一种三维多尺度血管化支架的构建系统和方法与流程

本发明涉及一种三维多尺度血管化支架的构建系统和方法，应用于生物制造技术领域。

背景技术：

在过去的几年中，与组织工程相关的研究，如神经，皮肤，耳和软骨等的制造已经有了较大的发展。然而，复杂的器官和体外组织制造在这一领域仍然是一个巨大的挑战。在这个制造过程中最重要的问题之一是三维血管网络的形成。在工程化组织结构中，细胞必须与氧气和营养供应足够接近(100-200μm)才可以防止其坏死，同时均匀分布的三维血管和毛细血管网络也为代谢产物提供了传递通道。因此，工程组织支架中血管化的形成对于组织再生是重要的，并且有利于工程组织支架与宿主脉管系统的整合。

目前，主要用来解决血管化问题的方法分为以下几种：第一种是构建类血管结构直接替代原本受损血管即直接制备人造血管来进行替代。在该方法中，海藻酸钠和氯化钙的同轴挤出用于形成单根管结构的中空纤维。根据需要把打印的中空纤维嵌入工程支架得到具有预血管化网络的工程支架。第二种是通过构建带通道结构促进内皮细胞等形成血管化。国外研究表明，在水凝胶材料中制备出带通道的结构可以促进血管化。因此这种方法中是将牺牲材料如普朗尼克f127，海藻酸钠和琼脂糖等打印成设计好的三维血管网络牺牲模型，再将牺牲模板浸入水凝胶中，待水凝胶成型后去除牺牲模板，从而形成具有三维血管网络的支架。

虽然这两种种方法可以制造出类似于人体组织血管的血管网络结构，但在第一种方法中制造的血管网络尺寸单一且没有分支。第二种方法中因此制造的血管网络三维结构为二维累加或尺寸较大不适用人体较小尺度的三维血管网，这些种方法并不能有效地解决组织支架中三维多尺度血管化网络制造的的问题。

技术实现要素：

为了解决现有技术问题，本发明的目的在于克服已有技术存在的不足，提供一种三维多尺度血管化支架的构建系统和方法，利用生物3d打印技术与电流体动力学直写技术相结合通过增减材复合制造的方法，在水凝胶打印的基地上打印三维多尺度牺牲模板，制造含三维多尺度血管化网络的工程组织支架，以便更好地模拟组织的血管结构。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种三维多尺度血管化支架的构建系统，包括3d打印机，医用注射器，空气压缩机和高压电源。3个所述医用注射器安装在3d打印机上，第一和第二个医用注射器与空气压缩机相连接，作为3d打印第一和第二喷头用于打印改性明胶与普朗尼克f127。第三个医用注射器的针头与高压电源的正极相连，作为3d打印第三喷头，3d打印机的接受平台与高压电源的地线相连用于电流体动力直写。

一种三维多尺度血管化支架的构建方法，使用上述的三维多尺度血管化支架的构建系统，进行操作，其特征在于操作步骤如下：

a.在3d打印机接收平台上打印用于接收牺牲模板的半球形支架：用去离子水配置15％的水凝胶，放置60℃水浴中进行搅拌，直至水凝胶颗粒均匀溶解并且温度降到30℃，此时加入交联剂以交联水凝胶溶液，将配置好的水凝胶加热至熔融态并保持装入第一个医用注射器中，使用生物打印机的第一个喷头把熔融态水凝胶在3d打印机接收平台上打印出半球形支架；

b.打印血管网络的主通道与次级通道牺牲模板：用去离子水配置35％的普朗尼克f127，在4℃环境下进行搅拌，直至普朗尼克f127均匀溶解，将配置好的普朗尼克f127装入第二个医用注射器中，温度恢复到30℃使普朗尼克f127保持在可打印状态，第二个喷头的规格先用25g的针头，在a中打印的半球形支架上打印设计好的血管化网络的主通道牺牲模板；将第二个喷头换为规格为20g的针头，在a中打印的半球形支架上打印设计好的血管化网络的次级通道牺牲模板；

c.进行电流体动力直写工艺打印血管网络的微通道牺牲模板：聚己内酯pcl、二甲基酰胺和二氯甲烷以1：3：6的质量比进行配置。把配置好的溶液加入第三个医用注射器中，第三个喷头的规格选用20g的针头，打开高压电源，溶液在高压电场作用下，电荷借助电极，通过分子极化以及电解质电离的方式形成流体纤维在a中打印的半球形支架上打印设计好的血管化网络的微通道牺牲模板；

d.封装、交联和成形通道：在步骤a、b、c所成形的结构上继续使用生物3d打印机的第一喷头进行打印，打印出设计好的支架的完整形状，待其固化之后便完成了封装。然后控制环境温度使支架冷却使其中的牺牲材料普朗尼克f127液化，从事先留出的通道结构中流出，便完成了主通道和次级通道的制备，把支架放在37℃二氧化碳培养箱中进行交联，交联完成之后浸入二氯甲烷，支架中的pcl纤维溶解形成微通道，这样就完成了组织支架的制备。

