一种3D打印PCL-PDA-AgNPs抗感染骨组织工程支架及其制备方法和应用与流程

本发明涉及3d打印pcl-pda-agnps抗感染骨组织工程支架及制备方法和应用，属生物工程化人体植入物，可以用于治疗多种致病菌，如：金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、β-溶血性链球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌等导致的急、慢性骨髓炎、化脓性关节炎骨破坏的治疗及感染后骨缺损的修复治疗。

背景技术

感染被定义为宿主组织与微生物局部浓度之间的平衡被打破，一般认为体内微生物超过10⁵个每克组织或有金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、β-溶血性链球菌等致病菌的存在即被认为存在感染。在众多感染性疾病中，骨、关节的感染不仅是骨科常见多发病，而且受限于局部血液供应差、对细菌抵抗力低、抗生素渗透性差等缺陷，往往难以愈合，很多急性、亚急性感染最终迁延为慢性感染。以往该骨科常用的抗感染策略通常是一期手术清创，静脉予以抗生素，局部应用含抗生素的间隔块或者骨水泥串珠。一般而言，这种方法取得较好的效果。随后可二期手术去除局部填充物，行翻修手术。但是，随着耐药菌株的出现，即使局部及静脉联合应用抗生素，也有可能发生抗感染的失败。

在骨、关节感染的治疗中，由于局部微循环差，生长因子少、活性低，细胞膜受体结构变化导致生长因子与受体之间失偶联，细菌还可能黏附在内植物部位形成生物膜导致内植物表面存在生物材料整合入周围组织与细菌黏附到材料表面的竞争等。同时，感染性病变对骨的侵蚀、破坏往往带来局部的死骨形成及骨缺损，甚至伴有皮肤、软组织的窦道形成，清创手术失败率、感染复发率高，往往导致患者严重的活动受限。因此，目前如何实现理想的局部抗菌，在清创祛除死骨与感染性病灶后能够有效的促进骨长入，同时无需二次手术一直是骨科临床与科研关注的重点。

目前的临床经典的治疗策略是基于聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate,pmma)的抗生素珠链植入法，但该方法不能降解，需二次手术取出，并会为病原菌的生长提供适宜的生长环境，造成感染复发，而且没有骨诱导与骨长入性能，因此急需新的方法进行替代。

随着组织工程学的进展，近年来有多种新的工程化生物材料-抗生素复合支架作为抗骨感染修复材料在实验室被研究，包括：羟基磷灰石(hydroapatite,ha)-抗生素支架，磷酸钙水泥(alciumphosphatecement,cpc)-壳聚糖-抗生素复合支架，聚乳酸(polylacticacid，pla)、聚羟基乙酸(polyglycolicacid，pga)、pga-pla共聚物等人工类ecm材料-抗生素复合支架等，部分研究还尝试采用多种方法在支架上结合重组人骨形态生成蛋白2(recombinanthumanbonemorphogeneticprotein-2,rhbmp-2)、转化生长因子-β(transforminggrowthfactor-β,tgf-β)等生物活性因子以促进骨长入。但这些材料均存在一定的缺陷，包括：1.ha、cpc等材料的脆性高、加工性能低，难以进行特定三维形态的加工与塑性，往往依赖于材料本身的三维构型；2.pga、pla等材料的生物活性低、弹性模量、拉伸强度、三维精加工方式上存在一定不足；3.目前尚缺乏对组织工程化支架材料的结构与成分进行精细调控的手段，故难以针对不同感染阶段(急性期、亚急性期、慢性感染)的用药特点，实现有效合理的药物释放；4.生物活性因子存在免疫排斥、病原体传播、过敏反应、潜在致肿瘤、致畸形可能性，生物安全性得不到保证，而且临床级的rhbmp-2、tgf-β等生物因子往往需要进口，且价格昂贵，每毫克的采购价就达到近千美元。

综上所述，开发出一种结构简单可靠，弹性和支撑力合适，手术植入方便，对人体创伤小，低成本、可诱导骨长入且可以实现抗生素控制释放的组织工程化抗骨感染支架对急、慢性骨髓炎、化脓性关节炎骨破坏的治疗及感染后骨缺损的修复治疗、对我国的卫生事业发展、对建设创新性国家都有重要的现实意义。

