一种从漆树皮中制备抑制恶性黑色素瘤提取物的方法与流程

本发明涉及属于医药技术领域，具体涉及一种从漆树皮中制备抑制恶性黑色素瘤提取物的方法。

背景技术

漆树是一种重要经济树种，原产中国，在中国的大部分地区均有分布.且在亚洲地区分布广泛。从其漆树皮层中割取的次生代谢产物生漆是一种优良的天然涂料，素有“涂料之王”的誉称，常用作名贵漆器的漆膜。药用价值是漆树的另一重要特征.民间本草书籍记载漆树的叶、花、根、皮、果实、干漆和木心均可人药，具有止咳、化瘀、通经、杀虫、消肿等功效。最近国内外研究发现。漆树籽加工的漆油和漆蜡具有延缓衰老、增强记忆力、降血糖等独特的食用保健功效，特别是漆树的漆树汁提取物含有丰富的黄酮类化合物，具有明确的抗肿瘤、抗炎等药理作用。但是，在医学、食品、生物等领域应用不足。植物提取物中含有生物碱、类黄酮、酚类、独特的氨基酸和多糖等化学物质具有一定的抑菌作用。植物提取物的抑菌活性作用明显，植物提取物具有无毒或低毒、广谱、对环境友好且成本低廉的优点，具有重要的研究价值。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种制备工艺简单、提取率高且提取物活性高的从漆树皮中制备抑制恶性黑色素瘤提取物的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种从漆树皮中制备抑制恶性黑色素瘤提取物的方法，包括以下步骤：

(1)将干燥后的漆树皮粉碎后与蒸馏水混合，加入纤维素酶进行酶解，得到酶解混合物；

(2)将酶解混合物进行灭酶处理后，置于亚临界萃取釜中，再加入乙醇和亚临界流体，在氮气保护下进行亚临界萃取，萃取后离心，收集上清液；

(3)对上清液进行蒸发脱溶处理，得到混合提取物；

(4)采用超滤膜对混合提取物进行超滤分离，收集超滤液；

(5)采用纳滤膜对超滤液进行过滤，以除去小分子物质，得到漆树汁提取物；

(6)采用大孔吸附树脂对漆树汁提取物中的黄酮化合物进行吸附，再使用乙醇溶液进行洗脱，减压蒸馏浓缩至无醇味，得到抑制恶性黑色素瘤提取物。

优选的，所述步骤(2)中，漆树皮、亚临界流体和乙醇的用量比为1g∶20～50ml∶20～50ml。

优选的，所述亚临界萃取压力为5mpa～10mpa，萃取温度为25℃～50℃。

优选的，所述亚临界流体为丙烷、丁烷、二甲醚、四氟乙烷中的一种或几种。

优选的，所述步骤(1)中，所述纤维素酶的酶活力为30000～60000u/g。所述酶解的温度为40℃～50℃，酶解时间为0.5h～1h。

优选的，所述灭酶处理具体为：将酶解混合液在75℃～85℃下处理25min～30min。所述纤维素酶的质量为漆树皮质量的0.5wt％～1.0wt％。

优选的，所述超滤膜的分子截留量为5000u～10000u，超滤的压力控制在0.25mpa～0.35mpa。

优选的，所述纳滤膜的直径为1～10nm。

优选的，所述步骤(6)中，所述大孔吸附树脂为d-101型，所述乙醇溶液的体积分数为65％～75％。

优选的，所述步骤(6)中，所述减压蒸馏的真空度0.04～0.06mpa，温度为43℃～48℃。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

本发明采用纤维素酶水解后乙醇和亚临界流体萃取法对漆树皮进行处理，纤维素酶能水解结构致密的漆树皮的植物细胞壁，为复合萃取做铺垫；萃取过程中，由于使用了乙醇和亚临界流体组成的混合溶剂，增加了漆树皮植物细胞中脂溶性成分和水溶性成分提取的选择性和效率；因而能全面地将漆树皮植物细胞中的抗微生物有效成分如生物碱、类黄酮、酚类、氨基酸和多糖等萃取出。再采用超滤膜去除蛋白质及胶体物质等杂质，接着经纳滤膜去除小分子物质，即可得到漆树皮抗微生物提取物。最后采用大孔吸附树脂将漆树皮抗微生物提取物中具有明确的抗肿瘤效果的黄酮类化合物吸附出来，再采用乙醇溶液洗脱，减压蒸馏浓缩至无醇味后即得到抑制恶性黑色素瘤提取物。

