基于ZnO/GO复合纳米材料拮抗重金属Cd毒性的方法与流程

本发明涉及拮抗重金属毒性材料领域，具体涉及基于zno/go复合纳米材料拮抗重金属cd毒性的方法。

背景技术

重金属cd广泛应用于金属电镀、电池制备、油漆、印刷和颜料生产等多个领域。此外，矿石燃料的开采、使用及燃烧过程也会导致重金属cd大量释放入环境中。吸烟、摄入被重金属cd污染的空气、食物和水源都会造成重金属cd在体内蓄积。由于重金属cd在生物体内的半衰期长达10-30年，进入机体内的重金属cd很难被彻底降解和排出，加之重金属cd的毒性浓度很低，各种急性或慢性暴露导致的体内重金属cd累积会对肝脏、肾脏、肺脏、骨骼、生殖系统、心血管系统等产生显著的毒性作用，引起机体多脏器系统的广泛损伤。

美国毒物管理委员会(atsdr)已将重金属cd列为第七位危害人体健康的有毒物质。国际癌症研究中心(iarc)也于1993年将重金属cd定为i类致癌物，即已确定的人类致癌物。世界卫生组织(who)也将重金属cd作为优先研究的食品污染物。20世纪起源于日本的“痛痛病”，我国多地出现的“镉大米”事件，都是重金属cd污染危害人类健康的典型案例。

临床上目前尚缺乏预防和治疗重金属cd中毒的有效方法。除了尽早洗胃、导泻、补液和止吐、消除腹痛等对症处理以外，临床上目前主要采用依地酸钙钠螯合重金属离子来进行解毒。然而依地酸钙钠与不同种类金属离子的络合能力差异显著，对铅的络合能力最强，也可络合重金属cd，但效率一般。此外，因为最终形成的络合物随尿排出，所以该治疗方式会导致肾脏中重金属cd累积过快，对肾脏产生显著毒性。因此，依地酸钙钠拮抗重金属cd毒性的治疗方法尚存争议，且不推荐用于重金属cd慢性中毒的治疗。因此，急需探索和开发能够特异性拮抗重金属cd毒性的有效方法。

现有研究结果显示：无论在细胞水平还是动物体水平，zno纳米材料可以通过释放锌离子，特异性拮抗重金属cd的毒性效应。

但是由于zno纳米材料本身也具有一定的毒性效应，且重金属cd发挥毒性作用是通过多条机制、多个通路的综合结果，因此，仅凭单一zno纳米材料对重金属cd毒性的拮抗能力还是非常有限的。

因此，提供一种可特异性针对生物体重金属cd中毒进行有效预防和解毒的方法至关重要。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于提供一种zno/go复合纳米材料拮抗重金属cd毒性的方法，通过该方法能够特异性针对生物体重金属cd中毒进行有效的预防和解毒。

本发明通过以下技术方案解决上述技术问题的:

一种基于zno/go复合纳米材料拮抗重金属cd毒性的方法，包括以下步骤：

步骤一、zno/go复合纳米材料的合成；

步骤二、模型细胞的培养；

步骤三、zno/go复合纳米材料与重金属cd暴露模型细胞；

步骤四、拮抗效率检测。

优选地，所述步骤三中，zno/go复合纳米材料与重金属cd暴露模型细胞的方法为方法a：使用dmem培养基分别将zno/go复合纳米材料和重金属cd稀释至1-40μg/ml和0.5-5μg/ml，得到zno/go复合纳米材料稀释液和重金属cd稀释液，将zno/go复合纳米材料稀释液与重金属cd稀释液混合均匀后，暴露模型细胞24h。

优选地，所述步骤三中，zno/go复合纳米材料与重金属cd暴露模型细胞的方法为方法b：使用dmem培养基分别将zno/go复合纳米材料和重金属cd稀释至1-40μg/ml和0.5-5μg/ml，得到zno/go复合纳米材料稀释液和重金属cd稀释液，先使用zno/go复合纳米材料稀释液预处理模型细胞1-12h，再加入重金属cd稀释液处理模型细胞。