技术实现要素：

为了克服现有抗骨感染材料的上述问题，本发明的目的是提供一种结构简单可靠，外形与微结构可控，力学性能可靠，药物释放性能可控，植入方便，创伤小的3d打印pcl-pda-agnps抗感染骨组织工程支架及制备方法和应用，用于急、慢性骨髓炎、化脓性关节炎骨破坏的治疗及感染后骨缺损的修复治疗。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种3d打印pcl-pda-agnps抗感染骨组织工程支架，该支架是通过如下方法制备得到：

第一步：制备3d打印pcl支架

将pcl通过熔融挤压成型式3d打印的加热系统升温至液态，挤压出成型纤维束、通过纤维束的不同层次与角度拼接架构获得3d支架pcl；

第二步：制备3d打印pcl-pda支架

将tris在水中溶解，之后加入hcl调节体系的至ph值为8～9，配制得到tris-hcl溶液；多巴胺溶于tris-hcl溶液中，搅拌溶解，配置为da-tris-hcl溶液；将3d支架pcl加入da-tris-hcl溶液中，避光的条件下搅拌，待da在pcl表面自聚合形成pda后取出支架，得到3d打印pcl-pda支架；

第三步：制备3d打印pcl-pda-agnps抗感染骨组织工程支架

在分散剂的作用下，将制备的3d打印pcl-pda支架加入银氨溶液中，25℃搅拌反应直到agnps纳米颗粒粘附于3d打印支架的纤维表面后，将支架取出，清洗并真空干燥，得到的产品即为3d打印pcl-pda-agnps抗感染骨组织工程支架。

一种3d打印pcl-pda-agnps抗感染骨组织工程支架的制备方法，该方法包括以下步骤：

第一步：制备3d打印pcl支架

将pcl通过熔融挤压成型式3d打印的加热系统升温至液态，挤压出成型纤维束、通过纤维束的不同层次与角度的拼接架构获得3d支架pcl；

第二步：制备3d打印pcl-pda支架

将tris在水中溶解，之后加入hcl调节体系的至ph值为8～9，配制得到tris-hcl溶液；多巴胺溶于tris-hcl溶液中，搅拌溶解，配置为da-tris-hcl溶液；将3d支架pcl加入da-tris-hcl溶液中，避光的条件下搅拌，待da在pcl表面自聚合形成pda后取出支架，得到3d打印pcl-pda支架；

第三步：制备3d打印pcl-pda-agnps抗感染骨组织工程支架

以分散剂的作用下，将制备的3d打印pcl-pda支架加入银氨溶液中，25℃搅拌反应直到agnps纳米颗粒粘附于3d打印支架的纤维表面后，将支架取出，清洗并真空干燥，得到的产品即为3d打印pcl-pda-agnps抗感染骨组织工程支架。

本发明技术方案中：第一步中3d打印的纤维通过不同层次与角度的逐层累积与拼接架构而成的多孔隙结构，孔隙是各层纤维在0-180°的范围内相交并累积而形成，形成0-90°正交行结构、0-45-90-135-180°菱形结构、0-60-120-180°三角形结构在内的规律性孔隙，亦可以依据实际需要形成特殊的梯度化、层次化相交结构。

本发明技术方案中：第二步中tris在水中溶解后的质量含量为0.05～0.2％；tris和多巴胺的质量比为0.3～1：1。

本发明技术方案中：第三步中所述的银氨溶液是在8～15g/l的硝酸银溶液中缓慢滴加氨水，溶液由透明变浑浊，继续滴加氨水至溶液刚好澄清，得到的透明溶液即为银氨溶液。

本发明技术方案中：第三步中所述的分散剂为浓度为0.5～10wt％的聚乙烯吡咯烷酮。

本发明技术方案中：所述的支架在制备骨缺损修复材料领域中的应用。

本发明技术方案中：3d支架pcl外形可依据不同的待修复区的骨缺损形态进行3d打印个性化制造，也可以通过fdm3d打印制造为固定外形的支架材料，并在手术中依据实际骨缺损的要求进行填充。

本发明的3d打印微结构(包括支架的孔大小、孔形状、孔取向、孔隙率和连通性、及支架表面特性等)均可以调控支架的力学性能、细胞粘附性能、以及agnps颗粒的释放特性。同时，通过改变制作过程中含ag溶液的浓度、含ag溶液的反应时间，可调控支架表面agnps颗粒的负载量，进而调控agnps颗粒的释放特性。通过对agnps颗粒的释放特性的调控，可以针对不同病情(急性期、亚急性期、慢性感染)选择合理用药的强度。

