预防、减少和/或缓解非酒精性脂肪肝炎的组合物及其应用的制作方法

本发明属于涉及一种预防、减少和/或缓解非酒精性脂肪肝炎的组合物及其应用。

背景技术

非酒精脂肪性肝炎(nonalcoholicsteatosisheptitis,nash)是一种无过量饮酒，以肝脏细胞脂肪变性、气球样变、弥散性肝小叶炎症为主要临床病理特征的综合征。它属于非酒精脂肪性肝病(nonalcoholicfattyliverdisease,nafld)，是一种潜在的致命性疾病，可导致肝硬化和肝癌。nash的确切发病原因尚未阐明，但是研究表明，nash的发病与胰岛素抵抗、肥胖、高血脂和代谢综合征等密切相关。随着这类疾病发病率的增加，nash患病率也在逐渐升高。目前临床试验的治疗方法，多数治疗的效果不显著。对nash的药物治疗，至今没有循证医学证据。因此探索新型安全有效的药物组合物对其临床治疗改善具有重要意义。

β-葡聚糖是一种广泛存在于多种真菌与植物中的多糖，具有降血脂血糖、保护肝脏和调节免疫力等多种功效，被认定是一种安全的活性物质。7-苄基-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-5-甲基-4,7-二氢四唑-[1,5-a]嘧啶-6-甲酸乙酯是一种嘧啶衍生物。中国发明专利(201810431586.5)记载了该化合物对蛋氨酸-胆碱缺乏饲料诱导的非酒精性脂肪肝病变的防治作用，尤其是对肝细胞受损(如气球状变性,ballooning)有显着的防治作用。化迄今为止，该嘧啶衍生物和β-葡聚糖协同防治非酒精性脂肪肝的作用未见报道。

技术实现要素：

本发明提出一种预防、减少和/或缓解非酒精性脂肪肝炎的组合物，该组合物联合使用在治疗非酒精性脂肪肝炎疾病方面展现协同效果。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种预防、减少和/或缓解非酒精性脂肪肝炎的组合物，包括β-葡聚糖与嘧啶衍生物。

优选地，所述嘧啶衍生物为7-苄基-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-5-甲基-4,7-二氢四唑-[1,5-a]嘧啶-6-甲酸乙酯。

优选地，所述7-苄基-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-5-甲基-4,7-二氢四唑-[1,5-a]嘧啶-6-甲酸乙酯与所述β-葡聚糖的质量之比为3～5:2～4。

优选地，所述7-苄基-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-5-甲基-4,7-二氢四唑-[1,5-a]嘧啶-6-甲酸乙酯与所述β-葡聚糖的质量之比为4:3。

本发明的另一个目的是提供β-葡聚糖与嘧啶衍生物组成的药物组合物在预防、减少和/或缓解非酒精性脂肪肝炎的组合物中的应用。

优选地，所述嘧啶衍生物为7-苄基-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-5-甲基-4,7-二氢四唑-[1,5-a]嘧啶-6-甲酸乙酯。

优选地，所述7-苄基-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-5-甲基-4,7-二氢四唑-[1,5-a]嘧啶-6-甲酸乙酯与所述β-葡聚糖的质量之比为3～5:2～4。

优选地，所述7-苄基-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-5-甲基-4,7-二氢四唑-[1,5-a]嘧啶-6-甲酸乙酯与所述β-葡聚糖的质量之比为4:3。

为了简便起见，将7-苄基-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-5-甲基-4,7-二氢四唑-[1,5-a]嘧啶-6-甲酸乙酯命名为zy003，以下内容均以zy003来代表7-苄基-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-5-甲基-4,7-二氢四唑-[1,5-a]嘧啶-6-甲酸乙酯。

本发明的有益效果：

本发明以β-葡聚糖和zy003的组合物为材料，研究其对非酒精性脂肪肝炎模型小鼠的预防与改善作用。将50只c57bl/6雄性小鼠在饲养环境中适应性饲养1周后，按体重随机分成对照组、模型组(mcd组)、zy003组、β-葡聚糖组和zy003+β-葡聚糖组。采用蛋氨酸-胆碱缺乏(mcd)饲料建立小鼠nash模型。正常组饲喂蛋氨酸-胆碱充足(mcs)饲料，其余各组饲喂mcd饲料。定期观察并记录小鼠日常状况，每日定时分别腹腔注射药物溶剂、40mg/kgzy003、30mg/kgβ-葡聚糖，40mg/kgzy003+30mg/kgβ-葡聚糖。饲养8周后处死小鼠，收集血液和肝脏标本。采用he和油红染色法观察肝脏的病变情况并测定血清tnf-α的水平。饲料饲喂后引起小鼠肝脏脂肪性变，zy003和β-葡聚糖联合处理由mcd饲料诱导的nash模型小鼠8周后，与模型组(mcd组)和单一药物处理组(zy003或β-葡聚糖)相比，显著降低肝脏的脂肪变性和气球样病变程度。实验结果证明，β-葡聚糖和zy003的联合使用在治疗非酒精性脂肪肝炎疾病方面展现协同效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明化合物zy003的化学式；