作为本发明第一种优选技术方案，在步骤a和d中，水凝胶为明胶，交联剂为tg酶。两者质量比为10：1。

作为本发明第二种优选技术方案，在步骤a和d中，水凝胶为明胶，交联剂为戊二醛。两者质量比为10：1。

作为上述方案中进一步优选的技术方案，在步骤a和d中，将离心后的第五代人体脐静脉内皮细胞倒入按照设定浓度配制好明胶溶液中，并搅拌均匀；则在步骤d中，制得载第五代人体脐静脉内皮细胞的血管化支架。所有步骤均在无菌环境下操作，加入的加入的人体脐静脉内皮细胞有向血管内膜分化的作用，其利于组织的生长。

本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：

1.与现有的针对组织修复制作的血管化支架相比较，本发明在采用生物3d打印与电流体动力学直写相结合打印牺牲材料，以形成三维牺牲模板，实现多尺度血管网络的制造；

2.本发明制备三维多尺度尺度牺牲模板所用的材料易于去除，整个过程使用的都是生物材料无有害物质产生，且材料易获得；

3.本发明还能选择挤出牺牲材料的喷头直径来控制内部通道尺寸，以适应不同的应用需求，灵活性较高；

4.本发明含有三维多尺度血管化支架制备工艺简单，打印的三维牺牲模板只需温控和水浴即可去除。

本发明针对骨缺损修复中至关重要的三维多尺度血管化支架问题进行设计，将生物3d打印技术与电流体动力学直写技术相结合通过增减材复合的制造方法制备三维多尺度血管化支架，所采用的方法为生物3d打印水凝胶支架和牺牲模板的主次级网络通道，电流体动力学直写打印牺牲模板的微通道，该方法借助计算机辅助设计和精密机械，精确控制打印路径。在打印好完整的支架后，通过温控和水浴的方式将牺牲模块进行溶解，此时就会在水凝胶支架中形成三维血管网络的通道。及制备出含有三维多尺度血管化支架。

附图说明

图1是本发明三维多尺度血管化支架构建系统结构示意图。

图2是本发明实施例一三维多尺度血管化支架的制备方法流程图。

图3是本发明实施例一打印半球支架示意图。

图4是本发明实施例一打印主、次级通道牺牲模板示意图。

图5是本发明实施例一打印微通道牺牲模板示意图。

具体实施方式

本发明的优选实施例结合附图详述如下：

实施案例一：

如图1所示，本三维多尺度血管化支架的构建系统，包括3d打印机，医用注射器，空气压缩机和高压电源，三个所述医用注射器安装在3d打印机上，第一、第二医用注射器与空气压缩机相连接作为3d打印第一和第二喷头用于打印改性明胶与普朗尼克f127。第三个医用注射器的针头与高压电源的正极相连，作为3d打印第三喷头，3d打印机的接受平台与高压电源的地线相连用于电流体动力直写。包括如下步骤：

a.在3d打印机接收平台(5)上打印用于接收牺牲模板的半球形支架(7)：用去离子水配置15±0.5％的水凝胶，放置60±2℃水浴中进行搅拌，直至水凝胶颗粒均匀溶解并且温度降到30±1℃，此时加入交联剂(水凝胶与交联剂的质量比为10:1)以交联水凝胶溶液，将配置好的水凝胶加热至熔融态并保持装入第一个医用注射器中，使用生物打印机的第一个喷头把熔融态水凝胶(6)在3d打印机接收平台(5)上打印出半球形支架(7)；

b.打印血管网络的主通道与次级通道牺牲模板(9)：用去离子水配置35±1％的普朗尼克f127，在4℃环境下进行搅拌，直至普朗尼克f127均匀溶解，将配置好的普朗尼克f127装入第二个医用注射器中，温度恢复到30℃使普朗尼克f127(8)保持在可打印状态，第二个喷头的规格先用25g的针头，在步骤a中打印的半球形支架(7)上打印设计好的血管化网络的主通道牺牲模板；将第二个喷头换为规格为20g的针头，在步骤a中打印的半球形支架(7)上打印设计好的血管化网络的次级通道牺牲模板；