本发明的多孔微结构，pcl材料具有一定的弹性模量与拉伸强度，通过对孔隙微结构、pcl比例的调控，可以精准匹配待修复区的力学环境，依据骨生长的wolf定律，将有利于新骨的长入与塑形；而且pcl本身具有良好的生物相容性可以提供有利于干细胞粘附、扩增、成骨分化及骨基质累积的局部微环境。同时，pda的修饰可进一步提高支架表面的亲水性及生物相容性，而且其所具有的弱碱性可中和支架降解过程中的弱酸性物质，给予细胞生长良好的环境。同时，多孔结构有利于营养成分的交换，进而可促进新骨的长入。因此，随着支架基材pcl的不断降解、新生骨组织的形成与填充孔隙，就能够形成在宿主部位良好的骨整合性能，进而诱导、促进新骨组织形成。

本发明采用的pcl、pda及agnps均为高生物相容性与生物安全性材料，其中pcl材料对生物体无毒，最终降解产物为co2和h2o，已被美国fda批准用于作为可临床使用的口服药基材、医用液态包装乃至组织工程支架基材等；agnps作为一种抗菌物从古代就开始广泛用来抗感染及防腐，是生物可吸收物质，并具备良好的生物安全性，由于其具有优良的稳定性、广谱的抗菌作用、较低的耐药性、较强的微量作用(尤其是对于那些超级细菌)，agnps已广泛应用于内植入物的抗菌涂层。da是下丘脑和脑垂体中的一种关键神经递质，pda为da溶液在一定条件下聚合而形成，是完全生物可降解的材料。

3d打印pcl-pda-agnps抗感染骨组织工程支架的特点是：①通过fmd3d打印技术构建，可以实现外形、内部孔隙结构的精细控制；②通过对材料中孔隙微结构(包括支架的孔大小、孔形状、孔取向、孔隙率和连通性、及支架表面特性等)的精细控制以及对于pda、agnps反应条件的调控，可以实现agnps释放的调控；③通过对材料比例、孔隙结构的控制，可使得支架具有良好的力学性能，同时pcl-pda支架具有亲水性、生物相容性、骨长入特性等理化特性；④采用的pcl、pda及agnps均为高生物相容性与生物安全性材料，支架可在生物体内完全降解吸收。

本发明的有益效果是设计一种新型的3d打印pcl-pda-agnps抗感染骨组织工程支架，在克服了现有抗骨感染材料缺点的同时还充分发挥了3d打印技术、支架材料本身的性能，使得本发明具有结构简单可靠，外形与微结构可控，力学性能可靠，离子释放性能可控，植入方便，创伤小、成本低的优点，可以用于急、慢性骨髓炎、化脓性关节炎骨破坏的治疗及感染后骨缺损的修复治疗。

附图说明：

图1为本发明的纤维层叠排列、建立三维多孔结构的示意图。a：支架纤维层叠排列二维视图，b：纤维0-90°层叠排列的正方形孔隙支架的结构示意图，c：纤维0-60-120-180°层叠排列的三角形孔隙支架的结构示意图，d：纤维0-45-90-135-180°层叠排列的菱形孔隙支架的结构示意图。

图2为本发明pda、agnps粘附于支架pcl纤维表面的示意图。

图3为本发明植入骨感染性缺损区后发挥抗感染、骨组织长入生物学作用的示意图。

图4为本发明采用不同孔隙微结构进行3d打印制备的通用型支架的实物图。

图5为本发明采用cad设计与3d打印制备的个性化支架的示例图。a：通过ct扫描获取的感染性骨缺损区域三维影像，b：个性化支架cad设计图，c：个性化支架实物图

图6为本发明的理化特性检测实验的结果图。a：支架抑菌性能检测图，b：扫描电镜纤维视图，c：高倍扫描电镜视图。

图7为本发明的体内抗感染与骨修复实验的结果图。a：骨感染性缺损视图，b：支架植入后视图，c：支架植入1月视图，d：支架植入2月视图，e:支架植入3月视图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此：

