氧化石墨烯在制备树突状细胞功能促进剂中的应用的制作方法

本发明涉及纳米生物
技术领域：
，特别是涉及氧化石墨烯在制备树突状细胞，尤其是过继性树突状细胞、过继性树突状细胞疫苗功能促进剂中的应用。
背景技术：
树突状细胞(dendriticcells,dcs)是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁，并且是唯一可以激活幼稚t细胞(naivetcells)的一类抗原递呈细胞(antigenpresentingcells,apcs)。树突状细胞可以调动多种免疫抵抗机制，例如细胞毒t细胞、cd4+辅助t细胞、自然杀伤(nk)细胞以及自然杀伤t(nkt)细胞等。这些树突状细胞都具有识别和杀死患病细胞、以及释放保护性细胞因子(例如ifn-γ,tnf-α)的作用。在生理状态下dcs发挥抗原递呈作用需要经历两个至关重要的过程：1)对入侵病毒或细菌进行识别、吞噬及抗原处理和递呈及成熟状态转变，即趋化因子表达谱的转换及表面共刺激分子的上调表达；2)dcs离开外周组织向淋巴组织归巢，且为t细胞的激活提供第二信号。未成熟dc接受病原体相关分子模式(pamps)或危险信号刺激后上调趋化因子受体7(ccr7)表达，获得淋巴细胞归巢能力，一旦到达淋巴结t细胞区，成熟dc在表达于cd4+t细胞表面的cd40l的刺激下被“批准”激活。cd40信号刺激，上调dc表面共刺激分子，使dc获得最佳激活cd8+t细胞的能力。基于dcs的免疫治疗(dcs-basedimmunotherapy)，也被称为dcs疫苗，是指针对肿瘤和慢性感染性病人的免疫低下和紊乱的特点，利用生物学手段在体外对dcs进行诱导培养、抗原负载和刺激成熟，然后回输入患者体内，以达到调正免疫秩序并激活抗原特异性t细胞反应的目的。dcs疫苗往往用于患者放、化疗或造血干细胞移植、器官移植后的辅助治疗上；通过复杂的离体培养和细胞工程方法，在体外对原代细胞进行培养增殖，并将功能化的免疫细胞回输到患者体内的过程称为“过继性”，回输到患者体内的功能化dcs被称为过继性树突状细胞(简称“过继性dc”)。因此，过继性树突状细胞输注作为日趋成熟的免疫疗法在肿瘤和慢性感染性疾病的防治中将发挥越来越大的作用。过继性dc的激活和向t细胞富集区的归巢是影响dcs功能化的关键因素。dcs激活后往往上调表达其表面多种共刺激分子(如cd40,cd80,cd86等)和分泌th1类细胞因子(il-1β，tnf-α，il-6等)来诱导t细胞免疫激活，而未成熟的过继性dc不仅不能活化t细胞,反而会使t细胞功能失活,诱导t细胞耐受。目前，经fda认证的细胞因子鸡尾酒(cytokinecocktail，il-1β、tnf-α、il-6、pge2)和改良细胞因子鸡尾酒(il-1β、tnf-α、il-6、polyi：c、cpgodn)是刺激过继性dc成熟最常用的促进剂。该促进剂能够一定程度提高过继性dc的成熟度，包括共刺激分子的上调表达和某些促炎因子的分泌。但是，该促进剂最大的缺陷是不能有效地促进过继性dc向淋巴组织归巢和迁移，大量的文献(如o’neilld.w.et.al.blood2004,104,2235-2246)证明仅有不到5％cytokine-cocktail负载dcs可经淋巴引流归巢至邻近淋巴结，这也是近几年过继性dc治疗在临床上响应率低下(10–15％)的重要原因之一。除此之外，细胞因子鸡尾酒也存在制备和生产纯化工艺复杂，成本高昂等问题。因此，开发有效的促进剂，最大程度地提高过继性dc激活的成熟程度，促进其在体迁移能力从而更多地递呈抗原给t细胞以诱发机体免疫应答，是提高其临床疗效的关键。技术实现要素：本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，提供氧化石墨烯的一种新用途，即氧化石墨烯在制备树突状细胞功能促进剂中的应用，所述树突状细胞功能为树突状细胞成熟度和/或迁移能力。