2’-氟-4’-叠氮核苷在制备病毒感染因子蛋白抑制剂中应用的制作方法

本发明涉及核苷类病毒感染因子蛋白抑制剂及其前药、或其组合物的用途，属药物化学领域。
背景技术：
从1981年美国发现第一例艾滋病患者，到目前世界上大约有三千九百万艾滋病病人。艾滋病感染已成为人类健康的一个重大威胁。人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，hiv)的感染引起艾滋病发作。艾滋病病毒(hiv-1)复制经过吸附、侵入和脱壳、逆转录、整合病毒rna和蛋白质的合成、装配、释放和成熟等过程完成。其中每个环节均可作为抗hiv药物的靶点。经过三十多年的研究，包括合并用药在内，已有40个(medicinesindevelopmenthiv/aids2014)抗艾滋病药被美国fda批准用于临床。根据药物的作用机理，它们可以分为：核苷和非核苷类逆转录酶抑制剂，蛋白酶抑制剂，侵入抑制剂和整合酶抑制剂等几大类。这些药物能有效地抑制hiv的复制，但都不能治愈艾滋病。长期使用这些药物，仍可能因新耐药性的不断产生和药物的毒副作用使现有药物治疗失去作用。因此仍有继续寻找具有新作用机理的抑制hiv治疗药物的紧急需求。2’-脱氧核苷是用于临床的主要一类hiv抑制剂，它们通过抑制逆转录酶发挥药物作用。其作用机理如下：核苷首先被磷酸酯酶转化成活性成分核苷三磷酸酯。后者在逆转录酶作用下被hiv的dna结合。由于目前的核苷类hiv抑制剂大多是3'-脱氧核苷，因为没有3'-oh，使hiv的dna合成不能完成，从而达到抑制hiv的复制(其过程如下)。核苷1和3在磷酸酯酶的作用下被分别转化成相应的核苷三磷酸酯2和4。而2和4在逆转录酶的作用下与hiv的dna片段结合分别生成新的hivdna片段6和7。带有改良核苷的dna片断6因其没有3'-oh而不能继续延长下去；而dna片断7也因为改良核苷有4'-位取代基的立体位阻而使新的dna片段7不利于进一步延长。因此，这两种hiv抑制剂都属于hiv的dna合成终止剂。固有免疫在机体抵御hiv-1感染过程中发挥重要作用。近年来，研究人员发现载脂蛋白bmrna编辑酶催化多肽样蛋白(apolipoproteinbmrna-editingenzymecatalyticpolypeptideprotein,apobec)家族的成员apobec3g(a3g)可以通过胞嘧啶脱氨机制抑制hiv的复制,发挥固有免疫的作用。病毒感染因子(virioninfectivityfactor,vif)是hiv的六个辅助蛋白之一，能与a3g结合并引发a3g的降解而失去抗病毒作用,使hiv-1的感染率增加100倍以上。因此，可以通过抑制vif蛋白这一新途径抑制hiv复制。所以，vif抑制剂可能成为艾滋病治疗药物的新选择。到目前为止，已有一些小分子化合物被发现具有抑制vif的活性(chemmedchem2012,7,1217；chem.biol.drugdesign2013,81,730；acsmed.chem.lettt.2012,3,465；j.biol.chem.2015,290,10504)，但都处于非常早期发现阶段，这些化合物的抗病毒活性也不高(ic50在4μm以上)。目前，核苷类的vif抑制剂还未见报道。技术实现要素：本发明目的在于提供一种核苷类病毒感染因子蛋白抑制剂在制备治疗病毒感染因子有关疾病药物中的应用。本发明所述2’-氟-4’-叠氮核苷具有如下结构：包括核苷式i及其磷酸酯类前药、医药上可接受的盐或其组合物；可选地，其组合物包括核苷抑制剂、非核苷类反转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、整合酶抑制剂和/或医药上可接受的辅料。化合物i的制备采用cn2007101375480所述方法或根据文献方法(j.wuetaleuopeanj.med.chem,2013,63,739)。为实现本发明目的，本发明使用微量热泳动仪测量核苷式i化合物(cl002)与vif-cbfb(1-170)-elonginb-elonginc蛋白质复合物之间的相互作用情况。