优选地，所述步骤三中，zno/go复合纳米材料与重金属cd暴露模型细胞的方法为方法c：使用dmem培养基分别将zno/go复合纳米材料和重金属cd稀释至1-40μg/ml和0.5-5μg/ml，得到zno/go复合纳米材料稀释液和重金属cd稀释液，先使用重金属cd稀释液预处理模型细胞0.5-4h，再加入浓度为1-40μg/ml的zno/go复合纳米材料稀释液处理模型细胞。

优选地，所述步骤二中模型细胞为hepg2细胞。

优选地，所述步骤二中hepg2细胞的培养方法如下：

将hepg2细胞置于含有10％的胎牛血清、1％青霉素-链霉素双抗的dmem培养基中，在37℃、5％co2浓度的细胞培养箱中培养24h。

上述步骤一中zno/go复合纳米材料的合成包括以下步骤：

①称取0.25-0.75g乙酸锌溶解于45-55ml无水乙醇中，75-85℃剧烈搅拌15-25min；

②称取0.15-0.25g氢氧化锂溶解于15-25ml无水乙醇中；

③将溶解的氢氧化锂乙醇溶液加入到25-35ml2mg/mlgo的分散液中；

④待步骤①中的乙酸锌溶液反应完全，温度降至45-55℃时，将氢氧化锂和go的混合液加入乙酸锌溶液中，搅拌35-45min，直至反应结束；

⑤反应结束后，加入混合液两倍体积的正己烷，3-5℃静置过夜；

⑥离心弃去上清液，使用无水乙醇和超纯水分别洗涤材料，离心收集产物，即得。

优选地，所述步骤①中称取0.55g乙酸锌溶解于50ml无水乙醇中，80℃剧烈搅拌20min；步骤②中称取0.2g氢氧化锂溶解于20ml无水乙醇中；步骤③中将溶解的氢氧化锂乙醇溶液加入30ml2mg/mlgo分散液中；步骤④中待步骤①中的乙酸锌溶液反应完全，温度降至50℃时，将氢氧化锂和go的混合液加入乙酸锌溶液中，搅拌40min；步骤⑤中反应结束后，加入混合液两倍体积的正己烷，4℃静置过夜。

上述步骤四中拮抗效率检测的方法如下：

待步骤三中的zno/go复合纳米材料与重金属cd共同暴露步骤二中的模型细胞结束后，弃去培养模型细胞的培养基，随后向96-120孔板的每个孔中加入使用dmem培养基稀释5-10倍的cck-8荧光染料50-100μl，模型细胞染色后，置于37℃、5％co2浓度的细胞培养箱中，避光孵育1-4h，采用酶标仪测定其在450nm处的吸光度。

优选地，所述步骤四中的拮抗效率检测的方法如下：

待步骤三中的zno/go复合纳米材料与重金属cd共同暴露步骤二中的模型细胞结束后，弃去培养模型细胞的培养基，随后向96孔板的每个孔中加入使用dmem培养基稀释10倍的cck-8荧光染料100μl，模型细胞染色后，置于37℃、5％co2浓度的细胞培养箱中，避光孵育4h，采用酶标仪测定其在450nm处的吸光度。

有益效果：

本发明公开基于zno/go复合纳米材料拮抗重金属cd毒性的方法，相对于现有技术公开的关于生物体重金属cd中毒的拮抗，本发明公开的技术方案具有以下优点：

1、处理方法更为简单快捷：无论是在生物体暴露重金属cd之前、生物体暴露重金属cd时、还是生物体暴露重金属cd之后加入，zno/go复合纳米材料都具有良好的拮抗效果，因此，本发明公开的技术方案在生物体重金属cd中毒的预防以及急性中毒急救中具有广阔的应用前景；