所述氧化石墨烯具有微观片层结构，纯度不小于99％。所述氧化石墨烯的片径尺寸为50-1500nm，优选50-500nm，更优选50-200nm。所述氧化石墨烯的片层厚度约为0.8-1.2nm。所述树突状细胞功能促进剂是通过超声将氧化石墨烯分散在溶剂或培养基中得到。所述氧化石墨烯是由石墨烯经强氧化剂(如高锰酸钾)氧化处理得到的具有微观片层结构的二维纳米材料。所述氧化石墨烯的制备过程如下：鳞状石墨、nano3和浓h2so4混合后在冰浴中搅拌，加入kmno4后35℃搅拌2h，再缓慢升温至60℃搅拌2h，然后加入200ml水中，80-90℃下搅拌5h，加入30wt％的h2o2水溶液至无气泡产生，趁热过滤后，先用5wt％的稀盐酸清洗滤饼，然后用去离子水洗涤，直至滤液呈中性且无so42-，将滤饼冷冻干燥，得到单层氧化石墨烯。进一步将具有微观片层结构的氧化石墨烯或单层氧化石墨烯进行研磨得到氧化石墨烯粉末；再将氧化石墨烯粉末分散在去离子水中经超声处理。所述树突状细胞为未成熟树突状细胞；当所述未成熟树突状细胞为骨髓来源时，以其表面特异性表达的cd11c阳性率评价，其纯度应达到65％以上。将所述氧化石墨烯与未成熟树突状细胞共孵育以促进所述树突状细胞成熟度和/或迁移，共孵育体系中氧化石墨烯终浓度为3.9-62.5μg/ml，优选7.8-31.2μg/ml，最优选7.8-15.6μg/ml。与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了一种用于树突状细胞过继性治疗的促进剂——氧化石墨烯(grapheneoxide,go)，其作为促进剂在输注前可提升过继性树突状细胞的成熟度和输注后迁移能力，且无明显毒副作用。本发明利用氧化石墨烯纳米材料良好的生物相容性及片径尺寸可调等特性，将其用做促进剂能大大提高过继性dc疫苗的局部或静脉输注下的淋巴器官归巢速率和归巢效率，为树突状细胞疫苗的临床转化提供了新的选择和路径。本发明提出的氧化石墨烯材料的新用途采用体外筛选和评价的方式证明了其对dcs体外刺激和功能化的效果，因此，在临床使用上可获得更好的预期。附图说明图1所示为不同片径尺寸的氧化石墨烯的表征结果：其中a幅为透射电镜照片，b幅为动态光散射曲线图，c幅为原子力显微镜照片；图2所示为树突状细胞经诱导培养不同时间的imdcs形态变化照片；图3所示为不同片径尺寸的氧化石墨烯处理后imdcs细胞存活率图(流式图中横坐标表示fitc标记的annexinv)；图4中a幅为不同片径尺寸的氧化石墨烯被dcs吞噬后的透射电镜照片，b幅为不同片径尺寸的氧化石墨烯被dcs吞噬后的瑞士-吉姆萨染色照片；图5所示为不同片径尺寸的氧化石墨烯与dcs作用后dcs趋化因子受体表达水平图(注：流式图的横坐标表示荧光分子及其标记的树突状细胞表面分子；*与ctrl-dcs组比较，#与s-dcs组比较，&与m-dcs组比较，p＜0.05)；图6所示为不同片径尺寸的氧化石墨烯与dcs作用后体系中炎性细胞因子1l-6分泌水平柱状图(*与ctrl-dcs组比较，#与s-dcs组比较，p＜0.05)；图7所示为不同片径尺寸的氧化石墨烯与dcs作用后dcs表面趋化因子受体ccr7表达水平；图8所示为不同片径尺寸的氧化石墨烯处理后dcs经脚垫输注后迁移能力的比较：其中a幅为脚垫输注带有萤火虫荧光素酶报告基因的imdcs后发光部位的注释图；b幅为dcs的动态迁移过照片；c幅为dcs迁移至pln百分比的柱状图(*与ctrl-dcs组比较，#与s-dcs组比较，p＜0.05)。具体实施方式石墨烯是一种具有独特优良电学、光学和力学性质的二维碳纳米材料，在电子器件、生物化学传感及材料科学领域具有广泛的应用前景。