附图说明

图1为不同浓度的抑制恶性黑色素瘤提取物对小鼠b16黑色素瘤细胞的增殖影响对照图。

图2为不同浓度的抑制恶性黑色素瘤提取物对小鼠b16黑色素瘤细胞内黑色素含量的影响对照图。

图3为不同浓度的抑制恶性黑色素瘤提取物对小鼠b16黑色素瘤细胞酶氨酸酶话性抑制作用对照图。

具体实施方式

以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

实施例：

1、一种从漆树皮中制备抑制恶性黑色素瘤提取物的方法，包括以下步骤：

1)将干燥后的漆树皮粉碎后与蒸馏水混合，加入酶活力为50000u/g、质量为漆树皮质量的0.8wt％的纤维素酶进行酶解，酶解温度为40℃，酶解时间为1h，得到酶解混合物；

(2)将酶解混合物在80℃下灭酶处理25min后，置于亚临界萃取釜中，再加入乙醇和丙烷，漆树皮、丙烷和乙醇的用量比为1g∶30ml∶30ml，在氮气保护、80mpa，25℃下进行亚临界萃取1h，萃取后离心，收集上清液；

(3)对上清液进行蒸发脱溶处理，得到混合提取物；

(4)采用分子截留量为8000u的超滤膜对混合提取物进行超滤分离，超滤的压力控制在0.25mpa，收集超滤液；

(5)采用直径为5nm的纳滤膜对超滤液进行过滤，以除去小分子物质，得到漆树汁提取物；

(6)采用d-101型大孔吸附树脂对漆树汁提取物中的黄酮化合物进行吸附，再使用体积分数为65％的乙醇溶液进行洗脱，在真空度为0.05mpa，温度为45℃减压蒸馏浓缩至无醇味，得到抑制恶性黑色素瘤提取物。

2、本实施例制得的抑制恶性黑色素瘤提取物的体外抗癌实验

2.1细胞株，试剂以及仪器

小鼠b16黑色素瘤细胞，dmem培养基(美国gibico公司)，胎牛血清(天津市灏阳生物制品科技有限公司)，胰蛋白酶(美国sigma公司)，dmso(分析纯，amresco)，青霉素(sigma)，链霉素(sigma)，96孔板，co2培养箱(日本sanyo公司)，96孔板酶标仪bio-rad680(美国bio-rad公司)，生物操作台(吴江市绿岛净化设备厂)。

2.2细胞培养方法

小鼠b16黑色素瘤细胞用含10％的胎牛血清，100u/ml青霉素，100μg/ml链霉素的dmem培养液于37℃，5％co2：的培养箱中培养；当细胞生长至对数期时，用胰蛋白酶消化细胞，洗涤吹散细胞，以每孔1×10⁴个细胞100μl接种于96孔板，以备实验。

2.3酪氨酸酶活性的测定

将处于对数生长期的小鼠b16黑色素瘤细胞，铺板于96孔板培养30min。以不同浓度(10-300μg/ml)的抑制恶性黑色素瘤提取物孵育细胞48小时后弃培养液，用pbs洗涤2次，每孔加入1％(体积分数)tritonx-100溶液90μl，迅速置-80℃冻存30min，随后室温融化使细胞完全裂解，37℃预温后加入10g/l多巴溶液100μl，37℃反应0.5h，490nm处测定吸光度值。每一浓度设4个复孔，取平均值。

2.4黑色素含量测定：

选择对数生长期的小鼠b16黑色素瘤细胞，铺板于96孔板培养30min，以不同浓度(10-300μg/ml)的抑制恶性黑色素瘤提取物孵育细胞4d后培养4d后，用2.5g/l胰蛋白酶消化6-8min，将细胞收集入离心管离心10min，倾去上清液，再用pbs洗2次后，用1mol/l氢氧化钠0.5ml在37℃作用48h，充分裂解细胞和溶解黑色素颗粒，每孔加入100μl，405nm处测定吸光度值。每一质量浓度设4个复孔，取平均值。

实验表明：如图1-3所示，抑制恶性黑色素瘤提取物既具有抑制b16黑色素瘤细胞的增殖作用，也抑制了酪氨酸酶的分泌和黑色素的合成，并且呈现剂量依赖性。证明从漆树中提取的抑制恶性黑色素瘤提取物具有较好的抑制抗黑色素瘤作用。

以上所述，仅是本申请的较佳实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。