实施例1

一种3d打印pcl-pda-agnps抗感染骨组织工程支架，该支架是通过如下方法制备得到：

第一步：制备3d打印pcl支架

如图1(a)所示，将pcl通过熔融挤压成型式3d打印的加热系统升温至液态，挤压出成型纤维束、通过纤维束的不同层次叠加排列获得3d支架pcl；

第二步：制备3d打印pcl-pda支架

将0.61gtris在500ml水中溶解，之后加入hcl调节体系的至ph值为8～9，配制得到tris-hcl溶液；1g多巴胺溶于tris-hcl溶液中，搅拌溶解，配置为da-tris-hcl溶液；将3d支架pcl加入da-tris-hcl溶液中，避光的条件下搅拌，待da在pcl表面自聚合形成pda后取出支架，得到3d打印pcl-pda支架；

第三步：制备3d打印pcl-pda-agnps抗感染骨组织工程支架

以3wt％的聚乙烯吡咯烷酮为分散剂，将制备的3d打印pcl-pda支架加入银氨溶液中，25℃搅拌反应直到agnps纳米颗粒粘附于3d打印支架的纤维表面后，将支架取出，清洗并真空干燥，得到的产品即为3d打印pcl-pda-agnps抗感染骨组织工程支架。其中：所述的银氨溶液是在8g/l的硝酸银溶液中缓慢滴加氨水，溶液由透明变浑浊，继续滴加氨水至溶液刚好澄清，得到的透明溶液即为银氨溶液。

实施例2

一种3d打印pcl-pda-agnps抗感染骨组织工程支架，该支架是通过如下方法制备得到：

第一步：制备3d打印pcl支架

如图1(b)所示，将pcl通过熔融挤压成型式3d打印的加热系统升温至液态，挤压出成型纤维束，纤维的0-90°层叠排列的正方形孔隙3d支架pcl；

第二步：制备3d打印pcl-pda支架

将0.4gtris在500ml水中溶解，之后加入hcl调节体系的至ph值为8～9，配制得到tris-hcl溶液；1g多巴胺溶于tris-hcl溶液中，搅拌溶解，配置为da-tris-hcl溶液；将3d支架pcl加入da-tris-hcl溶液中，避光的条件下搅拌，待da在pcl表面自聚合形成pda后取出支架，得到3d打印pcl-pda支架；

第三步：制备3d打印pcl-pda-agnps抗感染骨组织工程支架

以5wt％的聚乙烯吡咯烷酮为分散剂，将制备的3d打印pcl-pda支架加入银氨溶液中，25℃搅拌反应直到agnps纳米颗粒粘附于3d打印支架的纤维表面后，将支架取出，清洗并真空干燥，得到的产品即为3d打印pcl-pda-agnps抗感染骨组织工程支架。其中：所述的银氨溶液是在10g/l的硝酸银溶液中缓慢滴加氨水，溶液由透明变浑浊，继续滴加氨水至溶液刚好澄清，得到的透明溶液即为银氨溶液。

实施例3

一种3d打印pcl-pda-agnps抗感染骨组织工程支架，该支架是通过如下方法制备得到：

第一步：制备3d打印pcl支架

如图1(c)所示，将pcl通过熔融挤压成型式3d打印的加热系统升温至液态，挤压出成型纤维束、纤维束0-60-120-180°层叠排列架构获得3d支架pcl；

第二步：制备3d打印pcl-pda支架

将0.8gtris在500ml水中溶解，之后加入hcl调节体系的至ph值为8～9，配制得到tris-hcl溶液；1g多巴胺溶于tris-hcl溶液中，搅拌溶解，配置为da-tris-hcl溶液；将3d支架pcl加入da-tris-hcl溶液中，避光的条件下搅拌，待da在pcl表面自聚合形成pda后取出支架，得到3d打印pcl-pda支架；

第三步：制备3d打印pcl-pda-agnps抗感染骨组织工程支架

以10wt％的聚乙烯吡咯烷酮为分散剂，，将制备的3d打印pcl-pda支架加入银氨溶液中，25℃搅拌反应直到agnps纳米颗粒粘附于3d打印支架的纤维表面后，将支架取出，清洗并真空干燥，得到的产品即为3d打印pcl-pda-agnps抗感染骨组织工程支架。其中：所述的银氨溶液是在15g/l的硝酸银溶液中缓慢滴加氨水，溶液由透明变浑浊，继续滴加氨水至溶液刚好澄清，得到的透明溶液即为银氨溶液。