氧化石墨烯(grapheneoxide,go)是石墨烯经强氧化剂处理所得的衍生物，经过氧化处理后，氧化石墨烯仍保持石墨烯的层状结构，但在每一层的石墨烯单片上引入了许多含氧功能团，除了合成工艺相对简单，成本低廉外，还兼具较强的亲水性、表面高度拉曼散射能力、较高表面功能可塑性等特性。因此，氧化石墨烯成为肿瘤治疗及生物传感器等应用研究的热点生物材料。然而，氧化石墨烯对树突状细胞的表型和功能会产生影响并未有人报道，更没有氧化石墨烯会促进imdcs的成熟和活化的报道。本发明提出了氧化石墨烯的一种新用途——用作树突状细胞过继性治疗的促进剂，并通过体外及动物体内实验证明，氧化石墨烯处理后的未成熟树突状细胞(immaturedendriticcells,imdcs)，其表面共刺激分子cd40、cd80和cd86表达均上调，炎性细胞因子il-6分泌明显上调，ccr7表达显著上调；共聚焦显微镜下观察到经氧化石墨烯处理后，dcs微丝、微管重排及黏附现象明显；上述现象产生的机制应与共孵育体系中活性氧(reactiveoxygenspecies,ros)的产生有关；go处理后dcs自脚垫迁移至腘窝淋巴结的速度提升约1.5-3倍，过继性dc疫苗在动物体内归巢效率可由传统过继性dc疫苗的不到5％有效提升至24％。此外，由相关实验推知：相比于其他采用纳米材料作为促进剂或者免疫功能调节剂直接免疫的纳米疫苗，由于只有树突状细胞中吞噬或黏附的少量氧化石墨烯纳米颗粒(通常小于孵育量的10％)会进入到模型动物或人体内，因此与其他疫苗佐剂相比，本发明的促进剂具有更好的生物安全性，增加了该产品向临床推广及应用的可能性。以下结合具体实施例，更具体地说明本发明的内容，并对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明进行限制。实施例中所用到的生物及纳米材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物及纳米材料都可以按照实施例中的提示替换使用。任何在相关领域具备经验的人，都可以按照本发明的原理，利用其它氧化石墨烯，如多层氧化石墨烯、其他片径尺寸的单层氧化石墨烯或上述的混合物，以及经其他试剂或分子修饰后的氧化石墨烯基材料等实现本发明所描述的“氧化石墨烯”提高过继性树突状细胞成熟度和迁移能力中的应用。另外，本发明中所说的树突状细胞，也不局限与小鼠骨髓来源的树突状细胞，其他来源(人或其他动物)的树突状细胞也包含在内，这些并不脱离本发明描述的基本概念。因此，这些修改或不同的应用都在本发明的保护范围之内。所用方法如无特别说明均为常规方法。如无特别说明，各实施例中相同名称的材料或试剂内容相同。实施例一、不同片径尺寸单层氧化石墨烯(grapheneoxide,go)的制备用于本发明中的氧化石墨烯可参照已有技术制备得到。可为由石墨烯经强氧化剂(如高锰酸钾)氧化处理得到的片层结构的二维纳米材料，或采用浓硫酸中的高锰酸钾与石墨粉末经氧化反应之后，得到棕色的在边缘有衍生羧基及在平面上主要为酚羟基和环氧基团的石墨薄片，此石墨薄片层可以经超声或高剪切剧烈搅拌剥离为氧化石墨烯，并在水中形成稳定、浅棕黄色的单层氧化石墨烯悬浮液。以下以具体实例说明如何获得不同片径尺寸的氧化石墨烯：1g鳞状石墨，1gnano3，46ml浓h2so4混合后在冰浴中搅拌30分钟，缓慢加入4.0-6.0gkmno4，1h后将反应体系转至油浴中35℃搅拌2h，再缓慢升温至60℃搅拌2h。将反应体系加至200ml水中，80-90℃下搅拌5h，加入30wt％h2o2水溶液至反应体系中无气泡产生。此时溶液由黄色变成棕色，趁热过滤，先用5wt％的稀盐酸清洗滤饼，然后用去离子水洗涤，直至滤液呈中性并无so42-(可用bacl2检测)。将滤饼冷冻干燥后，即得到单层氧化石墨烯。