图2为本发明的实施例所提供的各组小鼠肝脏he染色(400×)和油红染色显微镜图(200×)。

图3本发明的实施例所提供的各组小鼠肝组织炎症、脂肪变性、细胞气球样变和综合的病理评分。

图4本发明的实施例所提供的各组小鼠血清tnf-α表达水平。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的7-苄基-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-5-甲基-4,7-二氢四唑-[1,5-a]嘧啶-6-甲酸乙酯，具有如图1的结构。

本发明的预防、减少和/或缓解非酒精性脂肪肝炎的组合物和使用方法：

本方法提供的化合物可以用本领域药学化合物已知的方法配制成组合物，并且这些组合物可以包含一种或多种甜味化合物、着色化合物、防腐化合物和调味化合物以提供药学上合适的制剂。

例如可以使用片剂、丸剂、硬明胶胶囊、粉末或颗粒作为口服固体组合物。在这些组合物中，混合有无毒性的药物中可接受的适用的赋形剂或稀释剂如蔗糖、淀粉或乳糖。这些组合物可以包含稀释剂以外的物质如润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石粉或硬脂肪酸。

例如可以使用包含惰性稀释剂的药物中可接受的溶液、乳液、糖浆、悬浮液和酏剂如水或液体石蜡作为供口服施用的液体组合物。这些组合物也可以包含稀释剂以外的调味剂、润滑剂或甜味剂。

本发明的活性化合物zy003与β-葡聚糖可以直肠给药的栓剂或胶囊形式给药，混合适当的非刺激性赋形剂如可可豆脂、聚乙二醇或半合成的甘油酯。

本发明的zy003与β-葡聚糖组合物的适用剂型包括但不限于：片剂；囊片；胶囊例如软弹性明胶胶囊；扁囊剂；糖锭；锭剂；分散剂；栓剂；油膏；糊剂(敷剂)；软膏；粉末；敷料剂；乳膏；膏药；溶液；贴片；气溶胶；凝胶；适合对个体口服或粘膜施用的液体剂型，包括悬浮液(例如水或非水液体的悬浮液、水包油乳液、或油包水液体乳剂)、溶液和酏剂；适合对个体肠胃外施用的液体剂型；和无菌固体(例如结晶或无定形固体)，它们可以被重配，以提供适合对个体肠胃外施用的液体剂型。

本发明的zy003与β-葡聚糖组合物的施用途径包括但不限于肠胃外施用，例如，静脉内、皮内、皮下、肌肉内、皮下、口服、口颊、舌下、吸入、鼻内、透皮、表面、透黏膜、肿瘤内、滑膜内和直肠施用。在具体的实施方案中，组合物依照常规过程配制为适合对人静脉内、皮下、肌肉内、口服、鼻内或表面施用的药物组合物。在实施方案中，药物组合物依照常规过程配制用于对人皮下施用。

本发明的zy003与β-葡聚糖组合物可用于治疗非酒精性脂肪肝炎，缓解脂肪变性、肝小叶炎症和肝组织气球样变。

实施例

1材料与方法

1.1材料

饲料：蛋氨酸-胆碱缺乏(mcd)饲料(货号：tp3006r)和蛋氨酸-胆碱充足(mcs)饲料(货号：tp3006s2)购于南通特洛菲饲料科技有限公司。

检测试剂：检测tnf-α的elisa试剂盒，购于美国bd公司。

实验动物：c57bl/6雄性小鼠7-8周龄，体重(23±2)g，spf级，购于广东省医学实验动物中心，屏障环境动物房，相对湿度30％-60％，12h光照/12h黑暗，动物自由采食和饮水。