2、拮抗效率更为优异：本发明公开的技术方案与临床上常用的拮抗剂依地酸钙钠和单独的zno纳米材料相比，zno/go复合纳米材料都具有更优异的拮抗效果；

3、生物安全性更高：本发明公开的zno/go复合纳米材料与单独的zno纳米材料相比，zno/go复合纳米材料的生物安全性显著提高，且zno/go复合纳米材料在对哺乳动物细胞无毒副作用的前提下便可高效拮抗重金属cd的毒性，在拮抗生物体重金属cd中毒方面具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1-3中暴露模型细胞的方式流程图；

图2为本发明实施例1中的拮抗效率图；

图3为本发明实施例2中的拮抗效率图；

图4为本发明实施例3中的拮抗效率图；

图5为本发明对照性试验中zno/go复合纳米材料与依地酸钙钠拮抗重金属cd毒性效率的对比图；

图6为本发明对照性试验中zno/go复合纳米材料与zno和go纳米材料拮抗重金属cd毒性效率的对比图；

图7为本发明对照性试验中zno/go复合纳米材料与zno和go纳米材料的生物安全性对比图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种基于zno/go复合纳米材料拮抗重金属cd毒性的方法，包括以下步骤：

步骤一、zno/go复合纳米材料的合成，其合成方法包括以下步骤：

①称取0.55g乙酸锌溶解于50ml无水乙醇中，80℃剧烈搅拌20min；

②称取0.2g氢氧化锂溶解于20ml无水乙醇中；

③将溶解的氢氧化锂乙醇溶液加入30ml2mg/mlgo分散液中；

④待步骤①中的乙酸锌溶液反应完全，温度降至50℃时，将氢氧化锂和go的混合液加入乙酸锌溶液中，搅拌40min；

⑤反应结束后，加入混合液两倍体积的正己烷，4℃条件下静置过夜；

⑥离心弃去上清液，使用无水乙醇和超纯水分别洗涤材料，离心收集产物，即得；

步骤二、选取人体肝癌细胞hepg2细胞进行细胞培养，培养方法如下：

将hepg2细胞置于含有10％的胎牛血清、1％青霉素-链霉素双抗的dmem培养基中，在37℃、5％co2浓度的细胞培养箱中培养24h；

步骤三、将步骤一中的zno/go复合纳米材料与重金属cd共同暴露步骤二中培养的hepg2细胞，其暴露hepg2细胞的方法为方法a：使用dmem培养基分别将zno/go复合纳米材料和重金属cd稀释至10μg/ml和3μg/ml，得到zno/go复合纳米材料稀释液和重金属cd稀释液，将zno/go复合纳米材料稀释液与重金属cd稀释液混合均匀后，暴露模型细胞24h。

上述步骤四中拮抗效率检测的方法如下：

待步骤三中的zno/go复合纳米材料与重金属cd共同暴露步骤二中的模型细胞结束后，弃去培养模型细胞的培养基，随后向96孔板的每个孔中加入使用dmem培养基稀释10倍的cck-8荧光染料100μl，模型细胞染色后，置于37℃、5％co2浓度的细胞培养箱中，避光孵育3h，采用酶标仪测定其在450nm处的吸光度。