c.进行电流体动力直写工艺打印血管网络的微通道牺牲模板(11)：聚己内酯pcl、二甲基酰胺和二氯甲烷以1：3：6的质量比进行配置。把配置好的溶液(10)加入第三个医用注射器中，第三个喷头的规格选用20g的针头，打开高压电源，溶液在高压电场作用下，电荷借助电极，通过分子极化以及电解质电离的方式形成流体纤维在步骤a中打印的半球形支架(7)上打印设计好的血管化网络的微通道牺牲模板(11)；

d.封装、交联和成形通道：在步骤a、b、c所成形的结构上继续使用生物3d打印机的第一喷头进行打印，打印出设计好的支架的完整形状，待其固化之后便完成了封装。然后控制环境温度使支架冷却使其中的牺牲材料普朗尼克f127液化，从事先留出的通道结构中流出，便完成了主通道和次级通道的制备，把支架在37±1℃二氧化碳培养箱中中进行交联，交联完成之后浸入二氯甲烷，支架中的pcl纤维溶解形成微通道，这样就完成了组织支架(12)的制备。

实施例二：

参见图1～图5，本三维多尺度血管化支架的构建方法，包括如下步骤：

a.在3d打印机接收平台(5)上打印用于接收牺牲模板的半球形支架(7)：用去离子水配置15±0.5％的明胶，放置60±2℃水浴中进行搅拌，直至明胶颗粒均匀溶解并且温度降到30±1℃，此时加入mtg酶(明胶与mtg酶的质量比为10:1)以交联明胶溶液，将配置好的明胶溶液加热至熔融态并保持装入第一个医用注射器中，使用生物打印机的第一个喷头把熔融态明胶(6)在3d打印机接收平台(5)上打印出半球形支架(7)；

b.打印血管网络的主通道与次级通道牺牲模板(9)：用去离子水配置35±1％的普朗尼克f127，在4℃环境下进行搅拌，直至普朗尼克f127均匀溶解，将配置好的普朗尼克f127装入第二个医用注射器中，温度恢复到30℃使普朗尼克f127(8)保持在可打印状态，第二个喷头的规格先用25g的针头，在步骤a中打印的半球形支架(7)上打印设计好的血管化网络的主通道牺牲模板；将第二个喷头换为规格为20g的针头，在步骤a中打印的半球形支架(7)上打印设计好的血管化网络的次级通道牺牲模板；

c.进行电流体动力直写工艺打印血管网络的微通道牺牲模板(11)：聚己内酯pcl、二甲基酰胺和二氯甲烷以1：3：6的质量比进行配置。把配置好的溶液(10)加入第三个医用注射器中，第三个喷头的规格选用20g的针头，打开高压电源，溶液在高压电场作用下，电荷借助电极，通过分子极化以及电解质电离的方式形成流体纤维在步骤a中打印的半球形支架(7)上打印设计好的血管化网络的微通道牺牲模板(11)；

d.封装、交联和成形通道：在步骤a、b、c所成形的结构上继续使用生物3d打印机的第一喷头进行打印，打印出设计好的支架的完整形状，待其固化之后便完成了封装。然后控制环境温度使支架冷却使其中的牺牲材料普朗尼克f127液化，从事先留出的通道结构中流出，便完成了主通道和次级通道的制备，把支架在37±1℃二氧化碳培养箱中中进行交联，交联完成之后浸入二氯甲烷，支架中的pcl纤维溶解形成微通道，这样就完成了组织支架(12)的制备。

实施案例三：

本实施案例与实施案例二基本相同，特别之处如下：

参见图1～图3，利用普朗尼克f127的可打印性和pcl可电纺性且都易去除，将普朗尼克f127和pcl溶液分别通过3d打印和电流体动力学直写打印的方法在打印的水凝胶半球上打印出设计好的牺牲模型，再打印配置好浓度的明胶包裹牺牲模板，获得含有三维多尺度血管化通道的支架。首先将配置好的水凝胶加热至熔融态并保持装入第一个医用注射器中，使用生物打印机的第一个喷头把熔融态明胶在3d打印机接收平台上打印出半球形支架，然后利用普朗尼克f127和pcl在明胶半球上打印牺牲模板。因此，普朗尼克f127、pcl需要进行一定的浓度选择，使所形成的三维结构表面具有一定的平滑性和粘附性。在打印过程中，输入牺牲结构的编码程序并运行即可打印出设计好的牺牲模板。三维多尺度的普朗尼克f127和pcl牺牲模板打印成形后，进行封装获得完整支架。将含有牺牲模板的明胶支架放在冰箱和干燥箱中进行冷冻干燥，之后含有三维普朗尼克f127和pcl牺牲模板的明胶支架采用医用微创手术刀剪切去除多余部分，露出三维牺牲模板的头部与尾部，将含有三维牺牲模板的明胶支架放在培养皿通过温控和水浴的方式去除牺牲模板，从而得到三维多尺度血管网络通道支架。本实施例用于生物制造领域，采用将生物3d打印技术与电流体动力学直写技术相结合通过增减材复合的制造的方法，利用普朗尼克f127和pcl的易去除和可打印性来制备含有三维多尺度血管通道的支架，以此来模拟组织工程中组织修复等血管化存在的三维多尺度血管通道支架的构建问题。本实施例构建三维多尺度血管通道支架的方法是根据直写明胶半球上打印出的普朗尼克f127和pcl三维形状通过温控和水浴去除，所需材料极易获得。借助于普朗尼克f127和pcl可打印性来制备三维多尺度的血管化支架，解决了单独采用生物3d打印技术无法获得三维多尺度血管通道支架的问题。对于临床医学上解决人体组织修复问题中的血管化问题具有重要意义。