对于感染性骨缺损患者，如果缺损区没有金属异物等可能影响ct扫描图像的干扰因素，可以通过ct扫描获得解剖数据，并结合感染、骨缺损的病情严重程度，设计具备个性化外形与理化特性的3d打印支架并植入感染性骨缺损区域。对于无法获取精确解剖数据的患者，使用预先准备好的pcl-pda-agnps抗感染骨组织工程支架，依据实际缺损情况决定植入支架的数量。支架植入后，随着agnps的释放对感染进行控制，与此同时，随着pcl、pda、agnps的降解，新生骨组织则不断长入，最终实现控制感染、骨缺损修复的目标。

如图1所示，支架的多孔结构由不同层次排列的pcl纤维束叠加形成，图1a为支架纤维依不同层次叠加排列的二维示意图，可以看到支架的孔隙形态由支架纤维的不同层叠方法确定，包括孔大小、孔形状、孔取向、孔隙率和连通性等。图1b、c、d分为提供了采用0-90°、0-60-120-180°、0-45-90-135-180°层叠排列形成具有正方形、三角形、菱形孔隙的3d打印pcl支架的结构示意图。在实际工作中，亦可以依据不同待修复区力学环境、感染程度等的实际要求，通过对支架纤维层叠的调控，进而制备个性化设计、具备特定孔隙微结构的支架。

图2为本发明实施例2的pda、agnps粘附于支架pcl纤维表面的示意图。1为3d打印pcl-pda-agnps抗感染骨组织工程支架三维示意图；2为局部放大后单根支架纤维的示意图；3为支架的纤维表面示意图可以看到pcl纤维通过表面的pda粘附agnps纳米颗粒。

图3的1-6是本发明植入骨感染性缺损区后发挥抗感染、骨组织长入生物学作用的示意图。1为支架植入骨缺损部位；2为支架植入时局部的放大图；3显示3d打印pcl-pda-agnps抗感染骨组织工程支架的纤维表面通过表面的pda粘附agnps纳米颗粒；当支架植入后4(agnps纳米颗粒)释放，并对组织中对5(细菌)进行杀灭，当细菌接触或者黏附到支架上可以直接被agnps所消灭，同时，agnps自支架释放到组织局部环境当中亦可杀灭组织周围的细菌；6-7为随着agnps的释放及pcl、pda的降解，支架逐渐被人体吸收，同时有骨组织长入，直到8显示支架完全降解，骨感染被治愈，同时骨缺损区域被新生骨组织替代。

图4a、b、c分别是按照前述技术路线，制备的不同结构通用型3d打印pcl-pda-agnps抗感染骨组织工程支架的实物图，其中a为纤维成0-60-120-180°层叠排列的具备三角形孔隙微结构的支架，b为纤维成0-45-90-135-180°层叠排列的具备菱形孔隙微结构的支架，c为纤维成0-90°层叠排列的具备正方形微结构的支架。

图5a、b、c分别是按照前述技术路线进行个性化支架制备的示例图，其中a为通过ct扫描获取的感染性骨缺损区域三维影像，b为计算机辅助设计的个性化支架的三维cad图像，c为采用成0-90°纤维层叠排列的个性化3d打印pcl-pda-agnps抗感染骨组织工程支架。

图6a、b、c分别是按照前述技术路线构建的3d打印pcl-pda-agnps抗感染骨组织工程支架的理化特性检测实验的结果图，其中a为将0-90°纤维层叠排列的3d打印pcl-pda-agnps抗感染骨组织工程支架植入含有金葡菌的培养皿内进行抑菌实验，可以看到在培养2周后，支架周围有环形抑菌圈，可见本发明制备的3d打印支架具有可靠的抑菌效能，b为低倍扫描电镜检测图，可以看到支架纤维表面有大量agnps纳米颗粒，c为高倍扫描电镜检测图，可以看到agnps纳米颗粒在pcl材料表面广泛粘附，并形成具有一定粗糙度的纤维表面。

图7a-e为本发明的体内抗感染与骨修复实验的结果图，其中a为感染性骨缺损区域；b为将支架植入感染性骨缺损区域，显示3d打印支架完全嵌入骨缺损区域；c为支架植入后1月，局部感染得到有效控制，骨软骨组织逐渐生长；d、e分别为支架植入2月、3月的照片，显示局部感染消失，新生骨软骨组织长入并替代支架材料。