实施例2

一种基于zno/go复合纳米材料拮抗重金属cd毒性的方法，包括以下步骤：

步骤一、zno/go复合纳米材料的合成，其合成方法包括以下步骤：

①称取0.75g乙酸锌溶解于55ml无水乙醇中，85℃剧烈搅拌25min；

②称取0.25g氢氧化锂溶解于25ml无水乙醇中；

③将溶解的氢氧化锂乙醇溶液加入35ml2mg/mlgo分散液中；

④待步骤①中的乙酸锌溶液反应完全，温度降至50℃时，将氢氧化锂和go的混合液加入乙酸锌溶液中，搅拌45min；

⑤反应结束后，加入混合液两倍体积的正己烷，5℃条件下静置过夜；

⑥离心弃去上清液，使用无水乙醇和超纯水分别洗涤材料，离心收集产物，即得；

步骤二、选取人体肝癌细胞hepg2细胞进行细胞培养，培养方法如下：

将hepg2细胞置于含有10％的胎牛血清、1％青霉素-链霉素双抗的dmem培养基中，在37℃、5％co2浓度的细胞培养箱中培养24h；

步骤三、将步骤一中的zno/go复合纳米材料与重金属cd共同暴露步骤二中培养的hepg2细胞，其暴露hepg2细胞的方法为方法b：使用dmem培养基分别将zno/go复合纳米材料和重金属cd稀释至10μg/ml和3μg/ml，得到zno/go复合纳米材料稀释液和重金属cd稀释液，先使用zno/go复合纳米材料稀释液预处理模型细胞4h，再加入重金属cd稀释液处理模型细胞20h。

上述步骤四中拮抗效率检测的方法如下：

待步骤三中的zno/go复合纳米材料与重金属cd共同暴露步骤二中的模型细胞结束后，弃去培养模型细胞的培养基，随后向96孔板的每个孔中加入使用dmem培养基稀释10倍的cck-8荧光染料100μl，模型细胞染色后，置于37℃、5％co2浓度的细胞培养箱中，避光孵育4h，采用酶标仪测定其在450nm处的吸光度。

实施例3:

一种基于zno/go复合纳米材料拮抗重金属cd毒性的方法，包括以下步骤：

步骤一、zno/go复合纳米材料的合成，其合成方法包括以下步骤：

①称取0.25g乙酸锌溶解于15ml无水乙醇中，80℃剧烈搅拌15min；

②称取0.15g氢氧化锂溶解于15ml无水乙醇中；

③将溶解的氢氧化锂乙醇溶液加入25ml2mg/mlgo分散液中；

④待步骤①中的乙酸锌溶液反应完全，温度降至50℃时，将氢氧化锂和go的混合液加入乙酸锌溶液中，搅拌35min；

⑤反应结束后，加入混合液两倍体积的正己烷，3℃条件下静置过夜；

⑥离心弃去上清液，使用无水乙醇和超纯水分别洗涤材料，离心收集产物，即得；

步骤二、选取人体肝癌细胞hepg2细胞进行细胞培养，培养方法如下：

将hepg2细胞置于含有10％的胎牛血清、1％青霉素-链霉素双抗的dmem培养基中，在37℃、5％co2浓度的细胞培养箱中培养24h；

步骤三、将步骤一中的zno/go复合纳米材料与重金属cd共同暴露步骤二中培养的hepg2细胞，其暴露hepg2细胞的方法为方法c：使用dmem培养基分别将zno/go复合纳米材料和重金属cd稀释至10μg/ml和3μg/ml，得到zno/go复合纳米材料稀释液和重金属cd稀释液，先使用重金属cd稀释液预处理模型细胞0.5-2h，再加入浓度为10μg/ml的zno/go复合纳米材料稀释液处理模型细胞22-23.5h。

上述步骤四中拮抗效率检测的方法如下：

待步骤三中的zno/go复合纳米材料与重金属cd共同暴露步骤二中的模型细胞结束后，弃去培养模型细胞的培养基，随后向96孔板的每个孔中加入使用dmem培养基稀释5倍的cck-8荧光染料50μl，模型细胞染色后，置于37℃、5％co2浓度的细胞培养箱中，避光孵育1h，采用酶标仪测定其在450nm处的吸光度。

拮抗重金属cd的毒性效应试验：

一、为了充分验证本发明实施例1-3中a、b、c三种不同的暴露处理方式，对拮抗重金属cd的毒性效应的影响，进行毒性效应试验，试验方法按照步骤四中拮抗效率检测的方法进行，检测结果如图2-4所公开的图表所示(分别对应实施例1-3)。

1.1、由图2公开的数据可知：针对实施例1中方法a的暴露试验方式：zno/go复合纳米材料可以有效拮抗重金属cd的毒性效应，且随着zno/go复合纳米材料浓度的增加，拮抗效率逐渐增强。在10μg/ml时，zno/go复合纳米材料可以将3μg/ml重金属cd暴露后的细胞活力从约20％提升至95％以上，几乎完全拮抗了重金属cd对细胞的毒性效应，并且在此浓度下，zno/go复合纳米材料具有良好的生物安全性。