使用染料标记蛋白复合物并梯度稀释化合物后，计算其亲和力大小，发现cl-002与vif复合物之间有显著的亲和力，其kd值约为57.5μm。分别转染hek293t细胞和hela-apobec3g细胞并用化合物cl-002处理，发现化合物cl-002抑制vif对apobec3g(a3g)的降解，并且cl-002对vif降解a3g的抑制作用具有剂量依赖性。a3g体外泛素化实验也说明cl-002在体外也具有一定的抑制vif对a3g的泛素化的活性，并且具有剂量依赖性。核苷式i化合物可以与其它hiv抑制剂联用，可选地，但不限于下列：所述其它hiv抑制剂包括：核苷抑制剂、非核苷类反转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、整合酶抑制剂；比如：可选地，所述核苷抑制剂包括：齐多夫定(azt)、去羟肌苷(ddi)、扎西他滨(ddc)、司他夫定(d4t)、拉米夫定(3tc)、阿巴卡韦(abacavir)、恩曲他滨(ftc)、替诺福韦(tdf)，efda(mk-8591)；可选地，所述非核苷类反转录酶抑制剂包括：奈韦拉平、地拉韦定、依非韦仑、依曲韦仑；可选地，所述蛋白酶抑制剂包括：沙奎那韦、茚地那韦、利托那韦、奈非那韦、氨普那韦、洛匹那韦、阿扎那韦、福沙普利那韦、替拉那韦、大诺那韦；可选地，所述整合酶抑制剂包括：雷特格韦、埃替拉韦、度鲁特韦。结果表明：本发明提供的核苷式i化合物及其前药或其医药上可接受的盐或其组合物可以作为抑制病毒感染因子蛋白的治疗药物。尤其是作为抑制对azt，tenofovir,3ct和ftc耐药的hiv病毒株的治疗药物。除非另外定义，否则本文所用的所有化学术语都采用所属领域技术人员所了解的它们的一般含义。“医药学上可接受的盐”包括本申请提供的化合物的任何盐，它保留所述化合物的生物学性质并且无毒或不在其它方面是医药用途所不希望的，例如钠盐、钾盐、铵盐等。本发明所述“前药”是指当投予生物系统时由于自发的化学反应、酶催化反应和/或代谢过程或任一者的组合而产生生物学活性化合物的任何化合物。标准的前药是使用连接到例如-oh、-nh2等官能团、与药物缔合并在体内裂解的基团形成。前药的例子包括酯等，优选磷酸酯。能够与本发明核苷i形成“酯”的化合物包括各种有机酸，如乙酸与3’-oh可形成乙酸酯，丙酸与3’-oh可形成丙酸酯。在本发明中描述的前药是例示性的，但不是限制性的，并且所属领域的技术人员可以制备其它已知种类的前药。本发明所述磷酸酯选单磷酸酯基团、二磷酸酯基团、三磷酸酯基团，结构分别如下所示本发明优点：所述核苷式i化合物(cl002)具有非常好的vif蛋白抑制作用，对现有艾滋病治疗药物(如azt，tenofovir,3tc，ftc和整合酶抑制剂度鲁特韦等)的耐药hiv病毒株也有显著的抑制作用，是治疗艾滋病的一个新选择。附图说明图1为转染hek293t细胞并用本发明化合物cl-002处理后的电泳结果：发现化合物cl-002抑制vif对apobec3g的降解(见中间一排黑点)，并且cl-002对vif降解apobec3g的抑制作用具有剂量依赖性。图2为转染hela-apobec3g细胞并用本发明化合物cl-002处理的电泳结果：发现化合物cl-002抑制vif对apobec3g的降解(见中间一排黑点)，并且cl-002对vif降解apobec3g的抑制作用具有剂量依赖性。图3为apobec3g体外泛素化实验的电泳结果：说明本发明化合物cl-002在体外也具有一定的抑制vif对apobec3g的泛素化的活性，并且具有剂量依赖性。图4为使用微量热泳动仪测量本发明化合物cl-002与vif-cbfb(1-170)-elonginb-elonginc蛋白质复合物之间的相互作用情况；使用染料标记蛋白复合物并梯度稀释化合物后计算其亲和力大小，发现cl-002与vif复合物之间有显著的亲和力，其kd值约为57.5μm。具体实施方式以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于示例性地对本发明进行说明，并不用于限制本发明。