将制得的单层氧化石墨烯研磨成粉末并分散在去离子水中，经300w超声处理，根据处理时间长短即可得到不同片径尺寸的氧化石墨烯，如超声处理2小时可得到片径尺寸约为50-200nm的氧化石墨烯，超声处理10小时可得到片径尺寸约为200nm-500nm的氧化石墨烯，超声处理18小时可得到片径尺寸约为500-1500nm的氧化石墨烯。用透射电子显微镜(tem)、动态光散射仪(dls)、原子力电镜(afm)和zeta电位测定仪对以上方法得到的三级片径尺寸的go进行表征，结果见图1。透射电镜结果如图1中a幅所示，从中可以看出三级片径的go尺寸差异明显，在水溶液中分散均匀，均为不规则多边形状。dls结果如图1中b幅所示，从中可以看出三级氧化石墨烯的平均片径分别为103.1nm(s-go)，362.5nm(m-go)，1192.1nm(l-go)。(注：在实施例中，采用s-go、m-go、l-go处理的dcs组分别标记为s-dcs、m-dcs、l-dcs；对照dcs组标记为ctrl-dcs。)afm表征结果如图1中c幅所示，从中可以看出三级片径尺寸的go平均厚度均为1-2nm，符合单层go结构特征。表1不同片径尺寸的go的zeta电位表征结果命名s-gom-gol-go流体力学半径(nm)103.1362.51192.1zeta电位(mv)-32.76±1.19-31.58±1.34-30.74±0.82zeta电位表征结果见表1，可见三种片径尺寸的go在水溶液中的zeta电位绝对值均大于30mv，说明上述方法得到的go胶体稳定性较好。实施例二、小鼠骨髓来源未成熟树突状细胞的培养与鉴定1、小鼠骨髓来源未成熟树突状细胞的培养与诱导分化颈椎脱臼处死l2g85.c57bl/6j小鼠(6-8周)，浸泡在75％(v/v)酒精中后置于超净工作台内分离其股骨和胫骨，浸泡于pbs中，以无菌剪刀和镊子去掉肌肉和骨骺，用2ml注射器针头吹出骨髓腔中的骨髓，吸取1640培养基反复冲洗骨髓腔，直到骨髓腔变白为止。用注射器轻轻将骨髓细胞吹散，并用40μm的过滤器过滤至离心管中。将分散的骨髓细胞以2×106cells/ml培养于6孔板中，每孔加入1640完全培养基(含10wt％胎牛血清、5ng/mlil-4、10ng/mlgm-csf)。培养第三天时半量换液，将一半旧的培养基用等量新的1640完全培养基代替；第5天时半量换液，将一半旧的培养基用等量新的1640完全培养基代替。然后在37℃、5％co2细胞培养箱中培养。培养第6天收集细胞即为骨髓来源未成熟的树突状细胞。2、小鼠骨髓来源未成熟树突状细胞的鉴定倒置相差显微镜下观察未成熟树突状细胞(imdcs)的形态，结果见图2：在培养第一天，imdcs的骨髓前体细胞为小而圆的细胞，细胞膜光滑、无突起。第3天半量换液时可见多数为贴壁细胞，有少量小的半悬浮细胞集落。第5天半量换液时可见细胞集落增大、增多，多数悬浮生长，细胞体积增大，表面有毛刺状突起。由于小鼠骨髓来源的imdc特异性表达cd11c，以cd11c阳性率评价dc的纯度。在imdc培养的第6天，培养细胞中imdc纯度可达到65％以上，说明诱导成功，进行下一步试验。实施例三、氧化石墨烯的效果实验本实施例中使用的氧化石墨烯go和未成熟树突状细胞imdcs的获得参见实施例一和实施例二。1、共孵育体系中氧化石墨烯对树突状细胞存活率的影响分别将浓度为7.8μg/ml、15.6μg/ml、31.2μg/ml、62.5μg/ml的s-go(50-200nm)、m-go(200-500nm)、l-go(500-1500nm)三级片径go水溶液加入实施例二含有诱导成功的imdcs的培养基中共孵育(共孵育即为将外加物质(如氧化石墨烯等)加入含有imdcs的培养基中一同孵育的过程，共孵育体系即为含有外加物质和imdcs的培养基体系)48h后(分别为s-dcs组、m-dcs组和l-dcs组)，用流式细胞术检测共孵育体系中的细胞存活率，结果如图3所示。