1.2、由图3公开的数据可知：针对实施例2中方法b的暴露试验方式：zno/go复合纳米材料预处理细胞4小时后再加入重金属cd处理细胞的方式下，zno/go复合纳米材料可以有效拮抗重金属cd的毒性效应。zno/go复合纳米材料可以将3μg/ml重金属cd暴露后的细胞活力从约20％提升至95％以上，几乎完全拮抗了重金属cd对细胞的毒性效应。

1.3、由图4公开的数据可知：针对实施例3中方法c的暴露试验方式：重金属cd预处理细胞0.5-2小时后再加入zno/go复合纳米材料处理细胞的方式下，zno/go复合纳米材料仍然可以有效拮抗重金属cd的毒性效应。重金属cd预处理细胞2小时后再加入zno/go复合纳米材料的情况下，zno/go复合纳米材料可以将3μg/ml重金属cd暴露后的细胞活力从约20％提升至69.2％。(图4中横坐标标记的“0-2h”分别代表重金属cd预处理细胞0、0.5、1、2小时后再加入zno/go复合纳米材料处理细胞)

二、对照性试验：

为了验证本发明公开的zno/go复合纳米材料相对于依地酸钙钠以及单一zno和go纳米材料对重金属cd的拮抗效率，进行以下对比试验：

2.1、zno/go复合纳米材料与依地酸钙钠的拮抗效率比较：

试验方法：使用同样浓度的zno/go复合纳米材料和依地酸钙钠分别与重金属cd同时暴露细胞24小时后，使用cck-8试剂盒评价两种材料的拮抗效率，检测结果如图5所示。

由图5公开的图表数据可知：10μg/ml浓度下，zno/go复合纳米材料和依地酸钙钠分别将3μg/ml重金属cd暴露后的细胞活力从约20％增加至88.4％和30.1％。zno/go复合纳米材料的拮抗效率比依地酸钙钠提升1.9倍。

2.2、zno/go复合纳米材料与zno和go纳米材料的拮抗效率比较：

试验方法：将10μg/mlzno/go复合纳米材料、5μg/mlzno纳米材料以及5μg/mlgo纳米材料(zno/go复合纳米材料中zno与go的质量比为1:1)分别与重金属cd同时暴露细胞24小时后，使用cck-8试剂盒评价三种材料的拮抗效率，检测结果如图6所示。

由6公开的图表数据可知：10μg/ml浓度下，zno/go复合纳米材料和zno纳米材料分别将3μg/ml重金属cd暴露后的细胞活力从约20％增加至96.7％和59.2％。zno/go复合纳米材料的拮抗效率比单独的zno纳米材料提升63.3％。

2.3、zno/go复合纳米材料与zno和go纳米材料的生物安全性比较：

试验方法：将0-100μg/mlzno/go复合纳米材料、0-50μg/mlzno纳米材料以及0-50μg/mlgo纳米材料(zno/go复合纳米材料中zno与go的质量比为1:1)分别处理细胞24小时后，使用cck-8试剂盒评价三种材料的生物安全性，评价结果如图7所示：

由图7公开的数据可知：随着材料浓度逐渐增加，zno/go复合纳米材料和zno纳米材料均呈现出剂量依赖的细胞毒性效应，但是zno/go复合纳米材料的生物安全性显著高于单独的zno纳米材料，且zno/go复合纳米材料在有效拮抗重金属cd毒性的浓度下(10μg/ml)具有良好的生物安全性。此外，在所测浓度范围内，单独的go纳米材料具有良好的生物安全性。

综上，通过上述实验可知：本发明公开的技术方案，相对于现有技术在拮抗重金属cd毒性方面，不仅更为简单快捷，拮抗效率更为优异，且生物安全性更高。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，包括语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。