实施例四：

本实施例与实施例二基本相同，特别之处在于：

在本实施例中，一种三维多尺度血管化支架的构建方法，水凝胶为明胶，交联剂为戊二醛，包括如下步骤：

a.在3d打印机接收平台(5)上打印用于接收牺牲模板的半球形支架(7)：用去离子水配置15±0.5％的明胶，放置60±2℃水浴中进行搅拌，直至明胶颗粒均匀溶解并且温度降到30±1℃，此时加入戊二醛(明胶与戊二醛的质量比为10:1)以交联明胶溶液，将配置好的明胶溶液加热至熔融态并保持装入第一个医用注射器中，使用生物打印机的第一个喷头把熔融态明胶(6)在3d打印机接收平台(5)上打印出半球形支架(7)；

b.本步骤与实施例二相同；

c.本步骤与实施例二相同；

d.本步骤与实施例二相同。

实施例五：

本实施例与前述实施例二基本相同，特别之处在于：

在本实施例中，一种三维多尺度血管化支架的构建方法，水凝胶采用载有人骨髓间充质干细胞的明胶，包括如下步骤：

a.在3d打印机接收平台(5)上打印用于接收牺牲模板的半球形支架(7)：用去离子水配置15±0.5％的明胶，放置60±2℃水浴中进行搅拌，直至明胶颗粒均匀溶解并且温度降到30±1℃，此时加入mtg酶(明胶与mtg酶的质量比为10:1)以交联明胶溶液，在配制明胶时，从培养箱中取出正在培育中的第五代人体脐静脉内皮细胞，经胰蛋白酶作用使细胞离散、离心机离心等步骤，倒掉离心管中的上清液部分获得人体脐静脉内皮细胞，向该离心管中加入合适的细胞培养液并均匀吹打，然后用移液管将含有人体脐静脉内皮细胞的液体移入的明胶溶液中、搅拌均匀，从而获得含有人体脐静脉内皮细胞的明胶溶液。将配置好的明胶溶液热至熔融态(35±1℃)并保持装入第一个医用注射器中，使用生物打印机的第一个喷头把熔融态明胶(6)在3d打印机接收平台(5)上打印出半球形支架(7)。所有步骤均在无菌环境下操作；

b.本步骤与实施例二相同；

c.本步骤与实施例二相同

d.本步骤与实施例二相同。

实施例六：

本实施例与前述实施例四和实施案例五基本相同，特别之处在于：

在本实施例中，一种三维多尺度血管化支架的构建方法，水凝胶采用载有人骨髓间充质干细胞的明胶：

a.在3d打印机接收平台(5)上打印用于接收牺牲模板的半球形支架(7)：用去离子水配置15±0.5％的明胶，放置60±2℃水浴中进行搅拌，直至明胶颗粒均匀溶解并且温度降到30±1℃，此时加入戊二醛(明胶与戊二醛的质量比为10:1)以交联明胶溶液，在配制明胶时，从培养箱中取出正在培育中的第五代人体脐静脉内皮细胞，经胰蛋白酶作用使细胞离散、离心机离心等步骤，倒掉离心管中的上清液部分获得人体脐静脉内皮细胞，向该离心管中加入合适的细胞培养液并均匀吹打，然后用移液管将含有人体脐静脉内皮细胞的液体移入的明胶溶液中、搅拌均匀，从而获得含有人体脐静脉内皮细胞的明胶溶液。将配置好的明胶溶液加热至熔融态(35±1℃)并保持装入第一个医用注射器中，使用生物打印机的第一个喷头把熔融态明胶(6)在3d打印机接收平台(5)上打印出半球形支架(7)。所有步骤均在无菌环境下操作；

b.本步骤与实施例二相同；

c.本步骤与实施例二相同；

d.本步骤与实施例二相同。