实施例1、化合物cl-002的制备：cl-002根据文献方法制备(j.wuetaleuopeanj.med.chem,2013,63,739)。实施例2、抗病毒活性的测定材料和方法2.1鉴定cl-002细胞水平的作用：1)第一天铺hek293t或者hela-apobec3g细胞(12孔板)。2)第二天用lipofactamin2000转染：hek293t细胞：(pcdna3-flag-apobec3g：1.7μg/孔)hela-apobec3g细胞：3)转染后4小时，换培养基(dmem+10％fbs)同时加入化合物cl-002，cl-002浓度梯度：0μm，50μm，100μm，200μm(如上面表格所示)。4)转染后48小时收细胞，westernblot检测。2.2体外泛素化实验：将体外纯化的蛋白：vife3(vif/cbfβ/elobc/cul5/rbx2)复合物，ube1，ubch5b，ub和apobec3g在存在atp的条件下与cl-002在室温反应1.5小时后用westernblot检测。2.3微量热泳动实验使用monolithnt.115热泳动仪检测cl-002与纯化的蛋白质复合物vif-cbfb(1-170)-elonginb-elonginc之间的亲和力。第一步先用nt-647-nhs荧光染料标记蛋白质复合物，其浓度固定为1um。cl-002的浓度按照2倍梯度稀释为5000um到153nm之间。第二步把荧光染料标记的vif-cbfb(1-170)-elonginb-elonginc蛋白复合物与稀释好的cl-002室温混合15分钟，这一步骤中所使用的缓冲液成分为20mmtrisph7.5和100mmnacl。第三步，在24℃条件下选取疏水性毛细管进行测定，测定过程中使用参数20％ledpower和40％mstpower。最后数据分析使用仪器自带软件nanotemperanalysissoftware。2.4结果本发明化合物cl-002抑制hiv-1及抑制hiv-1耐药株的活性见表1和表2。表1.核苷i式化合物(cl-002)抑制hiv-1的活性化合物ec50本发明化合物i(cl-002)0.01nm表2.核苷i式化合物(cl002)抑制hiv-1耐药株的活性*ec50是抑制病毒50％所需要的药物浓度，ec90是抑制病毒90％所需的药物浓度；hiv-174v：核苷类逆转录酶抑制剂ddi/ddc耐药株；hiv-1l10r/m46i/l63p/v82t/i84v：为蛋白酶抑制剂耐药株；pnl4-3gp41(36g)v38a/42t：融合抑制剂t-20耐药株。表1结果表明，本发明化合物i因可以通过抑制vif而使其具有极强的抑制hiv-1的活性。表2结果表明，本发明化合物i对耐药性hiv-1病毒株的抑制作用十分显著。图1为转染hek293t细胞并用本发明化合物cl-002处理后的电泳结果：发现化合物cl-002抑制vif对apobec3g的降解(见中间一排黑点)，并且cl-002对vif降解apobec3g的抑制作用具有剂量依赖性。图2为转染hela-apobec3g细胞并用本发明化合物cl-002处理的电泳结果：发现化合物cl-002抑制vif对apobec3g的降解(见中间一排黑点)，并且cl-002对vif降解apobec3g的抑制作用具有剂量依赖性。图3为apobec3g体外泛素化实验的电泳结果：说明本发明化合物cl-002在体外也具有一定的抑制vif对apobec3g的泛素化的活性，并且具有剂量依赖性。图4为使用微量热泳动仪测量本发明化合物cl-002与vif-cbfb(1-170)-elonginb-elonginc蛋白质复合物之间的相互作用情况；使用染料标记蛋白复合物并梯度稀释化合物后计算其亲和力大小，发现cl-002与vif复合物之间有显著的亲和力，其kd值约为57.5μm。本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。当前第1页12