1.2方法

动物分组及干预方法：将50只c57bl/6雄性小鼠在饲养环境中适应性饲养1周后，按体重随机分成对照组(mcs组)、模型组(mcd组)、zy003组、β-葡聚糖组和zy003+β-葡聚糖组。适应性喂食一周后，采用mcd饲料建立小鼠nash模型。正常组饲喂mcs饲料，其余各组饲喂mcd饲料。定期观察并记录小鼠日常状况，每日定时分别腹腔注射药物溶剂、40mg/kgzy003、30mg/kgβ-葡聚糖，40mg/kgzy003+30mg/kgβ-葡聚糖。

样品收集与指标检测：每周称重，饲养8周后的小鼠，禁食12h，用水合氯醛腹腔注射麻醉动物，采血液，4℃冰箱静置过夜后，于4℃离心机1000g离心10min，收集上清，使用小鼠血清elisa试剂盒说明书测定血清tnf-α。

取肝组织50mg置于4％多聚甲醛中，固定24h，然后脱水12h，包埋，切片，he染色后进行肝组织光镜病理学检测和等级评分。nash的病理评分标准根据nash病理诊断标准采用美国国立卫生研究院nash临床研究网络病理委员会2005年制定的nafld活动度积分指南进行评价。

对脂肪变性、肝小叶炎症、细胞气球样变和综合病理进行评分。(1)对于肝脂肪变性(steatosis)，小于5％的肝脂肪变性，为0分；5％～33％，1分；33％-66％，2分；超过66％，3分。(2)对于肝小叶炎症(lobularinflammation,随机计数20个视野)，无炎症，0分；<2个，1分；2-4个，2分；>4个，3分。(3)肝细胞气球样变(ballooning),无，0分；少见，1分；2分，多见。将肝脂肪变性、肝小叶炎症和肝细胞气球样变的评分相加，得到综合得分(totalscore)。

2结果

病理学检查

图2是小鼠肝脏he染色(400×)及油红染色显微镜图(200×)，其中mcs组肝小叶结构清晰、完整，肝细胞以中央静脉为中心，呈放射状排列，无肝细胞气球样变，无明显大脂滴。mcd组的病变程度严重，肝小叶结构异常，肝脏内细胞大小不一，肝细胞内的脂质被酒精和二甲苯溶解后脱去后形成多数的空泡，红色脂滴大而密集，大量炎症细胞浸润。与mcd组相比，zy003处理组的小鼠肝脏病变程度较轻，肝细胞内出现少量空泡，脂滴减少，肝小叶结构趋于正常；β-葡聚糖处理组小鼠肝组织内空泡明显减少，肝小叶结构较基本正常，肝血窦较明显；zy003+β-葡聚糖处理组组肝细胞内空泡显著减少，肝小叶结构恢复正常，肝索结构基本正常呈放射状，脂滴大量减少，肝血窦明显。

病理学评分

图3是小鼠肝脏病理切片活动度积分评价，其中肝小叶内炎症评分mcd组显著高于mcs组小鼠(p<0.05)。与mcd组相比，zy003组、β-葡聚糖组和zy003+β-葡聚糖组小鼠肝小叶内炎症评分显著降低(p<0.05)。

脂肪变性评分mcd组显著高于mcs组小鼠(p<0.05)；与mcd组相比，zy003+β-葡聚糖组小鼠脂肪变性评分显著降低(p<0.05)。

细胞气球样变评分mcd组显著高于mcs组小鼠(p<0.05)，与β-葡聚糖组相比，zy003+β-葡聚糖组小鼠细胞气球样变评分显著降低(p<0.05)。

mcd组的综合评分显著高于mcs组小鼠(p<0.05)。与mcd组相比，zy003组、β-葡聚糖组和zy003+β-葡聚糖组小鼠肝小叶内炎症评分显著降低(p<0.05)。与zy003组或β-葡聚糖组相比，zy003+β-葡聚糖组小鼠综合得分显著降低(p<0.05)。以上研究结果表明，zy003化合物联合β-葡聚糖具有协同防治nash的作用。

zy003对小鼠血清中tnf-α含量的影响

mcd组小鼠血清tnf-α含量显著高于mcs组小鼠(p<0.05)。与mcd组相比，zy003组、β-葡聚糖组和zy003+β-葡聚糖组小鼠血清tnf-α含量显著降低(p<0.05)。与zy003组或β-葡聚糖组相比，zy003+β-葡聚糖组小鼠血清tnf-α含量显著降低(p<0.05)。zy003和β-葡聚糖的组合物，对nash的防治作用，可能与减少血清中tnf-α的水平有关。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。