体阻断剂f13a抑制apelin-17诱导的血小板聚集及体外血栓形成。

技术实现要素：

本发明提供一种治疗出血性疾病的药物组合物，它包含内源性配体apelin-17。

本发明还提供上述内源性配体apelin-17用于制备药物的用途，其中该药物用于治疗由血小板聚集障碍所引起的出血性疾病；或该药物预防血小板聚集或预防血栓形成。

本发明发现了上述内源性配体apelin-17的生理学功能，其可协同血小板激活剂凝血酶(thrombin)诱导的促血小板聚集以及血栓形成作用来治疗由血小板聚集障碍所引起的出血性疾病；或该其用于预防血小板聚集或预防血栓形成。

本发明发现了上述内源性配体apelin-17的生理学功能，可通过降解apelin-17或阻断其靶点apj来抑制血小板的聚集以及抗血栓形成。

本发明发现了apelin-17的促凝血生理学功能，能促进新西兰兔血小板聚集。

本发明发现了apelin-17的促凝血生理学功能，能促进新西兰兔体外血栓形成。

在本发明中，发明人发现了apelin-17的促新西兰兔血小板聚集和体外血栓形成作用靶向作用于apj受体。

本发明发现了apelin-17能协同凝血酶的促新西兰兔血小板聚集作用。

本发明发现了apelin-17能协同凝血酶的促新西兰兔体外血栓形成作用。

在体外试验中，浓度的梯度为0.001mol/l，0.01mol/l，0.1mol/l，1.0μmol/l，优选为1.0μmol/l。

本发明的有益技术效果

1.本发明的内源性配体apelin-17具有理想的促血小板聚集的作用，因此，可用于制备用于治疗出血性疾病的药物。

2.本发明的内源性配体apelin-17对血小板激活剂凝血酶(thrombin)诱导的促血小板聚集有协同作用，因此可用于治疗由血小板聚集障碍所引起的出血性疾病；或其用于预防血小板聚集或预防血栓形成。

附图说明：

图1为apelin-17促进血小板聚集；

图2为apj受体阻断剂f13a抑制apelin-17诱导的兔血小板聚集作用；

图3为apelin-17对血小板激活剂凝血酶(thrombin)诱导的促兔血小板聚

集有协同作用；

图4为apelin-17促进血栓形成；

图5为apj受体阻断剂f13a抑制apelin-17诱导的兔体外血栓形成作用。

具体实施方式

实施例1测定apelin-17对新西兰兔血小板聚集的影响

用血小板聚集凝血因子分析仪(lg-paber-i型，北京世帝科学仪器公司)测定血小板聚集率。本仪器采用光电比浊法测试血小板聚集：使用贫血小板血浆(plateletpoorplasma，ppp)作为基底，采用富含血小板血浆(plateletrichplasma，prp)进行测量。在磁力珠的搅拌下，在prp中加入诱导剂，血小板发生聚集，prp的透光度增高或浊度下降。将光浊度的变化转换为电讯号的变化，从而计算出血小板的聚集率。

聚集率＝(实测电压值-ppp光电电压值)/(prp光电电压值-ppp光电电压值)*100％

1.测定不同浓度(1*10-7-1*100μmol/l)的apelin-17对新西兰兔血小板聚集的影响

新西兰兔耳中动脉采血，用枸橼酸钠抗凝，然后离心，先用800r/min离心10min，取上清液得prp，再用3000r/min离心10min,取上清液得ppp。在测试杯中精确加入300μl的ppp，放入测试通道，按ppp键进行基底测量后取出。在另一测试杯中，精确加入300μl的prp，在37℃下预温1min后，使用加珠器在该测试杯中加入1粒测试珠，开始测试后，在三秒内分别加入不同浓度(0.001,0.01,0.1,1μmol/l)的apelin-17测试5min，记录血小板的最大聚集率(参见图1)。

2.测定apj受体阻断剂f13a对apelin-17诱导新西兰兔血小板聚集的作用

采集ppp，prp同上，将f13a加入prp中孵育5min，再放入已经调好基线的测试区中，加入测试珠，开始测试后，在三秒内加入apelin-17测试5min，记录血小板的最大聚集率，观察测试结果检测f13a对apelin-17促新西兰兔血小板聚集作用。以此判断apj受体介导apelin-17的促血小板聚集作用(参见图2)。

3.测定不同浓度apelin-17对凝血酶诱导的新西兰兔血小板聚集的协同作用

采集ppp，prp同上，将apelin-17加入prp中孵育5min，再放入已经调好基线的测试区中，加入测试珠，开始测试后，在三秒内加入凝血酶测试5min，记录血小板的最大聚集率，观察测试结果检测apelin-17对凝血酶诱导的新西兰兔血小板聚集的协同作用(参见图3)。

实施例2测量apelin-17对体外血栓形成的影响

用血栓检测仪(lmk-12型，郑州明举科技公司)建立体外血栓模型，本仪器用chandler法：将血液注入体外旋转圆环内，模拟体内血液流动状态以形成血栓。

1.测定不同浓度(1*10-7-1*100μmol/l)的apelin-17对体外血栓形成的影响

新西兰兔耳中动脉采血(不加任何抗凝剂，采用直取静脉血1ml，并注意应将注射器内的泡去除，用不同浓度apelin-17(0.001,0.01,0.1,1μmol/l)处理后，血样装灌圆环，慢慢的将1m1血样沿塑料环一端管壁注入管内，随时连接成圆环，安于相应的转盘内。放入中转速为20±2rpm，在37℃下，循环10min后，取出血栓，测量并记录血栓的湿重以及长度。将上述已称完湿重的血栓放入60℃±1℃的烘箱中烘干处理，30min后，将烘干的血栓再次称重，记录血栓干重(参见图4)。

2.测定apj受体阻断剂f13a对apelin-17诱导的新西兰兔体外血栓形成的作用

同样用chandler法构建体外血栓模型。将apelin-17与f13a一起加入1ml的新西兰兔血液中按照1中的测试方法，取出血栓病记录实验结果。并观察f13a(apj受体阻断剂)阻断apelin-17诱导新西兰兔血栓形成作用。以此判断apj受体介导apelin-17的促血栓形成作用(参见图5)。