由图中结果可以看出，与对照组imdcs(ctrl-dcs组)比较，7.8μg/ml浓度go处理的s-dcs组、m-dcs组和l-dcs组细胞存活率分别为(93.29±0.99)％、(93.29±0.99)％、(91.89±2.97)％，15.6μg/ml浓度处理后的细胞存活率分别为(91.65±1.65)％、(91.56±1.60)％、(91.89±1.32)％，31.2μg/ml浓度处理后的细胞存活率分别为(83.71±1.66)％、(83.62±1.65)％、(83.48±1.98)％，62.5μg/ml浓度处理后的细胞存活率分别为(78.93±0.33)％、(78.72±0.29)％、(76.88±3.22)％。因为7.8μg/ml、15.6μg/ml浓度下s-dcs组、m-dcs组和l-dcs组的细胞存活率均高于90％，为获得更好的促进效果，优选15.6μg/ml为实施例中go的工作浓度。本实验存活率还表明使用氧化石墨烯go对树突状细胞无明显毒副作用。2、树突状细胞对氧化石墨烯的吞噬结合实验1，采用透射电子显微镜和瑞士-吉姆萨染色观察不同片径go被dcs摄取的情况，从而比较三种片径的氧化石墨烯(s-go(50-200nm)、m-go(200-500nm)、l-go(500-1500nm))内吞模式的差异，结果如图4所示。图4中的a幅(第二排为第一排图片中方框部分的放大图)可以看出，在透镜下观察到呈丝状的s-go和m-go被包裹在dcs内囊泡中，s-go游移至近核的区域，而l-go呈条束状游离于dcs细胞膜外。透镜观察到的树突状细胞中氧化石墨烯尺寸与使用前单独go材料的尺寸相符，说明go未在培养基或细胞质中降解，以原有状态被树突状细胞吞噬。图4中的b幅通过瑞士-吉姆萨染色也观察到摄取了不同片径go后的dcs，直观地看到dcs对不同片径go的吞噬，而这种吞噬发生后，go以团簇的形式(图中箭头所指)在细胞质中富集分析正是这种吞噬行为的发生促进了dcs的成熟，进而促进了其在体内的迁移能力。本实验证明了树突状细胞对氧化石墨烯的吞噬能力，基于实验1对孵育48h后孵育体系中氧化石墨烯浓度的计算，粗略获知树突状细胞中吞噬的氧化石墨烯纳米颗粒的量小于氧化石墨烯用量(孵育量)的10％。3、与氧化石墨烯共孵育后树突状细胞共刺激分子表达水平和炎性细胞因子il-6表达结合实验1，本实验通过监测cd11c阳性细胞中cd40、cd80及cd86的表达率来评价dcs的成熟度，结果如图5所示，炎性细胞因子il-6的表达情况如图6所示。由图5可以看出，对照组imdcs(ctrl-dcs组)表面cd40、cd80及cd86的表达丰度分别为(44.27±3.46)％、(32.67±1.70)％及(32.73±1.52)％；s-dcs组表面cd40、cd80及cd86的表达丰度分别为(53.43±0.55)％、(34.93±1.01)％及(43.83±4.01)％；m-dcs组imdcs的共刺激分子cd40、cd80及cd86的表达丰度分别为(54.43±2.48)％、(45.10±4.19)％及(47.97±0.85)％；l-dcs组则为(57.13±2.70)％、(46.93±0.86)％及(49.97±0.76)％。说明go刺激imdcs后，其表面共刺激分子cd40、cd80以及cd86表达率均较ctrl-dcs组显著升高，差异有统计学意义(p<0.05)，表明氧化石墨烯能提升未成熟树突状细胞的成熟度。如图6所示，s-dcs、m-dcs、l-dcs组上清中分泌的il-6(分别为42617.02±341.24pg/ml、51709.04±10.78pg/ml、48080.82±4856.53pg/ml)均高于ctrl-dcs(imdcs)组(37361.91±5357.26pg/ml)，说明在炎症发生时go可以提升未成熟树突状细胞的成熟度，表明氧化石墨烯可促进未成熟树突状细胞发挥抗原递呈作用，递呈抗原给t细胞，激活抗原特异性t细胞反应以诱发机体免疫应答，从而调节dcs的炎症应答模式。4、与氧化石墨烯共孵育后树突状细胞趋化因子受体表达水平imdcs表面趋化因子受体表达与其迁移能力相关，结合实验1，本实验通过监测dcs表面趋化因子受体ccr7表达率，评价go对dcs迁移功能的影响，结果见图7和表2。如表2及图7所示，s-dcs组、m-dcs组和l-dcs组ccr7表达丰度分别为20.00±2.53％、15.54±4.75、18.71±4.75，明显高于对照组imdcs(ctrl-dcs组)8.66±2.06，差异有统计学意义(p<0.05)。实验结果说明go刺激的imdcs的表面ccr7表达率较对照组表达上调，表明go可增强dcs迁移能力。表2dcs表面趋化因子受体ccr7表达率实施例四、与氧化石墨烯共孵育后树突状细胞在体迁移与分布模式通过动物体内实验验证go处理对dcs体内归巢和迁移模式带来的促进作用，即采用组成型表达萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase,fluc)的fvb转基因小鼠(fluc.l2g85)骨髓来源的未成熟树突状细胞进行与氧化石墨烯的共孵育过程。以携带萤火虫荧光素酶报告基因的未处理树突状细胞作为阴性对照组，阳性药物脂多糖(lipopolysaccharide，lps)刺激得到的成熟dcs作为阳性对照组(lps-dcs组)，实施例三的s-dcs组、m-dcs组和l-dcs组为go处理组，将对照组及各go处理组得到的fluc+dcs(阴性对照为imdcs，下同)经脚垫被输注至已脱毛的野生型c57bl/6j小鼠中，小动物活体成像技术动态监测dcs从输注部位迁移到局部淋巴结的细胞数量，结果见图8。实验分别监测了dcs输注后4、24、48和72h后的发光情况。利用活体成像软件分析各淋巴组织发光强度数据，进一步计算出dcs的迁移数量。图8中a区(腘窝淋巴结位置)发光信号强度能表示dcs从脚垫迁移到腘窝淋巴结(pln)的数量，b区(脚垫位置)发光信号强度能表示dcs残留在脚垫的数量(图8中的a幅和b幅)。结果显示，s-dcs组细胞迁移至腘窝淋巴结区域的信号强度在24h、48h和72h均高于l-dcs组、m-dcs组和阴性对照组，信号强度在72h超过阳性对照(图8中的b幅和c幅)。发光信号强度系通过活体成像软件分析得到，经计算，s-dcs组、l-dcs组、m-dcs组及阴性对照组、阳性对照组dcs在48h迁移到pln的百分比分别为0.17±0.02、0.12±0.06、0.11±0.05、0.07±0.01、0.17±0.01；72h迁移到pln的百分比分别为0.24±0.05、0.16±0.09、0.15±0.05、0.08±0.02、0.23±0.08；说明迁移速率顺序为lps-dcs≈s-dcs组＞l-dcs组＞m-dcs组＞对照组，组间差异均有统计学意义(p＜0.05)。该实施例证明氧化石墨烯可增强了皮下输注dcs的局部迁移及向淋巴组织归巢能力。实施例五：毒性实验在实施例3第1部分中已经证实7.8μg/ml、15.6μg/ml浓度下细胞存活率大于90％，即达到公认的纳米材料无细胞毒性标准。实施例3第2部分中进一步表明实际进入到生物体内的氧化石墨烯不足孵育量的10％，按照过继性输注的dcs量计算，只有不足0.2mg/kg的氧化石墨烯进入小鼠体内，远远低于葡聚糖修饰go的最大耐受剂量，即介于50-125mg/kg之间(biomaterials35(2014)7022-7031))。此外，实施例四的动物实验中，并未发生动物状态受到影响或者生存期受到影响的情况，说明本发明的氧化石墨烯具有低毒性和高生物安全性。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的内容。当前第1页12